방법 논문

전기 자극에 의한 쥐에 급성 폰틴 경색 의 설립

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DOI:

10.3791/60783

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2020년 8월 27일

 ,  ,  ,  , 
1The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

이 논문에서

요약

여기에 제시된 것은 단일 펄스로 전기 자극을 통해 쥐 모델에서 급성 pontine 경색을 확립하기 위한 프로토콜이다.

초록

Pontine 경색은 후방 순환에서 가장 흔한 뇌졸중 하위 형이며, 퐁틴 경색을 모방한 설치류 모델이 부족합니다. 여기에 급성 pontine 경색의 쥐 모델을 성공적으로 확립하기위한 프로토콜이 제공됩니다. 약 250g의 쥐가 사용되고, 절연 칼집이 있는 프로브는 스테레오탁스 장치를 사용하여 폰에 주입된다. 병변은 단일 펄스로 전기 자극에 의해 생성됩니다. Longa 점수, 베르더슨 점수 및 빔 밸런스 테스트는 신경 학적 적자를 평가하는 데 사용됩니다. 또한, 접착제 제거 소종 감각 시험은 감각 운동 기능을 결정하는 데 사용되며, 사지 배치 테스트는 프로리오셉션을 평가하는 데 사용된다. MRI 검사는 생체 내경을 평가하는 데 사용되며, TTC 염색은 시험관내 경색을 확인하는 데 사용된다. 여기서, 성공적인 경색은 로스트랄 폰의 전방 기초에 있는 것을 확인한다. 결론적으로, 급성 폰틴 경색 쥐 모델을 확립하는 새로운 방법이 설명된다.

서론

1980년대 부터 실리콘 필라멘트에 의해 유도된 중대뇌 동맥 폐색(MCAO) 모델은 기본 뇌졸중 연구1에서널리 사용되고 있다. 다른 방법(즉, MCA2 및 광화학적으로 유도된 초점 경색의 한 가지의 봉합)도 사용되어 왔다. 이 모형은 MCA 기지를 둔 치기 모형이라고 불려지고 크게 근본적인 치기 및 잠재적인 치료치료의 병리학 적인 기계장치의 조사에 기여했습니다. 이러한 실험모델3,,4의한계가 있지만, 이러한 방법은 많은 실험실5,,6을사용하였다. MCA 기반 스트로크 모델은 전방 순환에서 스트로크를 나타냅니다. 그러나, 몇몇 보고는 후방 순환7에서치기를 모방하는 모형을 조사했습니다.

병인학, 메커니즘, 임상 증상 및 전방 및 후방 순환 뇌졸중 사이의 예후8사이에는 유의한 차이가 있다. 따라서 전방 순환 스트로크 모델에서 파생된 결과는 후방 순환 스트로크에 적용할 수 없습니다. 예를 들어, 전방 순환을 위한 재관류 시간 창이 6h로 연장되었으며, 영상 연구 결과에 기초하여 24h로 확장되는 연구의 작은 부분이9. 그러나, 후방 순환을 위한 시간 창은 이전 보고10 및 우리 자신의 임상 경험에 따르면, 24 시간 이상일 지도 모릅니다. 이 긴 재관류 시간 창은 실험 모델에서 더 연구되고 확인되어야합니다.

후방 순환 스트로크에 관해서는, pontine 경색은 가장 일반적인 하위 형이며, 모든 허혈성 뇌졸중 사례11,,12의7 %를 차지합니다. 경색 지형에 따르면, pontine 경색은 고립되고 비 격리된 퐁틴경색(13)으로나뉩니다. 고립 된 pontine 경색은 근본적인 기계장치에 근거를 둔 3개의 모형으로 분류됩니다: 큰 동맥 질병 (LAD), 바실라 동맥 분기 질병 (BABD), 및 작은 동맥 질병 (SAD). 폰틴 경색의 메커니즘, 표현 및 예후에 대한 지식은14건의임상 조사에서 파생되었다. 그러나, pontine 경색을 모방 설치류 모델은 덜 조사되었습니다.

