Method Article

유세포 분석을 사용하여 적혈구 보체 1 보체 측정

DOI:

10.3791/60810

⸱

May 19th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법의 목적은 적혈구 CR1 밀도가 알려진 세 명의 피험체와 비교하여 임의의 적혈구에서 CR1 밀도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 피코에리트린(PE)을 사용하여 증폭된 시스템에 결합된 항 CR1 단일클론 항체에 의한 피험자의 적혈구의 면역 염색 후 유세포분석을 사용한다.

Abstract

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CR1 (CD35, C3b/C4b를 위한 보체 수용체 타입 1)은 약 200 kDa의 고분자량 막 당단백질로, 활성화를 보완하고 면역 복합체를 운반하며 체액 및 세포 면역 반응에 참여합니다. CR1은 적혈구를 포함한 많은 세포 유형의 표면에 존재하며, 길이, 구조(Knops, 또는 KN, 혈액형) 및 밀도에서 다형성을 나타낸다. 적혈구 당 CR1의 평균 밀도 (CR1/E) 적혈구 당 500 분자입니다. 이 밀도는 한 개인에서 다른 (100-1,200 CR1/E)와 같은 개인의 적혈구에서 다른 사람까지 다양합니다. 우리는 증폭 면역 염색 시스템의 도움으로 낮은 밀도를 발현하는 과목을 포함하여 CR1/E의 밀도를 측정하는 견고한 유량 세포 분석 방법을 제시합니다. 이 방법은 알츠하이머 병 (AD), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에이즈 또는 말라리아와 같은 질병에서 CR1 적혈구 발현의 저하를 보여줄 수있게했습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1(수용체 타입 1, CD35)은 적혈구1,B 림프구2,단핵세포, 일부 T 세포, 여포 수지상 세포3,태아 성상세포4,및 사구체 포세포5와같은 많은 세포 유형의 표면에 존재하는 200 kDa 막 막 당단백질이다. CR1은 리간드 C3b, C4b, C3bi6,,7,,88,9,제1 보체 성분의 소단위, C1q10 및 MBL(mannan-binding lectin)을 방해하여 보체 및 세포 면역 반응의 활성화를 억제한다.11

영장류에서, 인간을 포함하는 영장류에서, 적혈구 CR1은 간 및 비장으로 면역 복합체의 수송에 관여하며, 혈액을 정화하고 피부 또는 신장과 같은 취약한 조직에 그들의 축적을

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Protocol

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인간의 혈액 수집 및 취급을 위한 프로토콜은 지역 윤리 위원회 (CPP Est II)에 의해 검토되고 승인되었으며, 프로토콜 번호는 2011-A00594-37입니다. 다음 의정서는 인간의 혈액 의학적 처리를 설명하기 때문에 생체 유해 물질 의 폐기에 대한 제도적 지침을 따라야 합니다. 실험실 코트와 장갑과 같은 실험실 안전 장비는 착용해야 합니다.

1. 적혈구 세척

참고: 취급 전날, 소 혈청 알부민(BSA)의 0.15%를 함유한 인산염 완충식염수(PBS)를 함유한 PBS-BSA 완충액을 준비하고 4°C의 냉장고에 놓습니다. 이 버퍼는 세척 버퍼 및 희석 버퍼로 사용됩니다.

  1. 50 mL 튜브에 PBS-BSA의 파이펫 20 mL.
  2. 흡인 250 μL 의 나트륨 에틸렌디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 항응고전 혈액을 혈액 저장 관으로부터 및 PBS-BSA의 20 mL를 포함하는 튜브에 첨가하였다. 캡을 나사로 조여 튜브를 닫습니다. 튜브를 2x 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
  3. 430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 10 mL 파이펫을 사용하여 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 부드럽고 세심한 파이펫팅으로 상급물....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1의 밀도가 알려진 3명의 피험자의 적혈구("낮음" 대상 [180 CR1/E], "중간" 대상 [646 CR1/E], 및 "높음" 대상 [966 CR1/E]), 그리고 CR1 밀도가 결정되어야 하는 2명의 피험자의 항 CR1 항체결합을 사용하여 증폭계에 면역으로 염색하였다. 처음에, 낮은 고범위로부터 피험자의 CR1 밀도는 방사성 표지된 항체를 이용한 Scatchard 방법29에 의해 결정되었다. 결정된 표준(낮음, 중간 및 높음)은 교정 곡선에 사용되었고, 당사의 세포분석 방법30에의해 새로운 표준 또는 하부 표준을 정량화할 수 있게 하였다. 유세포계에서 면역염색된 적혈구의 통과 후, 표지의 강도는 각 대상체에 대한 평균 형광 강도(RBC MFI)로 관찰 및 측정하였다(도3F,I; 그림 4B,

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

적혈구 CR1 (CR1/E)의 밀도를 결정하기 위해 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 사용된 첫번째 기술은 항 CR1항체(31)에 의한 적혈구의 응집 및 C3b32로코팅된 적혈구의 존재 에 있는 장미의 대형이었습니다. 이러한 기초적인 기술은 방사성 표지된 항 CR1 항체1,,33을사용하여 면역 염색 방법으로 빠르게 대체되었다. 또한 효소 연계 면역흡착제 분석(ELISA)34에의해 막 추출물에서 CR1의 농도를 측정할 수도 있다. 정확하지만 이러한 기술은 CR1/E 밀도의 평균 값만 제공합니다. 전체 적혈구 집단에 대한 CR1/E 밀도의 분포는 면역 염색 후 유동 세포 측정 분석에 의해서만 사용할 수 있습니다. 이 기술은 CR1/E의 밀도가 낮기 때문에 어렵습니다. 그럼에도 불구하고, 증폭 방법은.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 URCACyt의 모든 구성원, 유동 세포 분석 기술 플랫폼, 면역학의 부서의 직원, 그리고 프로토콜을 최적화하고 검증하는 데 기여 한 내과 및 노인학과의 직원에게 감사드립니다. 이 작품은 랭스 대학 병원에 의해 투자되었다 (보조금 번호 AOL11UF9156).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000E 배리어 팁Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079E시료 피펫팅
1-100 µ L 베벨, 필터 팁Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840샘플 피펫팅
Biotinylated anti-CR1 monoclonal anti body (J3D3)비상업적 단클론 항체의 국내 생산, Dr J. Cookimmunostaining
Blouseprotection
Bovin serum albumin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037세포
원심분리기Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917원심분리
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345세포분석
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060P랙
사이토미터 설정 및 추적 비드 키트BD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051세포 분석
포름 알데히드 용액 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µ L 눈금이 매겨진 필터 팁Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810샘플 피펫팅
LSRFORTESSA 유세포 분석기BD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788세포분석
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494샘플 피펫팅
Micronic 1.40 mL 둥근 바닥 튜브Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051믹스
마이크로피펫 Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379샘플 피펫팅
인산염 완충 식염수(PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031세포분석
피펫 PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952샘플 피펫팅
분말이 없는 니트릴 시험 장갑Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µ LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µ LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059샘플 피펫팅
Reference 2 피펫, 100-1000 &마이크로; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
Rinse SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346세포분석
Round bottom tubeSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidin R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669면역 염색
테이퍼 원심 분리기 튜브 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, 프랑스10203001혼합
Vector anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500면역 염색
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236믹스
분석

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.

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