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방법 논문

완전히 가공된 재조합 KRAS4b: 판자및 메틸화 단백질을 분리하고 특성화

5.7K 조회수

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DOI:

10.3791/60703

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2020년 1월 16일

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1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

이 논문에서

요약

전조는 말초 막 결합 단백질에 대한 중요한 변형입니다. 곤충 세포는 단백질 단백질과 단백질 지질 상호 작용의 생물 물리학 측정을 가능하게 하는 양으로 farnesylated 및 carboxymethylated KRAS4b를 생성하기 위하여 조작될 수 있습니다

초록

단백질 prenylation는 세포내 막에 단백질을 표적으로 하는 책임 있는 중요한 수정입니다. 인간 암의 22%에서 돌연변이되는 KRAS4b는 C-종단에 'CAAX' 박스 모티프가 존재하기 때문에 패네실화와 카르복시메틸화에 의해 처리됩니다. 엔지니어링 된 바쿨로 바이러스 시스템은 곤충 세포에서 farnesylated 및 카르복시 메틸화 KRAS4b를 발현하는 데 사용되었으며 이전에 설명되었습니다. 여기서, 우리는 단백질의 상세하고 실용적인 정제 및 생화학적 특성을 설명합니다. 구체적으로, 친화성 및 이온 교환 크로마토그래피는 균질성으로 단백질을 정제하는 데 사용되었다. 손상되지 않은 네이티브 질량 분석법은 KRAS4b의 올바른 변형을 검증하고 뉴클레오티드 결합을 검증하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 피네시레이트 및 카르복시메틸화된 KRAS4b의 막 체내를 리포솜으로 표면 플라스몬 공명 분광법을 사용하여 측정하였다.

서론

번역 후 변형은 단백질의 기능적 활성을 정의하는 데 중요한 역할을 합니다. 인산화 및 당화와 같은 변형은 잘 확립됩니다. 지질 수정은 덜 잘 특징입니다, 그러나. 모든 세포 단백질의 0.5%가1. 전조는 CAAX 모티프2를함유하는 수용자 단백질로 15탄소 파네실 또는 20탄소 제라닐라닐 지질 사슬을 전달하는 것입니다. 조기 노화3,알츠하이머4,심장 기능 장애5,중증 혈증6,암7을포함한 여러 인간 질병의 진행에 전산 단백질이 연루되어 있다. 작은 GTPases, HRAS, NRAS 및 KRAS1,핵 라미닌, 및 키네토초레 CENP-E 및 F는 기초 조건 하에서 farnesylated 단백질입니다. 다른 작은 GTPas, 즉 로아, 로C, Rac1, cdc-42 및 RRAS는 제라냐게니라니어8,반면 로브는 farnesylated 또는 제라뉴어니어9 .

작은 GTPase KRAS4b분자 스위치로 기능, 본질적으로 세포 내 성장 인자 신호 세포 성장 및 확산을 자극 하는 세포 내 신호 전달 경로 전송, 여러 단백질-단백질 상호 작용을 통해. KRAS4b 생화학의 활동에 필수적인 두 가지 주요 측면이 있습니다. 첫째, 단백질은 비활성 GDP와 활성 GTP 경계 상태 사이의 주기로 이펙터와 적극적으로 관여합니다. 둘째, C 말단 폴리리신 영역과 원거리 및 카르복시스테인이 단백질을 혈장 막으로 유도하여 하류 이펙터의 모집 및 활성화를 가능하게 한다. 돌연변이 KRAS4b는 췌장, 대장암 및 폐암10의내인성 동인이며, 이와 같이 치료적 개입은 엄청난 임상적 이점을 가질 것이다. 원거리 및 카르복시메틸화된 본성 변형 재조합 단백질의 생산은 리포좀 또는 지질나노디스크(11,12)와같은 막 대리체와 조합하여 KRAS4b를 이용한 생화학적 스크리닝을 가능하게 할 것이다.

파네실 트랜스퍼라제(FNT)는 KRAS4b의 CAAX 모티프에서 C 말단 시스테인에 파네실 파이로포스페이트를 첨가하는 촉매제. prenylation 후, 단백질은 Ras 변환 효소 (RCE1)가 3개의 C 말단 잔기를 절단하는 안구 성 망막 (ER)으로 인신매매됩니다. 처리의 마지막 단계는 ER 막 단백질에 의한 새로운 C 말단 파네실시스테인 잔기의 메틸화, 이소프렌시스테인 카르복실 메틸트랜스퍼라제(ICMT)이다. 대장균에서 재조합KRAS4b의 발현은 변형되지 않은 단백질의 생산을 초래한다. 이전에는 처리된 KRAS4b를 생산하려는 시도가 구조적 또는 약물 스크리닝 실험에 대한 수율이 부족하여 제한되었거나 네이티브 전체 길이 성숙단백질(13,14)을재량화하지 못했다. 여기에 제시된 프로토콜은 세포 배양의 5 mg/L의 수율에서 고도로 정제되고 완전히 처리된 KRAS4b를 생성하는 엔지니어링된 바쿨로바이러스 기반 곤충 세포 발현 시스템 및 정제 방법을 이용한다.