이전 연구에서는 폰과 관련된 확산 뇌간 테그멘텀 손상이7을탐구했습니다. 한 그룹은 바실라 동맥(BA)15의결찰을 통해 퐁틴 경색 모델을 만들려고 시도했다. 또 다른 그룹은 10-0 나일론 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 근위 BA의 4점을 선택적으로16으로선택적으로 리게이트하였다. 이 모델은 LAD를 모방하지만 대부분의 pontine 경색은 BABD와 SAD에서 발생합니다. 또한, BA의 선택적 결찰은 복잡한 수술이며 사망률이 높다.

여기에 제공 전기 자극에 의해 급성 pontine 경색의 수행하기 쉽고, 쉽게 재현하고, 성공적인 쥐 모델에 대한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 AAALACi가 인증한 기관인 광저우 의과 대학 제2부속 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 쥐는 남부 의과 대학의 동물 센터에 의해 제공되었다.

1. 동물

  1. 250 ± 10g의 성인 남성 스프라그-Dawley 쥐를 사용하십시오.
  2. 수송시, 25°C의 주변 온도, 65%,12h/12h 의 빛/암사이클의 대조되는 환경 조건 하에서 수술 전 적어도 1주일 동안 쥐를 보관하십시오.
  3. 음식과 물 광고 리비툼을제공합니다.

2. 폰에 경색의 설립

  1. 수술 전에 쥐를 계량하고 아래에 설명된 행동 테스트에 따라 신경 학적 성능을 평가하십시오 (섹션 3).
  2. 마취 직전에 가열 패드를 예열합니다.
  3. 스테레오탁프레임의 홀더에 두개골 드릴을 부착합니다.
  4. 인트라피톤으로 쥐를 주입 50 mg/kg 케타민과 5 mg/kg 자일라진. 발가락 핀치 응답의 부족을 확인합니다.
  5. 쥐를 입체 프레임에 장착하여 경향이 있는 위치에 놓습니다. 이어바를 외이도 위에 배치하여 머리를 고정합니다. 두개골이 주사의 왜곡을 피하기 위해 수평으로 유지되는지 확인하십시오.
  6. 입구와 콘센트 포트를 가진 쥐를 위한 입체 코 콘 부착을 통해 이소플루란(100% 산소, 2.5% 이소플루란)에 의한 마취를 유지한다. 가열 패드를 사용하여 37 °C에서 온도를 유지하고 절차 전반에 걸쳐 온도를 모니터링합니다.
  7. 각막 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 사용합니다. 집게를 사용하여 발을 약간 꼬집어 통증 반응이 없는지 확인합니다.
  8. 미세 면도기로 두개골의 머리카락을 면도합니다. 클로르헨시딘 수술 스크럽을 외과 절개 부위에서 시작하여 바깥쪽으로 회전하는 원형 방식으로 바르는다.
  9. 수술 마커 펜으로 표시되어야 하는 후방 폰타넬 뒤에 0.5 cm까지 양측 측면 캔투스의 선에서 메스가 있는 3cm 중간선 절개를 합니다.
