이 프로토콜에서, 우리는 조건부 녹다운 시스템과 환자 유래 GCSCs의 줄기에 대한 클러스터진의 효과를 연구하기 위해 적응된 구 형성 분석서를 사용하여 실험 설계를 제시한다. 프로토콜은 CSC의 다른 모형에 있는 줄기 관련 유전자의 체외 및 생체 내 기능 둘 다 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.
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방법 논문
결합된 조건부 녹다운 및 적응된 구체 형성 분석은 환자 유래 위암 줄기 세포의 줄기 관련 유전자를 연구하기 위하여
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
암 줄기 세포 (CSC)는 종양 개시, 발달 및 치료 후 재발에 연루되어 있으며 지난 수십 년 동안 많은 연구의 관심의 중심이되었습니다. 따라서 암세포 줄기에 관여하는 주요 유전자의 역할을 조사하는 방법을 개발하는 것이 중요하다. 위암 (GC)은 암의 가장 일반적이고 필멸의 모형 의 한개입니다. 위암 줄기세포(GCSC)는 위암 재발, 전이 및 약물 내성의 근본원인것으로 생각된다. GCSCs 생물학을 이해하는 것은 표적으로 한 치료의 발달을 발전시키고 결국 환자 중 사망을 감소시키기 위하여 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 조건부 녹다운 시스템과 환자 유래 GCSCs의 줄기에 대한 클러스터진의 효과를 연구하기 위해 적응된 구 형성 분석서를 사용하여 실험 설계를 제시한다. 프로토콜은 CSC의 다른 모형에 있는 줄기 관련 유전자의 체외 및 생체 내 기능 둘 다 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.
서론
위암 (GC)은 암의 가장 일반적이고 필멸의 유형 중 하나입니다1. 결합된 수술, 화학요법 및 GC 치료에 있는 방사선 요법에 있는 어드밴스에 도 불구하고, 예후는 가난한 남아 있고 5 년 생존율은 아직도 아주 낮은2입니다. 재발과 전이는 치료 후 사망을 일으키는 주된 이유입니다.
암줄기세포(CSC)는 종양3을재구성하는 상이한 세포 계보를 자가 갱신하고 생성하는 능력을 가진 암세포의 하위 집합이다. CSC는 자기 갱신 및 파종 새로운 종양의 그들의 기능 때문에 암 재발및 전이에 책임 있는 것으로 믿어진다, 전통적인 화학 요법및 방사선요법4에그들의 저항뿐만 아니라. 따라서 CSC를 타겟팅하고 CSC를 제거하면 치료를 개선하고 암 환자의 사망률을 줄일 수있는 흥미로운 잠재력을 제공합니다.
CSC는 고형 종양5의많은 모형에서 격리되었습니다. 2009년, 인간 위암 세포로부터 분리된 위암 줄기세포(GCSCs)는 원래 타카이시 외6에의해 기술되었다.....
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프로토콜
본 명세서에 기재된 환자 유래 위암 줄기세포를 이용한 모든 실험은 지역 윤리위원회7에의해 승인되었다.
1. 위암 줄기 세포 배양
- GCSC 전체 문화 매체의 준비
- 다음과 같은 필수 성분으로 신선한 DME/F12 배지를 추가하여 GCSC 완전 배양 배지 준비: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 인슐린/트랜스퍼린/셀레나이트 나트륨, 0.2% 포도당, 0.5% B27, 글루타맥스 1%, 비필수 아미노산 10μM 2-메르카포에탄올, 0.75 mg/mL NaHCO3,10μM 티오글리세롤, 100 IU/mL 페니핀 및 mL 페니핀 10. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터및 살균.
참고: GCSC 완전 배양 배지는 4°C에서 2주 이상 저장되는 것이 바람직하다.
- 다음과 같은 필수 성분으로 신선한 DME/F12 배지를 추가하여 GCSC 완전 배양 배지 준비: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 인슐린/트랜스퍼린/셀레나이트 나트륨, 0.2% 포도당, 0.5% B27, 글루타맥스 1%, 비필수 아미노산 10μM 2-메르카포에탄올, 0.75 mg/mL NaHCO3,10μM 티오글리세롤, 100 IU/mL 페니핀 및 mL 페니핀 10. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터및 살균.