신중한 단백질 특성화는 구조 생물학 또는 약물 스크리닝 연구에 착수하기 전에 재조합 단백질의 품질을 검증하는 데 필수적입니다. 완전히 처리된 KRAS4b의 두 가지 주요 파라미터는 막 대용품 또는 지질과의 상호 작용을 위한 올바른 프레닐 변형 및 카르복시내화 C-종단(FMe)의 가용성검증이다. KRAS4b-FMe의 전기 분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)은 분자량을 측정하고 파네실 및 카르복시메틸 변형의 존재를 확인하기 위해 사용되었다. 시료가 비분폐 용매로 분무되는 네이티브 질량 분석법은 KRAS4b-FMe가 GDP 보조 인자에 묶여 있음을 입증하는 데 사용되었습니다. 마지막으로, 표면 플라스몬 공명 분광법은 고정된 리포솜을 이용한 KRAS4b-FMe의 직접 결합을 측정하는데 사용되었다.

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프로토콜

1. 단백질 정제

  1. 표 1과같이 버퍼 A-H를 준비합니다.
버퍼 솔루션버퍼링 에이전트(전체 20mM) pH 나클 (mM)이미다졸 (mM)MgCl2 TCEP
A.헤페스 (주)는7.3300-51
B헤페스 (주)는7.33003551
C헤페스 (주)는7.330050051
DMes6.0200-51
전자Mes6.0--51
FMes6.0100-51
GMes6.01000-51
H헤페스 (주)는7.3300-11
  1. 정제 물질 준비 (재료 표참조): EDTA 또는 다른 킬레이터없이 프로테아제 억제제 칵테일; 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 컬럼; 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 컬럼; 0.45 μm 주사기 필터; 2 M 이미다졸 (pH = 7.5); 100,000 x g의수퍼 센트리 퓨지; 4,000 x g의고속 벤치탑 원심분리기; 원심 필터 장치 (10 KDa NMWL); 280 nm에서 판독 할 수있는 분광광도계; 그의6 담배 에칭 바이러스 (TEV) 프로테아제; 두 개의 버퍼 솔루션을 혼합하고, 컬럼에 솔루션을 적용하고, 컬럼에서 그라데이션 용출을 생성하고, 컬럼에서 분획을 수집할 수 있는 크로마토그래피 계측.
  2. ~2 L의 곤충 세포 배양으로부터 세포를 해동하여 이전에 -80°C에서 보관하거나 갓 수확한 세포를 사용한다. Tni.FNL 곤충 세포주 및 발현 프로토콜에 대한 자세한 내용은 질레트 외 201915를 참조하십시오. 공기를 도입하거나 거품을 생성하지 않고 1:200 v/v 프로테아제 억제제가 첨가된 버퍼 A 200 mL로 세포를 조심스럽게 다시 일시 중단합니다.
    참고: 1.3단계 및 후속 단계(명시된 경우 제외)는 실온(~22°C)에서 수행해야 합니다. 다음 단계에서 완전한 포염을 허용하기 위해 샘플이 균일해야 합니다.
  3. 2회 또는 동등한 용해 시스템에서 7,000 psi의 미세 유체라이저에 있는 라이즈 세포 펠릿. lysis의 다른 방법은 탐구 되지 않았습니다.
  4. 곤충 세포 를 명확히 하는 것은 필터를 막는 화합물의 존재 때문에 문제가 됩니다. 따라서, 초원심분리(4°C에서 30분 동안 100,000 x g)는 매우 중요하다. 상류체의 표면에 흰색 지질 잔류물은 피해야하며 면봉을 사용하여 제거하거나 줄일 수 있습니다. 0.45 μm PES 필터를 통해 탈칸화 된 상급체를 걸. 정제된 시료를 즉시 사용하거나 -80°C에 보관하십시오.
    참고: 잔류 물은 빠르게 필터를 차단하며 많은 필터가 필요할 수 있습니다. 이 물질의 양을 줄이지 않으면 후속 단계에서 높은 컬럼 배압을 유발합니다.