  10. 면봉을 사용하여 혈액을 제거합니다.
  11. 두피를 노출하기 위해 피부 플랩의 양쪽에 놓인 수술 용 테이프 조각을 놓습니다(도1).
  12. 0.9% NaCl에 담근 면봉으로 두개골 뼈에서 결합 조직을 부드럽게 제거합니다. 제거하지 않으면 결합 조직이 훈련에 잡힙습니다.
  13. 브레그마를 식별합니다. 브레그마의 중심점을 원점으로 선택하고 미세한 검은색 수술 마커 펜을 사용하여 표시합니다.
  14. 6.0mm AP, 2.0mm ML(0.5~3.0mm, 그림 2A범위)에서 드릴을 놓습니다.
  15. 자동 드릴을 사용하여 두개골 절제술(직경 1mm)을 수행합니다. 이 지점은 정맥 부비동에 가깝기 때문에 신중하게 진행하십시오.
  16. 스테레오탁스 프레임에서 드릴을 제거합니다.
  17. 스테레오탁스프레임(그림 3A)에절연 된 칼집이있는 22 G 프로브를 놓습니다. 프로브의 끝은 칼집의 근위 끝 위에 2mm 를 배치해야합니다(그림 3A, B; 그림 2B).
  18. 칼집이 뇌 7mm(7mm DV, 도 2B)로들어가는지 확인한다. 그림 1C).
  19. 프로브의 끝이 뇌의 표면 아래 9mm(도 2D)가될 때까지 칼집(도 1D)을따라 프로브를 진행합니다.
  20. 전극을 전기 자극기(도3C)에연결합니다. 그림 1D와같이 양극을 프로브에 연결합니다. 음극을 쥐에 연결합니다 (일반적으로 쥐의 귀에).
  21. 전기 자극기켜 다음 매개 변수를 설정합니다: 단일 펄스 폭 = 4,050 ms; 전압 = 50 V; 및 현재 = 4 mA(그림 3C). 전기 자극 중에 쥐가 떨리는 것을 볼 수 있습니다. 이 연구에서는, 장치는 행동 시험, MRI 및 TTC에 사용되는 대조군 쥐를 위해 켜지지 않았습니다.
  22. 자극 후 프로브를 5분 동안 제자리에 둡니다.
  23. 뇌에서 프로브를 제거(도 1F).
  24. 뼈 시멘트를 사용하여 두개골 절제술을 덮습니다. 상처봉을 풀기 전에 시멘트가 건조하도록 하십시오.
  25. 4-0 폴리아미드 봉합사 필라멘트로 상처를 봉합합니다. 3~4개의 스티치 후 2-1-1 표준 수술 매듭을 묶습니다.
  26. 페니실린(0.25mL, 80 IU)을 감염 방지를 위해 인트라페니실린(0.25mL, 80 IU)을 인계하여 쥐를 주입한다.
  27. 2 mg/kg의 복용량에서 멜록시캠으로 쥐를 피하 주사한 다음 매 24 시간마다 반복하십시오.
  28. 완전히 깨어 날 때까지 15 분마다 쥐를 모니터링하고 가열 패드로 케이지에 반환합니다. 희생될 때까지 음식과 물을 무료로 이용할 수 있습니다.
    참고: 모든 절차는 무균 수술 원리를 따라야 합니다. 수술 전에, 손의 수술 스크럽 후 스크럽 상단, 수술 마스크와 멸균 장갑에 넣어. 멸균 장 내에서 멸균 봉합사 물질을 항상 유지합니다.