- GCSC 및 문화 회복
참고: GCSC는 다음과 같이 수득하였다: 종양 샘플은 기계적 및 효소 해리를 실시하였다. 단세포 현탁액은 잘 흩어져 있는 현탁액으로부터 나일론 그물로 필터링하여 얻어졌다. 결과 암세포는 GCSCs 완전 배양 배지에서 배양되었고, 일부 세포는 구체를 형성하기 위해 성장하였다. 이들 구체는 효소 해리를 거쳐, GCS....
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결과
1차 인간 위암 줄기세포는 혈청이 없는 배양배지에서 배양되었다. 6일 후, 세포는 단일 세포와 같은 표현형(도1A)에서큰 구체(도1B)를형성하도록 확장하였다.
GCSC에서 클러스터진의 기능을 평가하기 위해 클러스터린및 스크램블에 대한 shRNA 서열은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 Tet-GV307-RFP-Puro 벡터로 복제되었다. GCSCs는 테트라사이클린 조절 된 shRNA-클러스터린 발현 벡터로 안정적으로 전염된 다음 48h(도 2)에대한 독시사이클린으로 처리 (및 shRNA는 대조군으로 스크램블링). 클러스터진의 발현 수준은 서양 블롯에.......
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토론
GC는 전 세계적으로 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인입니다. GCSC는 위암 재발, 전이 및 약물 내성에서 매우 중요합니다. 위암 환자로부터 GCSC를 사용하면 약점을 탐구하고 GC 환자의 치료를위한 표적 약물을 개발할 수 있습니다.
구형성 분석법은 체외에서 암 줄기세포 자가재생 잠재력을 검사하는 유용한 방법이다. 결과는 시드된 단일 세포의 원래 수로 나눈 구체의 백분율로 제시될 수 있다. 우리는 이 분석의 결과를 개선하고 다른 유형의 암 줄기 세포에 대한 재현성을 용이하게하기 위해 여러 시점에서 모든 세포 /구의 평균 크기를 계산하는 원래 의 방법을 조정했습니다. 우리는 이 분석의 결과가 초기 시드 셀의 수에 크게 의존한다는 것을 인증했습니다. 이것은 초기 세포 격리를 유지하고 구형 식민지의 수의 정확한 측정을 하기 위해 이 분석의 중요한 점입니다 (세포 집계 제외). 또한 셀룰러 집계 및 단일 셀과 구를 명확하게 구별하기 위해 계산 시간을 최적화하는 것이 중요합니다.
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 작품은 광동성 자연과학재단(2018A030310586, 2020A1515010989), 광동성 의학과학재단(A2019405)이 후원했습니다. 중국(81772957), 중국 광동성 과학기술프로그램(2017B03030101016), 심천산업정보기술재단(201803091010135860).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 &무; m 필터 | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free 재조합 인간 EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 보충제(50X), 무혈청 | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II 자동 세포 계수기 | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-포도 | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | ||
| 독시사이클린 하이클레이트 | 시그마-알드리치 | D9891 | |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | Gibco | 14190250 | |
| 소 태아 혈청, 인증, 호주 | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX 보충제 | Gibco | 35050061 | |
| 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 용액(ITS -G), 100X | Gibco | ||
| 41400045 렌티바이러스 벡터 | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X 농축기 | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection 시약 | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV 주사기 필터 장치, 0.45 µ m, PVDF, 33 mm, 감마 멸균 | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc 세포 배양/페트리 접시 | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I 환원 혈청 매체 | Gibco | 31985070 | |
| 페니실린-스트렙토마이신, 액상 | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol 성분) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG 성분) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| 폴리브레인 | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 재조합 인간 FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| 중탄산나트륨 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER 동결 보존 배지 | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase 세포 해리 용액 | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI 완충액, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS 도립 현미경 | ZEISS | Axio Vert.A1 |
참고문헌
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
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재인쇄 및 허가
