이 프로토콜은 그대로 살아있는 동물에서 중단없는 시간 경과 이미징의 10 시간 이상을 달성하기 위해 Drosophila 애벌레를 장착하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 애벌레 몸벽에 가까운 많은 생물학적 과정을 이미지화하는데 사용될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
살아있는 화상 진찰은 세포 생물학 질문을 조사하기 를 위한 귀중한 접근입니다. Drosophila 애벌레는 애벌레 바디 벽 및 대부분의 내부 기관이 투명하기 때문에 생체 내 살아있는 화상 진찰을 위해 특히 적당합니다. 그러나, 30분 이상 온전한 초파리 유충의 지속적인 실시간 영상촬영은 오랜 시간 동안 비침습적으로 고정화하기 어렵기 때문에 도전적이다. 여기에서 우리는 10 시간 이상 높은 시간 및 공간 해결책을 가진 살아있는 Drosophila 애벌레의 연속적인 화상 진찰을 허용하는 LarvaSPA에게 불린 애벌레 장착 방법을 제시합니다. 이 방법은 UV 반응성 접착제를 사용하여 커버 슬립에 유충을 부분적으로 부착하고 폴리디메틸실록산 (PDMS) 블록을 사용하여 애벌레 의 움직임을 추가로 억제하는 것을 포함합니다. 이 방법은 두 번째 instar에서 방황 세 번째 instar에 개발 단계에서 애벌레와 호환됩니다. 우리는 수상 돌기 성장 및 부상 유발 모수석 변성을 포함하여 Drosophila 체감각 뉴런의 동적 과정을 연구하는이 방법의 응용 프로그램을 보여줍니다. 이 방법은 또한 애벌레 바디 벽 의 가까이에 일어나는 많은 그밖 세포 프로세스를 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다.
서론
타임랩스 라이브 이미징은 동적 세포 과정을 연구하는 강력한 방법입니다. 타임랩스 영화에서 제공하는 공간적 및 시간적 정보는 세포 생물학 질문에 답하기 위한 중요한 세부 사항을 나타낼 수 있습니다. Drosophila 애벌레는 그것의 투명한 바디 벽이 내부 구조물의 비침범성 화상 진찰을 허용하기 때문에 살아있는 화상 진찰을 사용하여 조사를 위한 대중적인 생체 내모형이었습니다 1,2. 또한, 수많은 유전 도구는 형광 적으로 해부학 구조 및 거대 분자 를 라벨 에 Drosophila에서 사용할 수 있습니다3. 그러나, 초파리 유충의 장기 시간 경과 화상 진찰은 도전적입니다. 고정된 초기 태아 또는 pupae와는 달리, Drosophila 애벌레는 살아있는 화상 진찰을 위한 고정화를 필요로 하는 끊임없이 움직입니다. 살아있는 Drosophila 유충을 고정시키는 효과적인 방법은 클로로포름4를가진 할로카본 오일에 장착, 이소플루란 또는 디클로르보스 용액5를사용하여 마취하고, 커버슬립과 현미경....
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프로토콜
1. 이미징 챔버 만들기
- 금속 프레임은 일반적인 기계 공장의 알루미늄 블록으로 구성할 수 있습니다. 프레임의 사양은 그림 1A에나와 있습니다.
- 이미징 챔버를 구성하려면 긴 커버슬립(22mm x 50mm)과 UV접착제(그림 1A)를사용하여 금속 프레임의 바닥을 밀봉합니다. 핸드 헬드 UV 램프를 사용하여 UV 접착제를 경화.
2. PDMS 입방체 만들기
- PDMS 입방체에 대한 금형을 준비합니다.
- 직사각형(80mm x 55mm) 페트리 접시 또는 원형 셀 배양 판의 내부 표면에 포장 테이프 층을 부착합니다. 1층(두께 0.063 mm)을 제2 스타 애벌레에, 2층(두께 0.126mm)을 초기 3인성 애벌레에 사용하거나, 3층(두께 0.189mm)을 후반 3층 애벌레(그림1B)에사용한다.
- 면도날로 테이프를 특정 너비의 스트립으로 자르세요: 1층 테이프의 경우 1.5mm, 2층 또는 3층 테이프의 경우 2....