3. 행동 테스트

  1. 롱가 스코어17
    1. 쥐를 테이블 표면에 놓습니다.
    2. 다음과 같은 기록 점수: 0 = 신경학적 결핍 없음; 1 = 완전히 모순 포완을 확장하지 못함, 온화한 초점 신경학적 결핍; 2 = 좌측으로 순환, 중간 초점 신경학적 결핍; 3 = 왼쪽으로 떨어지고, 심각한 초점 적자; 4 = 자발적인 걷기와 우울한 수준의 의식.
  2. 베르더슨 점수18
    1. 꼬리에 쥐를 잡고 앞다리가 테이블을 위해 손을 뻗어 보자. 다음과 같이 점수를 기록 : 0 = 두 사지가 테이블에 도달; 1 = 단 하나의 사지가 테이블에 도달합니다.
    2. 동물을 거친 표면에 놓습니다. 다음과 같이 점수를 기록 : 0 = 밀어 때 좋은 저항과 거친 표면에 강한 손아귀; 1 = 한 발에서만 볼 수있는 약간의 저항; 2 = 한 방향으로 밀어 붙일 때 저항이 없습니다.
    3. 밀폐된 영역에 쥐를 놓고(18in × 36in)을 자유롭게 돌아다닐 수 있도록 합니다. 다음과 같이 점수를 기록 : 0 = 순환하지 않고 인클로저의 전체 길이를 걸어; 1 = 원형으로 인클로저의 전체 길이를 걷는다. 2 = 인클로저의 길이를 걸을 수 없지만 원을 그리를 수 있습니다. 3 = 많이 움직일 수 없습니다. 각 작업의 평가 점수 합계를 최종 평가 점수로 사용합니다.
  3. 밸런스 빔 테스트19
    1. 장치가 폭 3cm, 길이 70cm로 구성되어 있으며 바닥 위 20cm인지 확인하십시오. 좁은 진입로가 있는 빔의 맨 끝에 어두운 상자를 놓습니다.
    2. 빔의 시작 부분에 백색 잡음 발생기와 밝은 광원을 놓습니다. 소음과 빛은 쥐가 빔을 통과하고 골 상자에 들어가도록 동기를 부여하는 데 사용되었습니다.
    3. 동물이 어두워진 상자에 들어갈 때 자극을 종료합니다. 빔을 통과할 때 골 상자(초)에 도달하는 대기 시간을 기록하고 쥐의 뒷다리 성능을 기록합니다.
    4. 각 성능에 대한 점수를 다음과 같이 기록합니다: 0 = 꾸준한 자세로 밸런스; 1 = 빔의 측면을 파악; 2 = 포옹 빔과 1 사지빔에서 떨어진다; 3 = 포옹 빔과 두 개의 팔다리가 빔에서 떨어지거나 >60 s 후 빔에 회전; 4 = 빔에 균형을 시도하지만 후 떨어진다 >40 s; 5 = 빔에 균형을 시도하지만 후 떨어진다 >20 s; 및 6 = 떨어져, 균형 또는 후 빔에 매달려 시도하지 않습니다 <20 s.
  4. 접착제 제거 소마토 감각 테스트20
    1. 쥐를 투명한 플렉시글라스 상자에 넣고 2분 또는 3분 동안 새로운 환경을 탐색할 수 있도록 합니다.
    2. 엄지 손가락 위와 손목에 각 앞다리의 내부 표면에 10mm 직경의 녹색 접착제 라벨을 놓습니다.
    3. 쥐를 플렉시유리 상자에 반환합니다.
    4. 쥐가 첫 번째 레이블과 다른 모든 레이블을 각각 제거할 시간을 기록합니다. 최대 3분 동안 허용하십시오. 시험은 훈련에서 2배 진행되어야 합니다.
  5. 사지 배치 테스트
    1. 쥐를 수평 자세로 잡고 움직임을 방지합니다.
    2. 쥐가 테이블 표면(수동 사지 움직임)과의 접촉을 잃으면 테이블 가장자리가 있는 발에 촉각및 선전 자극을 가합니다.
    3. 테이블 가장자리에 발(성공 또는 실패)의 배치를 평가합니다.
    4. 다음과 같이 점수를 기록 : 0 = 배치 없음; 0.5 = 미완성 및/또는 지연배치; 1 = 즉각적이고 완전한 배치.

4. MRI에 의한 경미확인

  1. 수술 후 MRI 스캔 24h를 수행하십시오.
  2. 이소플루란에 의해 쥐를 마취 (유도에 대 한 5%, 유지 보수에 대 한 1%-1.5%)
  3. 쥐 뇌 어레이 코일에 쥐 머리를 고정하고 전송 전용 볼륨 코일과 결합.
  4. 코일과 쥐를 MRI 스캐너에 놓습니다. 치아와 이어 바를 사용하여 요람 내의 쥐를 고정하십시오.
  5. 폐쇄 회로 열 재킷을 사용하여 MRI 스캐닝 시술 동안 37 °C ± 0.5 °C에서 체온을 유지합니다.
  6. 파일럿 시퀀스를 사용하여 올바른 형상을 보장합니다.
  7. 빠른 스핀 에코 시퀀스를 사용하여 T2 가중치 스캔을 수집합니다: 에코 시간(TE) = 33ms; 반복 시간 (TR) = 8,000 ms; 시야 = 30mm x 30mm; 획득 매트릭스 = 512 × 512; 50 슬라이스; 두께 0.4 mm.
  8. 4샷 스핀 에코 평면 이미징 DWI 스캔 수집: 에코 시간 = 30.5 ms; 반복 시간 = 8000 ms; 매트릭스 = 96 × 96; 시야 = 25mm x 25mm; 세 방향 = x, y, z; B 값 = 0 1,000 s/mm2 및 1,000 s/mm2; 50 개의 연속 축 조각; 두께 0.4 mm.
  9. 쥐를 케이지로 돌려놓습니다.