  5. 정제된 용해물의 부피를 결정하고 2M imidazole 스톡을 첨가하여 샘플을 35 mM imidazole로 조정합니다. 3mL/min에서 샘플을 20mL IMAC 컬럼(HisPrep FF 16/10 열)에 버퍼 B에서 미리 보정된 3개의 열 볼륨(CV)에 로드합니다.
  6. 표적 단백질은 전형적으로 컬럼에 정량적으로 흡착되지만, 후속 분석을 위해 컬럼 흐름을 수집하는 것이 가장 좋습니다. Abs280이 20 mL (1 CV)에 대해 3 mL / min에서 버퍼 B로 꾸준한 기준선 (<100 밀리부흡수 단위 [mAU])에 도달 할 때까지 열을 씻은 다음 세척 단계의 나머지 부분에 대해 ~ 3 cv에서 4 mL / min로 씻어 내십시오. 일반적으로 기준선 흡광도를 달성하기 위해 버퍼 B의 60-80 mL이 필요합니다.
  7. 8 mL 분획을 수집하는 동안 버퍼 B에서 버퍼 C로 400 mL (20 CV) 구배를 가진 단백질을 용해. 전형적으로, 표적 단백질은 그라데이션의 상반부에서 용성된다(도1A;모든 후발분분이 도시되지 않음).
  8. SDS-PAGE/쿠마시 염색을 사용하여 단백질 분획을 분석합니다. 피크 분획을 풀링하고 4°C에서 2L의 버퍼 D에 대해 하룻밤 동안 풀을 투석한다.
    참고: 낮은 pH는 다음 단계에서 단백질 결합을 보장하는 데 중요합니다. 그러나, 이러한 투석 동안 pH 변화는 천천히 발생하며, 이것은 하룻밤 배양에 편리한 단계이다. 대체 버퍼 교환 전략(예를 들어, pH 변화를 가속화하기 위한 더 높은 버퍼 농도)은 조사되지 않았다. 단백질은 낮은 pH에서 시간이 지남에 따라 천천히 침전하기 시작하고 낮은 소금 농도와 강수량의 소량은이 단계 동안 정상입니다. 이 때문에 투석 중에 다음 컬럼에 바인딩하는 데 필요한 버퍼를 100 mM NaCl로 교환하지 않습니다. 오히려, 200 mM의 NaCl 농도는 투석에 사용되며 단백질은 컬럼에 적용하기 직전에 100 mM (아래 참조)로 희석됩니다. 우리는 이 강수량이 KRAS4b에 특정인 경우에 조사하지 않았습니다, 그러나 침전을 하는 단백질은 KRAS4b-FMe로 확인되었습니다. 이러한 이유로, 우리는 결합 완충제 내의 표적 단백질의 안정성이 결정될 때까지 임의의 관심 있는 단백질에 대해 투석 완충액에서 더 높은 NaCl 농도를 사용하는 것이 좋습니다.
  9. 투석과 원심분리기에서 샘플을 4,000 x g에서 10분 동안 제거하여 침전지를 제거합니다. 이 시점에서 최종 투석, 명확히 된 샘플은 여전히 흐릿하지만 후속 CEX 열에 추가 처리하지 않고 적용 할 수 있습니다.
  10. 버퍼 G의 CV 3개로 세척한 다음 버퍼 F의CV 3개로 세척하여 20mL 양이온 교환 열(재료 표 참조)을 준비합니다.
    참고 : 우리는 꼼꼼하게 다른 수지 평가하지 않은 동안, 여러 동료는 SP 세파 로즈 고성능 수지 이외의 수지와 가난한 해상도를 발견했다.
  11. 투석된 시료의 20 mL을 완충액 E 20 mL를 첨가하여 최종 NaCl 농도 100 mM에 희석하고 희석된 샘플을 양이온 교환 컬럼에 도포한다.
  12. 이전 희석이 부하의 끝에 가까워지면서 상기와 같이 준비된 갓 희석된 샘플을 하중 튜브에 추가하여 컬럼을 계속 로드합니다.
    참고: 전체 시료를 한 번에 100 mM NaCl으로 희석하면 침전으로 인한 표적 단백질이 크게 손실되었습니다.
  13. 버퍼 F를 사용하여 컬럼을 기준선 Abs280으로 세척합니다. 일반적으로 3개의 CV가 필요합니다. 단백질은 완충F로부터 65% 완충G까지 400 mL(20 CV) 구배 동안 컬럼으로부터 용출되고, 6 mL 분획으로 수집된다(도1B).
