Method Article

면역형광 및 정량적 PCR에 의한 화이트플라이 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화

DOI:

10.3791/60731

⸱

February 8th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In This Article

Summary

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우리는 곤충 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화를 위한 면역형광 및 정량적 PCR 방법을 기술한다. 면역형광 프로토콜은 바이러스 및 벡터 단백질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 정량적 PCR 프로토콜은 전체 화이트플라이 바디 및 바이러스 감염 식물에서 바이러스를 정량화하기 위해 확장될 수 있다.

Abstract

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베고모바이러스(베고모바이러스,가족 쌍둥이자리)는 베미시아 타바치 복합체의 흰파리에 의해 지속적이고 순환적인 방식으로 전달된다. 전 세계적으로 작물 생산에 베고모 바이러스로 인한 광범위한 손상을 고려, 베고모 바이러스와 그들의 흰 파리 벡터 사이의 상호 작용을 이해하는 것이 필수적이다. 이렇게 하려면 벡터 조직에서 바이러스의 국소화 및 정량화가 중요합니다. 여기서, 예를 들어 토마토 노란 잎 컬 바이러스(TYLCV)를 사용하여, 우리는 면역형광에 의한 백딧지, 1차 타액선 및 난소에서 베고모바이러스를 국소화하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 바이러스 코트 단백질, 염료 표지 이차 항체 및 공초점 현미경에 대한 특정 항체의 사용에 기초한다. 프로토콜은 또한 베고모바이러스 및 흰플라이 단백질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 우리는 또한 양적 PCR (qPCR)에 의하여 흰살 파리 중두, 1 차 적인 타액 선, 헤모 림프 및 난소에 있는 TYLCV의 정량화를 위한 프로토콜을 기술합니다. TYLCV를 위해 특별히 설계된 프라이머를 사용하여 정량화를 위한 프로토콜은 화이트플라이의 상이한 조직에서 TYLCV의 양을 비교하는 것을 허용한다. 기재된 프로토콜은 화이트플라이 및 바이러스에 감염된 식물의 체내에서 베고모바이러스의 정량화에 잠재적으로 유용하다. 이 프로토콜은 화이트플라이에서 베고모바이러스의 순환 경로를 분석하거나 화이트플라이-베고모바이러스 상호작용을 연구하는 다른 방법에 대한 보완으로 사용될 수 있다.

Introduction

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지난 수십 년 동안, 베고모바이러스(Begomovirus, 가족 쌍둥이자리)는전 세계적으로 많은 채소, 섬유질 및 장식용 작물의 생산에 심각한 손상을 입혔습니다1. 베고모바이러스는 35종 이상을 포함하는 복합종인 흰파리 베미시아 타바치(Hemiptera: Aleyrodidae)에 의해 지속적으로전달된다. 베고모바이러스는 백딧항 4, 장수4,호스트 선호도5,6과 같은 백딧물 생리학 및 행동에 직간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 주어진 베고모바이러스 종/균주의 투과 효율은 동일한 실험조건7,8,9,10하에서도다른 흰동비 비밀 종에 대해 다양하며, 이는 베고모바이러스와 흰파리 사....

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Protocol

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1. 화이트 플라이, 바이러스, 식물, 바이러스의 취득

  1. 면에 있는 후방 흰살파리(MEAM1)는 26±1°C에서 온실에서 곤충 방지 케이지에서 14:10의 빛:암주기 및 60±10% 상대 습도에 있는 곤충 방지 케이지에 있다.
  2. 백두미토콘드리아 시토크롬 산화아제 I 유전자에 기초한 종래의 PCR을 수행하여 백파리 집단의 순도를 결정한다.
    1. 20 마리의 성인 흰파리를 수집하고 30 μL의 라시스 버퍼를 함유 한 PCR 튜브로 개별적으로 옮김 (10 mM Tris, pH = 8.4, 50 mM KCl, 0.45% [wt/vol] 트웬-20, 0.2% [wt/vol] 젤라틴, 0.45% [vol/vol] 노니데트 P 40, 60 g/mL 프로틴라제 K).
    2. 각 PCR 튜브에 5-7 개의 세라믹 비드 (직경 2mm)를 넣고 샘플을 분쇄하여 조직 분해를 수행합니다.
    3. 모든 샘플을 65°C에서 1시간 동안 배양한 다음 100°C에서 10분 간 인큐베이션한 다음 원심분리기를 간략하게 배양합니다. PCR 증폭을 위한 템플릿으로 이 상급자를 사용하십시오.
      참고: 필요한 경우 65°C에서 의 배양 시간을 늘릴 수 있습니다.
    4. 다음과 같이 PCR 반응을 준비합니다: Taq DNA 폴리머라제 1....

