Method Article

완전히 가공된 재조합 KRAS4b: 판자및 메틸화 단백질을 분리하고 특성화

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전조는 말초 막 결합 단백질에 대한 중요한 변형입니다. 곤충 세포는 단백질 단백질과 단백질 지질 상호 작용의 생물 물리학 측정을 가능하게 하는 양으로 farnesylated 및 carboxymethylated KRAS4b를 생성하기 위하여 조작될 수 있습니다

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 prenylation는 세포내 막에 단백질을 표적으로 하는 책임 있는 중요한 수정입니다. 인간 암의 22%에서 돌연변이되는 KRAS4b는 C-종단에 'CAAX' 박스 모티프가 존재하기 때문에 패네실화와 카르복시메틸화에 의해 처리됩니다. 엔지니어링 된 바쿨로 바이러스 시스템은 곤충 세포에서 farnesylated 및 카르복시 메틸화 KRAS4b를 발현하는 데 사용되었으며 이전에 설명되었습니다. 여기서, 우리는 단백질의 상세하고 실용적인 정제 및 생화학적 특성을 설명합니다. 구체적으로, 친화성 및 이온 교환 크로마토그래피는 균질성으로 단백질을 정제하는 데 사용되었다. 손상되지 않은 네이티브 질량 분석법은 KRAS4b의 올바른 변형을 검증하고 뉴클레오티드 결합을 검증하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 피네시레이트 및 카르복시메틸화된 KRAS4b의 막 체내를 리포솜으로 표면 플라스몬 공명 분광법을 사용하여 측정하였다.

Introduction

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번역 후 변형은 단백질의 기능적 활성을 정의하는 데 중요한 역할을 합니다. 인산화 및 당화와 같은 변형은 잘 확립됩니다. 지질 수정은 덜 잘 특징입니다, 그러나. 모든 세포 단백질의 0.5%가1. 전조는 CAAX 모티프2를함유하는 수용자 단백질로 15탄소 파네실 또는 20탄소 제라닐라닐 지질 사슬을 전달하는 것입니다. 조기 노화3,알츠하이머4,심장 기능 장애5,중증 혈증6,암7을포함한 여러 인간 질병의 진행에 전산 단백질이 연루되어 있다. 작은 GTPases, HRAS, NRAS 및 KRAS1,핵 라미닌, 및 키네토초레 CENP-E 및 F는 기초 조건 하에서 farnesylated 단백질입니다. 다른 작은 GTPas, 즉 로아, 로C, Rac1, cdc-42 및 RRAS는 제라냐게니라니어8,반면 로브는 farnesylated 또는 제라뉴어니어9 .

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Protocol

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1. 단백질 정제

  1. 표 1과같이 버퍼 A-H를 준비합니다.
버퍼 솔루션버퍼링 에이전트(전체 20mM) pH 나클 (mM)이미다졸 (mM)MgCl2 TCEP
A.헤페스 (주)는7.3300-51
B헤페스 (주)는7.3300
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Results

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프로토콜에서 가장 큰 변수 중 하나는 발현된 표적 단백질의 양(His6-MBP-tev-KRAS4b)이다. 이 프로토콜은 트리코플러스니아 ni 세포주, Tni-FNL17로부터분리된 것을 이용하여 개발되었으며, 현탁액 성장에 적합하고 혈청으로부터 제거되었다. 바쿨로바이러스 발현 시스템을 통해 다양한 곤충 세포주전반에 걸쳐 보고된 광범위한 결과를 감안할 때, 적어도 초기에는 KRAS4b-FMe를 생산하기 위해 Tni-FNL을 사용하는 것이 바람직하다.

~65 kDa로 이동하는 어두운 단백질은 용출 분획뿐만 아니라 정제 된 용해물에서도 명백해야합니다(도 1A). 융합 단백질은 ~48 kDa에서 comigrates 공동 표현된 FNTA/B인 다른 것과 함께 용해에서 2개의 가장 눈에 띄는 염색된 밴드 중 하나이어야 합니다.