  14. 그라데이션이 완료되면 추가 1.5 CV (65 % 버퍼 G)에 대한 열을 계속 세척합니다. SDS-PAGE/Coomassie 청색 얼룩 분석 및 크로마토그램의 UV 흔적 검사를 모두 기반으로 양극분수를 선택합니다.
    참고: UV 추적에는 일반적으로 5개의 피크가 포함됩니다. 낮은 소금 농도에서 시작, 초기 피크는 일반적으로 처리 되지 않은 및/또는 proteolyzed 단백질. 제2 및 제3 피크는 두 가지 형태의 가공 단백질의 혼합물이다: 제2 피크는 주로 farnesylated 중간체 (FARN), 반면 세 번째는 주로 관심있는 완전히 가공된 FMe 단백질이다. 피크 4 및 5는 His6-MBP-KRAS4b 융합 단백질을 나타냅니다 (모든 단백질은 이 시점에서 이 형식에 있으며, TEV 소화가 발생하지 않았습니다). 이들은 N-종단에서 N-아세틸화되지 않으며 C-종단에서 farnesylated (피크 4) 및 원거리 및 카르복시메틸화 (피크 5)입니다. 피크 2 및 피크 4는 태그 제거 후 동일한 단백질을 생성할 것이기 때문에(즉, KRAS4b-FARN) 원하는 경우 이들 단계에서 풀화될 수 있다. 유사하게, 피크 3 및 피크 5는 KRAS4b-FMe의 단일 로트를 생성하기 위해 결합될 수있다(도 1B, 도 2). 그러나, 이 풀링은 별도의 피크에서 단백질의 성질이 확인된 경우에만 수행되는 것이 좋습니다.
  15. His6-TEV 프로테아제(~200 μg의 프로테아제/mL 샘플)로 1.15단계에서 풀린 단백질을 소화합니다.
    참고 : 우리는 Addgene(https://www.addgene.org/92414)에서사용할 수있는 플라스미드 및 프로토콜을 사용하여 His6-TEV 프로테아제합니다. 완충A(10 kDa MWCO 투석 튜브에 대해 TEV 다이제스트를 시료의 mL당 최소 40 mL의 버퍼 A)에 대해 실온에서 2시간 동안 투석한 다음 4°C에서 하룻밤 동안 투석을 한다.
  16. 소화와 투석 후, 단백질을 완충A와 3 mL/min의 20 mL IMAC 컬럼에 직접 적재하십시오.
    참고: 표적 단백질은 컬럼에 대한 친화력이 낮지만 수지에 완전히 구속되지 않을 수 있기 때문에 이 전체 크로마토그래피 동안 7 mL 분획을 수집합니다. 총 3개의 CV또는 기준선 흡광도에 도달할 때까지 버퍼 A로 컬럼을 3mL/min으로 세척합니다.
  17. 표적 단백질은 완충액 C의 5 CV 구이션으로 0%-10%로 용출되어 7 mL 분획을 수집합니다. 예방 조치로서, 추가의 결합 된 단백질은 100 % 버퍼 C. 양성 분획으로 용출 될 수있다 SDS-PAGE에 의해 분석 후 확인(그림 1C). 전형적으로, 표적 단백질은 낮은 이미다졸 농도(즉, 0%-10% 완충C 구배)에서 용성되지만, 때때로 유동통과 또는 컬럼 세척에서 용해된다.
  18. 완충H. 280 nm에서 분광광도법에 의한 단백질 농도를 결정한다.
    참고: 이 계산에 사용할 소멸 계수를 결정할 때 뉴클레오티드의 존재를 고려해야 합니다.
  19. 단백질은 상당한 단백질 손실 없이 원심 필터 유닛(10 K NMWL)을 사용하여 ~2-5 mg/mL로 농축될 수 있다. 0.22 μM 주사기 필터로 여과하십시오. A280에서 용액 흡광도를 측정하여 최종 단백질 농도를 계산합니다(도1D). 액체 질소에 aliquots를 스냅하고 -80 °C에서 냉동 샘플을 저장합니다.
    참고: 정제된 단백질은 GDP에 묶여 있습니다. KRAS4b-FMe는 이전에 게시된 프로토콜16을사용하여 GppNHp로 교환할 수 있습니다.