5. TTC 염색에 의한 경미확인

  1. 실험 설계에 따라 시점에서 쥐를 희생한다. 이 실험에서, 우리는 수술 후 쥐를 24 시간 희생.
  2. 희생 전에 2% TTC 솔루션을 준비합니다. 10mL 0.01 M PBS(pH 7.4)에 0.2 g TTC 파우더를 추가합니다. 희석을 은종이로 덮인 10cm 접시에 옮기고 수조에서 37°C로 예온합니다.
  3. 쥐를 의식 상실할 때까지 5%의 이소플루란에 노출시한다. 이어서, 호흡이 멈출 때까지 쥐를 CO2(분당 케이지 의 부피의 20%-30%)에 노출시킨 다음 CO2 노출의 2분 유지를 유지한다.
  4. 사망을 확인하기 위해 다음과 같은 징후를 사용하여 가슴을 상승및 떨어지지 않고, 심장 박동이 없고, 점막이 좋지 않으며, 발가락 꼬집기, 색 변화 또는 눈의 불투명성에 대한 반응도 없습니다.
  5. 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
  6. 멸균 플랫폼에서 발을 테이핑하여 동물을 보호하십시오. 쇄골에서 저거삼소에 중간 절개를 만들고 흉곽을 따라 왼쪽으로 의 시포이드에서 측면 절개를 만듭니다. 흉곽과 흉부 중간 절개를 따라 다이어프램을 잘라 심장을 노출하십시오.
  7. 바늘(27G)의 끝을 좌심실의 4°C에서 0.01 M PBS를 함유한 관류 펌프에 연결한다.
    참고: 심실의 왼쪽 가장자리를 따라 팁을 진행하여 아트리움에 들어가지 않도록 합니다. 관류 펌프를 켜서 팁이 왼쪽 심실에 있는지 확인하고 오른쪽 아트리움을 잘라냅니다. 액체가 콧구멍에서 배출되면 팁은 아트리움에 있으며 조정하거나 다시 삽입해야합니다.
  8. 관류용 4°C에서 유지되는 0.01 M PBS의 약 100mL를 사용하십시오. 간이 하얗게 변할 때까지 관류 펌프를 끕니다.
  9. 쥐를 참수하고 가위와 집게를 사용하여 전체 뇌를 해부. 얼룩종이로 뇌 표면에서 물을 제거합니다.
  10. 뇌 전체를 -80°C에서 1분 동안 보관하십시오(뇌 섹션을 절단하는 것이 동결 후 더 쉽습니다).
    참고: 이 단계는 뇌 섹션을 동결 하지 않고 잘 절단 할 수 있는 경우 건너뛸 수 있습니다.
  11. 등쪽 면을 위로 놓는 매트릭스에 뇌를 넣습니다.
  12. 도 1G에 도시된 바와 같이 뇌 표면의 구멍을 식별하고 스테인레스 스틸 0.21 mm 두께의 블레이드를 삽입한다. 일반적으로, 경색의 가장 큰 영역은 프로브의 평면에; 따라서 이 지역에 하나의 블레이드를 삽입해야 합니다.
  13. 다른 블레이드를 2mm 간격으로 삽입합니다.
  14. 동시에 매트릭스에서 블레이드를 한 번에 제거하고 접시에 TTC 용액에 블레이드로 전체 뇌를 배치합니다. 블레이드를 조심스럽게 제거합니다.
    참고 : 여기에, 뇌 섹션은 쉽게 염기 cranii에 일부 잔류 피아 메이터 가 절개 방해하기 때문에 액체에서 제거되지 않았다. 매트릭스에 섹션이 남아 있으면 작은 주걱을 사용하여 접시로 옮기습니다.
  15. 37°C의 수조에 TTC 용액과 뇌 섹션으로 접시를 놓습니다.
  16. 5분마다 요리를 확인하고 섹션의 겹치지 않도록 하십시오.
  17. TTC 반응을 종료하기 위해 접시에 4 % 파라 포름 알데히드 용액의 10 mL을 추가합니다.
  18. 장밋빛에서 코달에 섹션을 방향을 지정하고 사진을 찍습니다.