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Discussion

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대표 결과 섹션에서 언급한 바와 같이, 정제 시 가장 중요한 단계는 낮은 염분에 있는 시간 동안 시료의 취급이다. 시료가 200mM 미만NaCl에 노출되는 시간을 제한하면 강수량을 줄이고 샘플 수율을 높일 수 있습니다. 프로파일이 예상과 일치하지 않는 경우 CEX의 결과를 해석하기 어려울 수 있습니다(그림 2참조). 프로토콜이 일상화될 때까지, 앞으로 이동되지 않는 CEX 용출 분획은 적절한 물질이 앞으로 취해졌는지 확인하기 위해 손상되지 않은 질량 분석이 완료될 때까지 -80°C에서 보관하는 것이 좋습니다. CEX 단계에 대해 위에서 언급한 매개 변수 를 벗어나면 프로토콜은 용해 및 IMAC 단계에서 비교적 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한 프로토콜에 크기 배제 크로마토그래피(SEX) 분리 단계가 없다는 점도 주목할 필요가 있다. 이것은 초기 방법 개발 (게시되지 않은 결과) 동안 관찰 한 손실로 인해 생략됩니다. 단백질이 나노 디스크와 복잡 할 때 이러한 손실이 관찰되지 않.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 카리사 그로스, 젠 멜할코, 맷 드류의 복제 및 발현 지원을 암 연구를 위한 프레드릭 국립 연구소의 단백질 발현 실험실에서 인정합니다. 이 프로젝트는 계약 번호에 따라 국립 암 연구소, 국립 보건원에서 연방 기금의 전체 또는 일부를 지원되었습니다. HHSN261200800001E. 이 출판물의 내용은 반드시 보건 복지부의 견해 나 정책을 반영하지 않으며, 미국 정부의 승인을 의미하지 는 않으며, 상품, 상업 제품 또는 조직에 대한 언급은 없습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 mL Safe-Lock Tubes, 천연Eppendorf22363204
11 mm Cl SS 연동 인서트 자동시료주입기 바이알Thermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)AVANTI극성 지질액체 스톡으로 구매
극성 지질840034클로로포름
5427R 원심분리기에펜도르프
아세토니트릴, HPLC 등급피셔 케미컬A998-1 1L
암모늄 아세테이시그마-알드리치09689-250g
아르곤 가스에어가스ARUP
분석 플레이트 384코닝3544
Biacore T200 기기GE 헬스케어
블루 스냅잇 씰, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson 초음파 수조Thermo Fisher15-336-1000
양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 컬럼GE 헬스케어 생명 과학29018183HiPrep SP Sepharose 고성능
CHAPS시그마C3023
Dyna Pro 플레이트 리더Wyatt Technologies
Exactive Plus EMR 질량 분석기Thermo Scientific
포름산Sigma-AldrichF0507-500Ml시약 등급 이상
사용 Gilson 바이알 7x14mm 튜브GE HealthcareBR-1002-12
PTFE 폼 라이너가 있는 유리 나사산 바이알Scientific SpecialitiesB69302
고속/탁상형 원심분리기Thermo Fischer Scientific05-112-114D4,000xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) 프로테아제Addgene92414Purified as according according to Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. 에서: Burgess-Brown N. (eds) E.coli의 이종 유전자 발현. 분자 생물학의 방법, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) columnGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
In-house Water Supply, Arium AdvanceSartorius StedimResistivity of 18 MΩ 홀더
가 있는 0cm 지질 압출기 세트AVANTI POLAR LIPIDS
액체 질소에어가스NI-DEWAR
M110-EH 미세유체역학미세유체역학
MabPac RP UHPLC 컬럼, 4um, 3.0 x 50mm, Thermo Scientific
MabPac SEC-1 컬럼, 5μm, 300 Å, 2.1 x 150mmThermo Scientific088790
MagTran 소프트웨어Thermo Scientific
메탄올, HPLC 등급VWR 화학 물질BDH20864.400
NGC 크로마토그래피 시스템BioRad78880002NGC QuestTM 100 크로마토그래피 시스템
프로테아제 억제제 칵테일 EDTA 또는 기타 킬레이터가 없는Millipore SigmaP8849
고무 캡 유형 3GE HealthcareBR-1005-02
시리즈 S 센서 칩 L1GE Healthcare29104993
분광 광도계Thermo Fischer Scientific13-400-519280nm
Ultra-15 원심 필터 장치에서 흡수, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008PES 멤브레인
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 원심분리기 필터AmiconUFC501024
초원심분리기Beckman CoulterOptima -100,000xg
Vanquish UHPLC(펌프, 컬럼 하터 및 LC 시스템)Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
물, HPLC 등급Sigma-Aldrich270733-1L자체 수원 사용 가능(아래 참조)
Whatman GD/XP PES 0.45mm 주사기 필터 GE 헬스케어 - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientific단백질체학 소프트웨어
850457 클로로포름 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포-L-세린(POPS)의 , 트 최대 , 610023 , , , 088645 가 가능한 L80KThermo

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.

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KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

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