2. 손상되지 않은 질량 분석 및 네이티브 질량 분석을 위한 시료 준비

  1. 손상되지 않은 질량 분석을 위한 시료 준비
    1. 분석 전에 얼음에 단백질 샘플을 해동. 온전한 질량 분석을 위해, 단백질을 20 mM 암모늄 중탄산염에서 0.1 mg/mL로 희석한다(pH = ~8.4). 네이티브 질량 분석을 위해, 50 mM 암모늄 아세테이트 (pH = ~ 7.5)에서 0.1 mg / mL의 농도로 단백질을 희석하십시오. 5-10 s에 대 한 각 샘플을 소용돌이, 다음 원심 분리기 12,500 x g에 대 한 1 분 용액에 어떤 고체 물질을 펠 릿. 각 상급물의 10-20 μL을 제거하고 유리 자동 샘플러 바이알로 옮김. 오염이나 증발을 방지하기 위해 각 바이알을 단단히 덮습니다.
      참고: 손상되지 않은 질량 분석 또는 네이티브 질량 분석의 경우, 샘플은 최종 희석 버퍼로 버퍼 교환하기 위해 10 kDa MWCO 셀룰로오스 멤브레인 필터를 사용하여 분석하기 전에 탈염될 수 있습니다.
  2. 질량 분석을 위한 확장 질량 범위(EMR) 질량 분광법의 준비
    참고: 질량 분석계에서 분석을 실행하기 전에 최근에 보정되었는지 확인하십시오. 또한 유해한 화학 물질을 피하고 시료와 용매를 오염시키는 것을 피하기 위해 필요한 경우 항상 장갑 및 기타 개인 보호 장비를 착용하십시오. 캘리브레이션은 상업적으로 얻어진 교정 솔루션과 2 mg/mL 세슘 요오드화 용액을 사용하여 수행됩니다.
    1. 분석 소프트웨어를 열고 적절한 계측기 방법 파일을 로드합니다. KRAS4b 단백질의 손상되지 않은 질량 분석의 경우, 적합한 시작 파라미터는 다음과 같습니다: 양성 검출 모드; 세 개의 마이크로스캔, 해상도 = 70,000; AGC 대상 = 3e6; 최대 통합 시간 = 200 ms; 및 스캔 범위 = 70-1,800 질량 대 충전 비율(m/z). KRAS4b 단백질의 네이티브 질량 분석의 경우, 적합한 시작 파라미터는 다음과 같습니다: 검출의 양성 모드; 10 마이크로 스캔, 해상도 = 17,500; 인소스 충돌 유발 해리(CID) = 20 eV; AGC 대상 = 3e6; 충돌 에너지 (CE) = 20; 최대 통합 시간 = 200 ms; 및 스캔 범위 = 500-10,000 m/z.
  3. 크로마토그래피 용매 및 컬럼의 제조
    1. 손상되지 않은 질량 해석에 필요한 용매를 준비합니다. 용매 A는 0.1 % 포르믹 산을 가진 물입니다. 용매 B는 80 % 아세토니트릴 과 0.1 % 포르믹 산물입니다.
    2. 네이티브 질량 해석에 필요한 용매를 준비합니다. 용매 A는 물에 0.1 M 암모늄 아세테이트이고 용매 B는 물입니다.
    3. 적절한 용매가 준비된 후, 튜브가 적절한 용매로 채워지고 모든 기포가 라인에서 제거되도록 시스템을 제거합니다.
    4. 적절한 열(손상되지 않은 질량 해석을 위한 역위상 열 및 네이티브 질량 해석을 위한 크기 제외 열)을 설치합니다. 온전한 질량 해석의 경우 유량은 0.5 mL/min이고 컬럼 온도(컬럼 히터 사용)는 50°C입니다. 열의 균형을 15-20분 동안 보정합니다. 네이티브 질량 분석의 경우 유량은 0.25 mL/min입니다.
      참고: 항상 열 배압을 모니터링하여 상한이상으로 상승하지 않도록 하여 막힌 선이 나거나 열 행렬이 손상되었음을 나타낼 수 있습니다. 필요한 경우 열을 바꿉습니다.
  4. 샘플 분석
    1. 유리 자동 샘플러 바이알에 준비된 단백질 샘플을 LC 시스템 자동 샘플러의 적절한 바이알 랙에 넣습니다. 원하는 분석에 적합한 계측기 방법을 사용하여 소프트웨어 프로그램에서 샘플 목록을 만듭니다. 샘플 목록이 완료되면 재생 버튼을 클릭하여 분석을 시작합니다.
    2. 이월이 존재하지 않도록 각 시료 전후에 물을 비워 분석당 1-2 μL의 시료를 주입합니다.
      참고: 손상되지 않은 질량 해석은 기본 질량 분석과 매우 다르며 매우 다른 계측기 방법 설정이 필요합니다. 이는 온전한 질량 분석으로 단백질이 유기 용매의 존재 에서 "완화"되어 더 많은 전하를 수용 할 수 있기 때문입니다. 충전 상태의 동위원소 분포를 더 쉽게 해결하고 있습니다. 네이티브 질량 분석은 단백질 이온의 좁은 전하 분포를 제공하며, 단백질에 기초하여 다른 전압 및 충돌 에너지 설정이 필요합니다.
  5. 데이터 분석 및 단백질 감소
    1. 샘플의 스펙트럼을 단백질의 손상되지 않은 질량(또는 기본 질량)을 표시하는 탈복잡 스펙트럼으로 변환할 수 있는 소프트웨어로 내보냅니다. 온전한 질량은 충전된 스펙트럼 피크의 높은 풍부로 인해 동위원소 피크 분포를 갖습니다. 네이티브 질량은 일반적으로 충전된 스펙트럼 피크의 낮은 풍부성으로 인해 거의 피크를 갖지않습니다(그림 3D).
    2. 피크 d의 질량 대 전하 비(m/z) 범위를 확장하여 측정된 질량이 예측 질량과 일치하는지 확인합니다. 때때로, 단백질에 전하의 첨가로 인해, 예상 분자량(MW)과 관찰된 MW 사이에 약간의 차이가 있을 수 있다. 또한 많은 질량 분석 분석과 마찬가지로 나트륨과 같은 아덕트는 신중하게 탈염된 시료를 사용하여도 데이터에 추가 피크가 나타나는 데 기여할 수 있습니다. m/z가 예상보다 낮은 낮은 풍부한 피크가 때때로 관찰됩니다. 이는 이온화 과정으로 인한 기능군의 손실인 중립적 손실 때문일 가능성이 높습니다.
      참고: 예상대로, 그대로 질량과 네이티브 질량 피크 사이에 차이가 있을 것입니다. 그대로 질량 디스플레이는 단백질의 예상 MW를 보여줍니다. 부착된 뉴클레오티드 또는 다른 변형의 추가 MW를 갖지 않을 것이다. 그러나, 네이티브 질량 피크는 임의의 첨가된 뉴클레오티드를 가진 단백질을 보여줄 것이다.

