우리는 치과 펄프 (DP) 1 차 세포의 격리, 분산 및 도금이 지나치게 트랜스웰 필터 위에 배양된 삼차 (TG) 뉴런을 설명합니다. DP 세포의 세포 반응은 면역 형광 또는 RNA /단백질 분석으로 분석 될 수있다. 공초점 현미경검사법을 가진 신경 마커의 면역형광은 신경질성 파생 반응의 분석을 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
치아 의 식구는 치아가 압력, 온도 및 염증을 감지 할 수 있게하며, 이 모든 것이 치아 기관의 사용 및 유지 보수에 중요합니다. 감각 적인 내면없이, 매일 구강 활동은 돌이킬 수없는 손상을 일으킬 것입니다. 그 중요성에도 불구하고 치아 발달 및 유지 보수에서 의한 내면화의 역할은 크게 간과되었습니다. 여러 연구는 DP 세포가 치아 안팎으로 TG 축을 유치하고 안내하기 위해 세포외 매트릭스 단백질과 파라크린 신호를 분비한다는 것을 입증했습니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 DP mesenchyme와 신경 구심질 사이 크로스토크에 상세한 통찰력을 제공했습니다. 지식의 이 격차를 해결하기 위하여는, 연구원은 이 상호 작용을 조사하기 위하여 공동 문화 및 다양한 기술을 이용하기 시작했습니다. 여기에서, 우리는 기공을 통해 축산 성장을 허용하기 위하여 큰 직경 기공을 가진 오버리 트랜스웰 필터에 분산된 TG 뉴런을 가진 1 차적인 DP 세포를 공동 배양에서 관련시킨 다중 단계를 보여줍니다. loxP 부위에 의해 측면에 있는 관심 있는 유전자를 가진 1차 DP 세포는 아데노바이러스-Cre-GFP 재조합아제 시스템을 사용하여 유전자 결실을 용이하게 하기 위해 활용되었다. Thy1-YFP 마우스에서 TG 뉴런을 사용하여 공초점 현미경 검사법에 의한 배경 수준 보다 훨씬 높은 표정으로 정밀한 구심성 이미징을 허용했습니다. DP 반응은 단백질 또는 RNA 수집 및 분석을 통해 조사될 수 있고, 또는 탈착식 유리 커버슬립에 도금된 DP 세포의 면역형광 염색을 통해 조사될 수 있다. 미디어는 프로테오믹 분석과 같은 기술을 사용하여 분석할 수 있지만, 미디어에 태아 소 혈청의 존재로 인해 알부민 고갈이 필요합니다. 이 프로토콜은 공동 배양 분석의 조절된 환경에 반응하여 TG 뉴런 및 DP 세포의 형태학적, 유전적, 및 세포골격 반응을 연구하기 위해 조작될 수 있는 간단한 방법을 제공한다.
서론
치아 의 식구는 치아가 압력, 온도 및 염증을 감지 할 수 있게하며, 이 모든 것이 치아 기관의 사용 및 유지 보수에 중요합니다. 치과 충치및 외상과 관련되었던 치아 고통을 감지하지 못하면 질병 진행으로 이끌어 냅니다. 따라서 적절한 내면화는 정상적인 치아 성장, 기능 및 관리를위한 요구 사항입니다.
대부분의 장기는 출생 시부터 완벽하게 기능하고 자극되지만, 치아 발달은 출생 후1,2단계에서 치아 내피와 미네랄화가 동시에 발생하는 성인 생활로 확장됩니다. 흥미롭게도, 치과 펄프 (DP) mesenchyme는 처음에 개발 치아 기관으로 축삭 진입을 방지하기 위해 배아 발생 동안 발충제 신호를 분비, 이는 나중에 치아가분화에가까워짐에 따라 유치인자의 분비로 이동3,4. 출생 후 단계 동안, 삼차 (TG) 신경에서 구심성 축축은 상아질 침착이 시작되는 시간 의 주위에 치아에 침투합니다 (Pagella에서 검토, P.외. 5). 몇몇 생체 내 연구는 뉴런 -mesenchymal 상호 작용이 마우스에서....
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프로토콜
마우스를 사용한 모든 실험은 UAB 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 플레이트 준비
참고: 커버슬립은 분석의 끝에 있는 DP 세포를 이미지화하는 데 사용될 수 있습니다. 시료 처리 중 오염을 방지하기 위해 멸균 조직 배양 후드 외부의 모든 인큐베이션 및 헹구 단계 동안 플레이트 뚜껑이 켜져 있는지 확인하십시오.
-
커버슬립 준비
- 오토클레이브 원형 커버슬립.
- 후드 아래에 초순수를 걸으세요.
- 커버슬립을 24웰 플레이트에 옮기고 0.1 mg/mL 폴리-D-리신 400 μL로 덮습니다.
- 커버슬립을 5분 간 담그고, 12rpm의 로커또는 40-50rpm의 궤도 셰이커에 담가두십시오. 오염을 방지하기 위해 뚜껑이 켜져 있는지 확인하십시오.
- 12rpm에서 로커에 약 5분 간 여과된 초순수로 커버슬립을 헹구거나 50rpm에서 셰이커로 헹구어 줍니다. 반복.
- 커버슬립이 증발을 용이하게 하기 위해 플레이트 뚜껑을 닫고 후드 아래에서 최소 2시간 동안 건조되도록 하십시오. 이러한 커버립은 48 시간 이내에 사용해야....