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Results

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B. 타바치 복합체 및 TYLCV의 MEAM1 흰파리는 절차를 설명하기 위해 여기에 예로 사용되었다. 본 원고에 기재된 면역형광 및 바이러스 정량화 절차의 개요는 도 1에나타내고 있다. 도 2는 PSGs, midguts 및 난소에서 TYLCV 및 DAPI 염색의 면역 형광 검출의 대표적인 결과를 나타내며, TYLCV가 PSG 및 midguts에서 더 많이 축적되고 난소에서 덜 축적되었음을 나타낸다. 도 3은 TYLCV에 감염된 토마토에 24, 48, 및 72h를 공급한 후 흰파리 PSGs, midguts, hemolymph 및 난소에서 의 바이러스의 상대적 양을 나타내며, 획득 액세스 기간의 증가와 함께 상이한 백색파리 조직에서 바이러스의 양이 증가했음을 나타낸다.

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Discussion

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여기서 우리는 면역형광 및 qPCR에 의한 백비행 벡터의 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화를 위한 프로토콜을 기술한다. 해부는 흰파리 조직에서 바이러스를 현지화하고 정량화하는 첫 번째 단계를 나타냅니다. 화이트플라이 몸체는 길이가 약 1mm이며, 이는 조직이 매우 작으며 해부하기가 어렵습니다. 게다가, 조직 사이 강한 연결이 있습니다. 예를 들면, 난소는 박테리오시테와 단단히 연결되어 있어 격리하기가 어렵습니다. 여기에서, 다른 조직의 특성 그리고 위치를 고려하여, 우리는 해부에 대한 다른 접근법을 기술한다. 그러나 이러한 조직을 신속하고 정확하게 해부하려면 많은 연습이 필요합니다. 또한 죽은 곤충은 해부의 어려움을 증가시킬 수 있기 때문에 신선한 흰 파리를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 또한, 후 분부, 조직은 오염을 방지하기 위해 청소해야합니다.

면역 형광 기술은 특정 항체의 사용에 기초한다. 항체의 높은 농도가 신호 대 배경 비율을 감소시키고 낮은 농도가 충분한 신.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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이 작품은 국가 주요 연구 개발 프로그램 (보조금 번호 : 2017YFD0200600), 중국 농업 연구 시스템 (보조금 번호 : CARS-23-D07) 및 빌 & 멜린다 게이츠 재단 (투자 ID OPP1149777)에 의해 지원되었습니다. ). TYLCV CP 항체를 제공한 지안샹 우 교수님께 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% 파라포름알데히드MultiSciencesF0001
4',6-디아미디노-2-phé 닐린돌(DAPI)Abcamab104139
소 혈청 알부민(BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템Bio-RAD185-5201
컨포칼 현미경 ZeissLSM800
Dylight 549-goat anti-mouseEarthoxE032310-022차 항체
단클론 항체 항체 (MAb 1C4)Primary 항체
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
Stereomicroscope ZeissStemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
ThermocyclerThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI 생명 과학9002-93-1
Tween 20BBI 생명 과학9005-64-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).

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Begomovirus LocalizationWhitefly Tissue DissectionImmunofluorescence ProtocolQuantitative PCRConfocal MicroscopyTYLCV DetectionStromal Vascular FractionHemolymph CollectionPrimary Salivary GlandsVirus Quantification

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