3. 리포솜에 구속하는 KRAS4b-FMe의 검증

  1. 막 리포좀 준비
    1. 20 mM HEPES (pH = 7.3), 150 mM NaCl 및 1 mM TCEP로 구성된 버퍼를 준비합니다.
    2. 리포좀 제제 물질은 클로로포름내의 25 mM 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린(POPC) 및 10 mM 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포-L-세린(POPS) 주식을 포함한다; 홀더 및 가열 블록이 있는 지질 압출기 세트; 아르곤 가스 및 액체 질소; 초음파 목욕; PTFE 폼 라이너와 유리 나사 나사 바이알; 동적 광 산란 감지가 가능한 플레이트 리더.
    3. 30 분 동안 실온에서 클로로포름에 지질 주식을 해동. 5 mM70:30 POPC의 1 mL을 준비 : 25 mM POPC (주식)의 106 μL과 10 mM POPS (주식)의 118 μL을 유리 바이알에 aliquoting에 의해 POPS 리포솜을 준비합니다.
      참고 : 클로로 포름이 특정 플라스틱 팁을 용해 시킬 수 있으므로 플라스틱 팁으로 지질을 알리액하지 마십시오.
    4. 아르곤 가스의 꾸준한 흐름에서 건조 지질. 아르곤 가스를 도포할 때 유리병을 천천히 회전하여 건조 필름의 얇은 층을 형성한다.
    5. 과잉 클로로포름을 제거하기 위해 밤새 진공 동구화 아래에 샘플을 놓습니다.
    6. 건조된 막에 1 mL의 완충을 첨가하여 지질을 재구성하고 혼합물을 5분 동안 소용돌이치며 25°C에서 1시간 동안 흔들어 지질 혼합물을 수화시킨다.
      참고 : 샘플은 지질의 건조 필름 층에 버퍼를 추가하면 매우 혼탁할 것입니다.
    7. 얼음물(4°C 이하)과 따뜻한 수조(25°C 이상) 사이에 시료 바이알을 번갈아 가며 5회 동결/해동 주기를 수행합니다.
    8. 샘플 바이알을 초음파 욕조에 넣고 약 0.5 시간 동안 또는 샘플이 반투명해질 때까지 샘플을 초음파 처리합니다.
    9. 지질 압출기 세트를 사용하여 샘플을 돌출시시고 있습니다. 제조업체의 지침에 표시된 대로 압출 키트를 조립합니다. 0.1 μm 필터 용지를 사용하여 샘플을 돌출시시고 있습니다. 샘플을 하나의 유리 주사기에 로드하고 압출 장치의 한쪽 끝에 부착합니다. 압출 장치의 다른 쪽 끝에 빈 주사기를 추가합니다. 샘플이 완전히 투명해질 때까지 앞뒤로 10-20배 밀어 넣습니다.
    10. 20,000 x g에서 30분 동안 최종 샘플을 회전하여 큰 응집체를 제거합니다.
    11. 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 리포좀의 크기와 균질성을 결정합니다(선택 사항). 30 μL의 리포솜을 384 웰 플레이트 리더에 넣습니다. 플레이트를 1,000 x g에서 30분 동안 회전시고 플레이트를 플레이트 판독기에 넣고 10개의 광 산란 측정값을 수집합니다.
  2. 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해 리포좀에 결합하는 KRAS4b-FMe 특성
    1. 필요한 재료를 조립 : SPR 악기; 센서 칩 L1; 7 x 14 mm 바이알 튜브; 및 CHAPS.
    2. 20 mM HEPES (pH = 7.3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP를 포함하는 버퍼를 준비한다. 총 부피 200 μL(총 10개)에서 60 μM-0.06 μM에서 KRAS4b-FMe의 2:1 희석 시리즈를 준비합니다. 최종 희석된 샘플을 바이알 튜브(재료 표참조)로 옮기고 바이알 튜브를 랙에 넣고 샘플을 SPR 기기에 삽입합니다.