6. 통계

  1. 통계 분석 소프트웨어(예: 그래프패드 프리즘)를 사용하여 학생의 tt-test를 수행합니다.
    참고: 모든 데이터는 평균 ±SE로 표현됩니다. 그룹 간의 차이는 두 t꼬리 학생의 t-test(p&05 통계적 유의로 정의)로 결정됩니다.

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결과

6마리의 동물은 위에서 설명한 수술 프로토콜을 적용하였다. 도 4에 도시된 대조군은 6마리의 쥐로 구성되었다. 도 4에 표시된 뇌 슬라이스는 그룹당 하나의 쥐로부터 유래하였다.

MRI 스캐닝은 경색이폰(도 4A)의기초에 위치한 것으로 나타났다. 프로브가 중간선 왼쪽에 2mm를 주입했기 때문에 경색은 측면으로 위치했다. 이러한 경색은 환자에서 전방 파틴 경색을 모방한다(도4A). 절연 칼집이 사용되었기 때문에 피질, 소뇌 및 중뇌(도4A)를포함하는 프로브의 끝 너머에 경색이 없었습니다. DWI 이미지는 또한 급성 폰틴 경색(도4A)을공개했다.

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토론

본 연구는 급성 폰틴 경색 쥐 모델을 생성하기 위한 프로토콜을 제공한다. 이 모델은 폰틴 뇌졸중 환자의 예후 및 재활 (뇌졸중 후 만성 통증 포함)에 대한 연구에 사용할 수 있습니다.

이 방법에는 몇 가지 강점이 있습니다. 첫째, 향후 연구를 위한 급성 폰틴 경색의 쥐 모델을 제공한다. 위에서 언급했듯이, pontine 경색은 덜 주의를 받은 일반적인 뇌졸중 하위 형입니다. 뇌졸중 연구의 주요 단점은 특정 pontine 경색 모델의 부족이었다. 둘째, BA15,,16의결찰에 의한 기존 퐁틴 경색 쥐 모델에 비해, 본 모델은 실험 설계에 따라 경색의 위치 및 부피를 변경하도록 조절될 수 있다. 예를 들어 여기서와 같이 펜의 표면에서 경색이 확장되도록 팁 길이를 변경할 수 있습니다.

대안적으로, 폰내의 라쿠나 경색은 프로브 팁의 ...

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공개 사항

이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 과학 재단(81471181 및 81870933)이 Y. Jiang과 중국 국립 과학 재단(81601011호), 장쑤성 자연과학 재단(No. BK20160345) J. 주와 광저우 시보건위원회(20191A011083)의 과학 프로그램을 Z. Qiu에 제출합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-0 suctureShanghai Jinzhong수술 기구
접착 테이프Shanghai Jinzhong수술 기구
동물 마취 시스템RWD
수술 기구
경화 클램프Shanghai JinzhongSurgical 시스템 사용 시 마스크 착용 기구
일반 조직 가위Shanghai Jinzhong수술 기구
IndoPhorsGuoyao 중국살균
IsofluraneRWD217181101
병변 제작 장치Shanghai Yuyan병변
MRI 시스템Bruker Biospin생체 내 경색 확인
바늘 홀더Shanghai Jinzhong수술 기구
중국의Guoyao감염 예방
프로브Anke일부 수정 필요
Q-tipsShanghai Jinzhong수술 기구
전단 가위Shanghai Jinzhong수술 기구
입체 택시 장치RWD
봉합 바늘상하이 Jinzhong수술 기구
조직 보유 셉트상하이 Jinzhong수술 기구
TTC시그마-알드리치BCBW5177체외 경색 확인을 위해
시스템 뼈 시멘트 Shanghai Jinzhong 제작 Penicilin

참고문헌

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