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결과
이러한 결과는 TG 뉴라이트 단문화의 대조군과 비교하여 기본에서 1차 DP 세포의 존재에서 TG 뉴라이트 의 자성장이 증가하였다는 것을보여준다(도 2A,C). 신경외 분석 결과에서 몇 가지 분석-대-분석 가변성이 있다. 따라서, TG 뉴런 단일배양은 뉴라이트 의 기저 수준을 검출하는 대조군으로서 모든 검역사에 포함되어야 한다. Tgfbr2f/f 마우스로부터의 1차 세포는 Ad-Cre-GFP 및 Ad-eGFP의 감염 후 이 프로토콜에서 사용되었고, 동등한 수의세포(도 2D)에서확인되었다. Ad-eGFP는 대조군 바이러스 벡터로서 작용하였다. Ad-Cre-GFP는 반정적 PCR(도2E)에의해 입증된 바와 같이 측면 유전자인 Tgfbr2를 삭제하였다. 배양에서 베타 .......
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토론
구강의 일상 적인 활동은 치아가 적절한 사용과 유지 보수를 허용하기 위해 외부 자극과 내부 염증을 감지해야합니다. 그러나 치아 내막의 발달 과정을 이끄는 신호와 관련하여 제한된 정보만 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 집단 간의 교차 통신을 연구하기 위해 1차 DP 세포 및 TG 뉴런을 분리하고 공동 배양하는 방법을 제공한다. 몇 가지 변수가 최적화되었고 아래에 설명된 대로 연구의 추가 길을 열어 두십시오.
컨트롤은 이 분석의 모든 단계에서 중요합니다. 기본 DP 세포가 없는 TG 뉴런을 가진 트랜스웰 필터는 TG 성장을 위한 기준선을 제공하기 위하여 모든 분석제에 포함되어야 합니다. Ad-Cre-GFP 재조합으로 관심 있는 측면 유전자를 삭제할 때 형광 마커만을 발현하는 대조군 바이러스가 동등한 수의 세포가 감염되었음을 확인하는 데 사용되어야 합니다. 우리는 Ad-eGFP와 Ad-Cre-GFP를 위한 100 그리고 200 MOI에 최소한의 세포 죽음으로 감염의 상부를 각각.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 a) 국립 보건 원 (보조금 번호 R01 AR062507 및 R01 AR053860 에 RS), b) 버밍엄 치과 학술 연구 교육 (DART) 보조금 (번호 T90DE022736 (PI 맥두걸)) 국립 치과 연구소에서 SBP에 알라바마 대학 c) UAB 글로벌 두개안면, 구강 및 치과 장애 센터(GC-CODED) SBP 및 d에 대한 파일럿 및 타당성 보조금) 국립 치과 및 두개안면 연구소 연구/국립 보건원 K99 DE024406 SBP 에 대한 보조금.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | 15 &mu에서 유사 분열 억제제로 사용; 공동 배양 배지의 M 농도, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-Culture Plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Thy1-YFP neurons 표지를 위한 1차 항체, 1:200 희석 |
| Anti-Neurofilament 200 항체 | Sigma-Aldrich | NO142 | 표지 뉴런에 대한 단클론 1차 항체, 1:1000 희석, YFP 마우스를 사용할 수 없는 경우 |
| 대안 B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f/f 최적화된 프로토콜 B6에서 치과 치수 세포에 사용되는 마우스 모델 |
| . Cg-Tg (Thy1-YFP) 16Jrs / J | The Jackson Laboratory | 3709 | 삼차 신경 세포에 사용되는 Thy1-YFP 마우스 모델 유전자형 |
| 콜라겐 분해 효소 유형 | II Millipore | 234155-100MG | 삼차 신경 세포를 분산시키는 데 사용 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | 공동 배양 매체에 첨가제 |
| 미세 집게 | Science Tools | 11413-11 | TG 해부 용 미세 집게 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 10 &mu의 최종 농도에서 트랜스웰 인서트를 코팅합니다. g/ml, 원액은 1.5 mg/ml로 가정됨 |
| 용해 완충액(버퍼 RLT) | Qiagen | 79216 | 공동 배양 후 치과 치수 세포에서 RNA 추출 |
| L-글루타민 | Gibco 25030081 | 공동 배양 배지에 첨가제 | |
| 미세 해부 가위 | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | 두개골을 여는 해부 가위 |
| 현미경 커버 유리 | Fisherbrand | 12-545-81 | 선택적 세포 배양 및 면역형광 처리를 위한 원형 커버슬립 |
| 필수 배지 | Gibco | 12571063 | 공동 배양 배지 기반 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15070063 | 공동 배양 배지에 항생제 첨가제 |
| 포스파타제 억제제 | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | 치아 치수 세포에서 단백질을 추출하기 위한 RIPA 버퍼 첨가제 포스트 공동 배양 |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | 치과 치수 세포 형질 주입에 사용되는 |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | 치과 치수 세포 접착을 돕기 위한 Coverslip 코팅 |
| Protease 억제제 | Millipore | 05 892 791 001 | RIPA 첨가제 공동 배양 후 |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | 분석 종료 시 RNA, DNA 또는 단백질 수집을 위한 사전 멸균된 1.7ml 튜브 |
| ThinCert 세포 배양 인서트 | Greiner Bio-One | 662631 | 공동 배양 분석에서 삼차 신경세포용 Transwell 인서트 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | 치과 세포 분산 |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | 분산에 사용 삼차 신경 세포 |
| 초미세 집게 | Fine Science Tools | 11370-40 | 해부용 초미세 집게 |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | 1 &mu에서 유사분열 억제제로 사용; 공동 배양 배지의 M 농도, Day 2 |
| 진공 여과 시스템 | Millipore | SCNY00060 | Steriflip 일회용 필터, 50 μ m 나일론 그물 필터 |
| 바이알 집게 | Fine Science Tools | 110006-15 | 원추형으로 조직 이동을 위한 긴 집게 |
참고문헌
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morph....
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