    3. L1 센서 칩을 SPR 기기에 삽입합니다. 버퍼를 연결하고 7분 동안 버퍼로 시스템을 프라이밍합니다.
    4. 다음과 같이 자동화된 메서드를 설정합니다.
      1. 기기 온도를 25°C로 설정합니다.
      2. 30 μL/min 유량으로 물에 용해된 20mM CHAPS의 1분 주사 2개로 센서 칩 L1을 헹구어 센서 칩 L1을 활성화합니다.
      3. 칩 표면에 수분을 공급하기 위해 실행 버퍼의 10분 주사의 시동 주기를 수행합니다.
        1. 리포솜을 5 μL/min에서 2분 주사로 L1 칩의 유량 셀(FC)-2에 주입하여 리포솜을 센서 칩 L1에 증착합니다.
          참고: 적절한 캡처 레벨을 달성할 때까지 주입 시간을 늘립니다.
      4. FC-1과 FC-2에 3사이클의 버퍼를 30 μL/min에서 1분 주사하여 주입합니다.
        1. 다양한 KRAS4b-FMe 적정을 가장 낮은 농도 계열에서 가장 높은 농도 시리즈로 주입합니다. 두 FC에 걸쳐 30 μL/min 유량에서 해리 단계에 대해 협회 상에 1분 주사와 2분 주사를 사용하여 단백질을 주입합니다.
        2. 센서 칩 L1을 30 μL/min에서 20 mM CHAPS의 2 개의 1 분 주사로 헹구어 재생합니다.
    5. 단일 사이트 바인딩 모델을 사용하여 SPR 평가 소프트웨어를 사용하여 데이터를 맞춤화하여 명백한 바인딩 선호도를 얻습니다(데이터 피팅에 대한 설명은 토론 섹션 참조).

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결과

프로토콜에서 가장 큰 변수 중 하나는 발현된 표적 단백질의 양(His6-MBP-tev-KRAS4b)이다. 이 프로토콜은 트리코플러스니아 ni 세포주, Tni-FNL17로부터분리된 것을 이용하여 개발되었으며, 현탁액 성장에 적합하고 혈청으로부터 제거되었다. 바쿨로바이러스 발현 시스템을 통해 다양한 곤충 세포주전반에 걸쳐 보고된 광범위한 결과를 감안할 때, 적어도 초기에는 KRAS4b-FMe를 생산하기 위해 Tni-FNL을 사용하는 것이 바람직하다.

~65 kDa로 이동하는 어두운 단백질은 용출 분획뿐만 아니라 정제 된 용해물에서도 명백해야합니다(도 1A). 융합 단백질은 ~48 kDa에서 comigrates 공동 표현된 FNTA/B인 다른 것과 함께 용해에서 2개의 가장 눈에 띄는 염색된 밴드 중 하나이어야 합니다.

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토론

대표 결과 섹션에서 언급한 바와 같이, 정제 시 가장 중요한 단계는 낮은 염분에 있는 시간 동안 시료의 취급이다. 시료가 200mM 미만NaCl에 노출되는 시간을 제한하면 강수량을 줄이고 샘플 수율을 높일 수 있습니다. 프로파일이 예상과 일치하지 않는 경우 CEX의 결과를 해석하기 어려울 수 있습니다(그림 2참조). 프로토콜이 일상화될 때까지, 앞으로 이동되지 않는 CEX 용출 분획은 적절한 물질이 앞으로 취해졌는지 확인하기 위해 손상되지 않은 질량 분석이 완료될 때까지 -80°C에서 보관하는 것이 좋습니다. CEX 단계에 대해 위에서 언급한 매개 변수 를 벗어나면 프로토콜은 용해 및 IMAC 단계에서 비교적 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한 프로토콜에 크기 배제 크로마토그래피(SEX) 분리 단계가 없다는 점도 주목할 필요가 있다. 이것은 초기 방법 개발 (게시되지 않은 결과) 동안 관찰 한 손실로 인해 생략됩니다. 단백질이 나노 디스크와 복잡 할 때 이러한 손실이 관찰되지 않...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

