방법 논문

제브라피시 유충에 대한 환경 오염물질의 신경행동 효과 연구

DOI:

10.3791/60818

⸱

2020년 2월 5일

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Marine Geology, Tongji University, 2Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, 3Shanghai Collaborative Innovation Centre for WEEE Recycling, WEEE Research Center of 10 Shanghai Polytechnic University, 4Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security

이 논문에서

요약

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이 논문에서는 제브라피쉬 유충 모델을 이용한 환경 오염물질의 신경행동 독성 평가를 위한 상세한 실험 프로토콜이 제시되며, 여기에는 노출 과정과 신경행동 지표에 대한 테스트가 포함된다.

초록

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최근 몇 년 동안 점점 더 많은 환경 오염 물질이 특히 유기체의 초기 개발 단계에서 신경 독성이 입증되었습니다. 얼룩말유충은 환경 오염 물질의 신경 행동 연구를위한 탁월한 모델입니다. 여기서, 배아의 수집, 노출 과정, 신경행동지표, 시험과정 등을 포함하는 제브라피쉬 유충을 이용한 환경오염물질의 신경독성평가를 위한 상세한 실험 프로토콜이 제공되고, 데이터 분석을 제공합니다. 또한, 배양 환경, 노출 과정 및 실험 조건은 분석의 성공을 보장하기 위해 논의된다. 이 프로토콜은 정신 병증 약물의 개발, 환경 신경 독성 오염 물질에 대한 연구에 사용되었으며, 해당 연구를 수행하거나 기계론 적 연구에 도움이되도록 최적화 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라피시 유충에 대한 신경 행동 효과를 연구하기 위한 명확한 작동 과정을 보여주며 다양한 신경 독성 물질 이나 오염 물질의 효과를 밝힐 수 있습니다.

서론

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최근 몇 년 동안 점점 더 많은 환경 오염 물질이 신경 독성1,2,3,4로입증되었습니다. 그러나, 환경 오염 물질에 노출 된 후 생체 내에서 신경 독성의 평가는 내분비 중단 또는 발달 독성만큼 쉽지 않다. 또한, 오염 물질에 대한 조기 노출, 특히 환경 관련 용량에서, 독성 연구에서 증가 관심을 끌고있다5,6,7,8.

Zebrafish는 환경 오염 물질에 노출 된 후 초기 개발 중에 신경 독성 연구에 적합한 동물 모델로 설립되고 있습니다. 얼룩말물고기는 수정 후 다른 종보다 빠르게 발달하는 척추동물입니다. 유충은 융모의 영양소가 7일 동안 유지하기에 충분하기 때문에 먹이를 줄 필요가 없다(dpf)9. 유충은 ~2 dpf에서 융모에서 나오고....

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프로토콜

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이 프로토콜은 동지대학교 동물윤리위원회의 승인을 받은 지침에 따른 것입니다.

1. 제브라피쉬 배아 수집

  1. 노출 전날 밤에 건강한 성인 튜빙겐 제브라피시 2쌍을 산란상자에 넣고 성비를 1:1로 유지합니다.
  2. 다음날 아침 일광 후 30-60 분 시스템에 다시 성인 물고기를 제거합니다.
  3. 산란 상자에서 배아를 제거합니다.
  4. 배아를 시스템 물로 헹구고 있습니다.
  5. 충분한 시스템 물로 유리 페트리 접시 (직경 9cm)에 배아를 전송합니다.
  6. 현미경의 밑에 태아를 관찰하고 나중에 노출을 위한 건강한 태아를 선택하십시오.
    참고 : 건강한 배아는 일반적으로 현미경 아래에서 밝은 황금색으로 투명합니다. 건강에 해로운 태아는 일반적으로 창백하고 현미경의 밑에 관찰된 것과 같이 함께 뭉쳐집니다.

2. 노출 전 준비

  1. 제브라피쉬북31의가이드라인에 따라 행크스의 용액을 준비한다.
    참고 : 행크스의 솔루션은 0.137 M NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4,0.44 mM KH

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결과

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여기서, 우리는 빛 자극하에 제브라피쉬 유충을 사용하여 환경 오염 물질의 신경 행동 효과를 연구하기위한 프로토콜을 설명합니다. 운동, 경로 각도 및 사회 활동 테스트는 소개에 정의되어 있습니다. 운동 및 경로 각도 테스트에서 마이크로 플레이트의 설정과 소프트웨어의 이미지는 다음과 같습니다. 또한, 우리 자신의 연구 결과는 예로 제시된다. 2개의 연구 결과는 BDE-47 및 6-OH/MeO-BDE-47에 노출 후에 운동 및 경로 각도 효력을 제출합니다. 세 번째 연구는 사회적 행동에 네 개의 상업 염소 화 파라핀의 효과를 제시한다.

48개의 웰 마이크로플레이트의 설정및 운동 및 경로 각도 시험에서 유충의 이동 궤적.
1개의 대조군 및 2개의 처리 단을 포함하는 3개의 단은, 프로토콜에서 이용되었다. 모든 그룹은 16 마리의 동물을.......

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토론

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이 작업은 제브라피시 유충을 사용하여 환경 오염 물질의 신경 독성을 평가하기 위한 상세한 실험 프로토콜을 제공합니다. Zebrafish는 노출 기간 동안 배아에서 유충으로 과정을 거치므로 배아와 유충을 잘 돌보는 것이 필수적입니다. 배아와 애벌레의 발달에 영향을 미치는 모든 것이 최종 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기서 배양 환경, 노출 과정 및 실험 조건은 전체 분석의 성공을 보장하기 위해 논의된다.

배양 환경을 위해, 제브라피쉬 배아 및 유충은 ~28°C의 안정적인 온도하에서 산다. 이 작품에서는, 빛의 조건을 자동으로 설정하고 온도를 안정적으로 유지할 수 있는 광 인큐베이터가 배아와 애벌레를 수용하는데 사용된다. 배아는 1 dpf 및 2 dpf에서 융모에서 나오지 않으므로 노출 용액을 갱신 할 때 해치되지 않은 배아를 손상시키지 않도록주의해야합니다. 또한, 용액내의 DMSO의 비율은 0.1%34,

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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저자는 중국 국립 자연 과학 재단 (21876135 및 21876136), 중국의 국가 주요 과학 기술 프로젝트 (2017ZX07502003-03, 2018ZX077010101-22), MOE-상하이 재단의 재정 지원에 감사드립니다. 어린이 환경 보건의 주요 실험실 (CEH201807-5), 스웨덴 연구위원회 (번호 639-2013-6913).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
48웰 마이크로플레이트Corning3548Embyros 하우징
6웰 마이크로플레이트Corning3471Embyros 하우징
BDE-47AccuStandard,5436-43-1오염 물질
DMSOSigma67-68-5공용매
현미경OlympusSZX 16관측 장비
피펫Eppendorf3120000267Transfer 솔루션
ZebraboxViewpointZebraBox동작 기기
ZebrafishShanghai FishBio Co., Ltd.튀빙겐제브라피시 공급업체
: ZebraLabViewpointZebraLab동작 소프트웨어
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참고문헌

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  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al.

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재인쇄 및 허가

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