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결과
유충 이미징 챔버는 맞춤형 금속 프레임과 두 개의 커버슬립을 함께 접착하여 구성됩니다. 금속 프레임의 설계는 그림 1A에지정되어 있습니다. 챔버 내부의 초파리 유충은 UV 접착제 및 PDMS 입방체의 도움으로 상부 커버 슬립에 부착된다. PDMS 입방체 및 양면 테이프에 홈은 유충을 보유하는 공간을 만들기 위해 부착된다(도 1B,C). PDMS는 또한 애벌레 바디 벽을 평평하게 하고 애벌레 운동을 물리적으로 제한하기 위하여 온화한 압력을 가합니다. 마지막으로, 습식 렌즈 용지의 작은 조각은 수분을 제공하기 위해 챔버의 바닥에 배치됩니다. 이 설치는 연속적인 화상 진찰을 위해 10 시간 이상 동안 Drosophila 애벌레를 고정시킬 수 있습니다. 동물의 대부분은 10 시간 후에 살아 있고 pupal 단계로 성장하기 위하여 복구될 수 있습니다. 이미징 챔버는 한 번에 최대 9개의.......
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토론
여기에서 우리는 LarvaSPA, 장기 시간 경과 화상 진찰을 위한 살아있는 초파리 애벌레를 설치의 다재다능한 방법을 기술합니다. 이 방법은 유충을 복구하거나 재장착할 필요가 없기 때문에 중단 없는 이미징이 가능합니다. 따라서 모수석 변성 및 재생과 같이 완료하는 데 몇 시간이 걸리는 생물학적 과정을 추적하는 데 이상적입니다. 이 방법은 또한 화상 진찰 세포 내 칼슘 역학 및 microtubule 성장과 같은 세포내 사건을 위해 이용될 수 있습니다. 애벌레 몸벽이 이미징 중에 안정되기 때문에, 공간 및 시간적 해상도는 이미징 응용 프로그램에 맞게 조정할 수 있습니다(예: 빠른 세포내 소포 움직임을 추적하거나 뉴런 분기 패턴의 느린 글로벌 변화를 모니터링하기 위해). 또한,이 방법은 다양한 발달 단계에서 애벌레와 호환되며 특수 장비가 필요하지 않습니다. 따라서, 애벌레는 잠재적으로 다양 한 질문을 해결 하기 위해 많은 Drosophila 실험실에 의해 사용할 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 LarvaSPA 방법의 이전 버전을 설정 링펑 탕 감사합니다; 이미징 챔버의 초기 프로토 타입을 만들기위한 코넬 올린 홀 기계 가게에서 글렌 스완; 금속 프레임을 구성하고 PDMS 입방체 를 만들기에 대한 제안을 제공하기위한 필립 Isermann; 현미경에 접근을 위한 코넬 BRC 화상 진찰 시설 (NIH 교부금 S10OD018516에 의해 투자됨); 원고의 비판적 독서에 대한 마리아 사파르. 이 작품은 H.J.에게 수여 된 코넬 펠로우십에 의해 지원되었다; 코넬 스타트업 펀드와 NIH 보조금(R01NS099125 및 R21OD023824)은 C.H.H.J. 및 C.H.에게 수여되어 프로젝트를 구상하고 실험을 설계했습니다. H.J.는 실험을 수행하였다. H.J와 C.H.는 원고를 썼습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6061 알루미늄 바 | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M 양면 테이프 | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M 스카치 포장 테이프 | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| 유리 커버슬립 | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 공진장치 장착 스캐너 | |
| 렌즈 용지 | 버크셔 | LN90.0406.24 | |
| 페트리 접시(중) | VWR | 25373-085 | |
| 페트리 접시(소) | VWR | 10799-192 | |
| 면도날 | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| 직사각형 페트리 접시 | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| 이송 피펫 | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | 굴절률 1.56 |
| UV 램프 (Workstar 2003) | Maxxeon | ||
| 진공 데시케이터 | 전자 현미경 과학 | 71232 | |
| 물티슈 | Kimberly-Clark | Kimwipes |
참고문헌
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.....
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재인쇄 및 허가