우리는 카리사 그로스, 젠 멜할코, 맷 드류의 복제 및 발현 지원을 암 연구를 위한 프레드릭 국립 연구소의 단백질 발현 실험실에서 인정합니다. 이 프로젝트는 계약 번호에 따라 국립 암 연구소, 국립 보건원에서 연방 기금의 전체 또는 일부를 지원되었습니다. HHSN261200800001E. 이 출판물의 내용은 반드시 보건 복지부의 견해 나 정책을 반영하지 않으며, 미국 정부의 승인을 의미하지 는 않으며, 상품, 상업 제품 또는 조직에 대한 언급은 없습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.8 mL Safe-Lock Tubes, 천연Eppendorf22363204
11 mm Cl SS 연동 인서트 자동시료주입기 바이알Thermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)AVANTI극성 지질액체 스톡으로 구매
극성 지질840034클로로포름
5427R 원심분리기에펜도르프
아세토니트릴, HPLC 등급피셔 케미컬A998-1 1L
암모늄 아세테이시그마-알드리치09689-250g
아르곤 가스에어가스ARUP
분석 플레이트 384코닝3544
Biacore T200 기기GE 헬스케어
블루 스냅잇 씰, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson 초음파 수조Thermo Fisher15-336-1000
양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 컬럼GE 헬스케어 생명 과학29018183HiPrep SP Sepharose 고성능
CHAPS시그마C3023
Dyna Pro 플레이트 리더Wyatt Technologies
Exactive Plus EMR 질량 분석기Thermo Scientific
포름산Sigma-AldrichF0507-500Ml시약 등급 이상
사용 Gilson 바이알 7x14mm 튜브GE HealthcareBR-1002-12
PTFE 폼 라이너가 있는 유리 나사산 바이알Scientific SpecialitiesB69302
고속/탁상형 원심분리기Thermo Fischer Scientific05-112-114D4,000xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) 프로테아제Addgene92414Purified as according according to Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. 에서: Burgess-Brown N. (eds) E.coli의 이종 유전자 발현. 분자 생물학의 방법, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) columnGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
In-house Water Supply, Arium AdvanceSartorius StedimResistivity of 18 MΩ 홀더
가 있는 0cm 지질 압출기 세트AVANTI POLAR LIPIDS
액체 질소에어가스NI-DEWAR
M110-EH 미세유체역학미세유체역학
MabPac RP UHPLC 컬럼, 4um, 3.0 x 50mm, Thermo Scientific
MabPac SEC-1 컬럼, 5μm, 300 Å, 2.1 x 150mmThermo Scientific088790
MagTran 소프트웨어Thermo Scientific
메탄올, HPLC 등급VWR 화학 물질BDH20864.400
NGC 크로마토그래피 시스템BioRad78880002NGC QuestTM 100 크로마토그래피 시스템
프로테아제 억제제 칵테일 EDTA 또는 기타 킬레이터가 없는Millipore SigmaP8849
고무 캡 유형 3GE HealthcareBR-1005-02
시리즈 S 센서 칩 L1GE Healthcare29104993
분광 광도계Thermo Fischer Scientific13-400-519280nm
Ultra-15 원심 필터 장치에서 흡수, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008PES 멤브레인
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 원심분리기 필터AmiconUFC501024
초원심분리기Beckman CoulterOptima -100,000xg
Vanquish UHPLC(펌프, 컬럼 하터 및 LC 시스템)Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
물, HPLC 등급Sigma-Aldrich270733-1L자체 수원 사용 가능(아래 참조)
Whatman GD/XP PES 0.45mm 주사기 필터 GE 헬스케어 - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientific단백질체학 소프트웨어
850457 클로로포름 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포-L-세린(POPS)의 , 트 최대 , 610023 , , , 088645 가 가능한 L80KThermo

참고문헌

  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
  3. Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
  4. Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
  5. Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
  6. Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758(2013).
  7. Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
  8. Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
  9. Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
  10. Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
  11. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
  12. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).
  13. Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
  14. Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
  15. Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
  16. Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
  17. Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79(2019).
  18. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
  19. Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
  20. Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
  21. Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
  22. Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
  23. Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).

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