방법 논문

작은 헤어핀 (sh)RNA를 사용하여 C2C12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운

DOI:

10.3791/60824

⸱

2020년 2월 12일

 ,  , 
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

이 논문에서

요약

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우리는 작은 머리핀 (sh) RNA를 사용하여 C2C12 근구 세포재이상체에서 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질을 코딩하는 유전자를 안정적으로 무너뜨리는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 C2C12 근강초 동안 mRNA, 단백질 및 세포 수준에서 의 녹다운 효율의 유효성을 검증하기 위한 방법을 myotube 분화로 표적화한다.

초록

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세포외 매트릭스(ECM) 단백질은 골격 근 발달과 항상성에 매우 중요합니다. C2C12 근구 세포체에서 ECM 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운은 골격 근력 발달에서 이러한 단백질의 역할을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 C2C12 세포에서 작은 헤어핀(sh) RNA를 사용하여 ECM 단백질 ADAMTSL2를 고갈시키기 위한 프로토콜을 예로 기술한다. shRNA 플라스미드의 형질감염 후, 안정한 세포는 푸로마이신을 사용하여 일괄 선택하였다. 우리는 또한 mRNA 발현, 단백질 발현 및 C2C12 분화를 통해 이들 세포주의 유지 및 표현형 분석의 유지를 기술한다. 이 방법의 장점은 비교적 빠른 안정적인 C2C12 녹다운 세포의 생성과 세포 배양 배지에서 혈청의 고갈 시 다중 핵화 된 myotubes로 C2C12 세포의 신뢰할 수있는 분화이다. C2C12 세포의 분화는 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 및 MyoD, myogenin, 또는 myosin 중대체인 (MyHC)과 같은 정식 마커 유전자의 발현 수준을 측정하여 Myotube로 C2C12 근강변 분화의 진행을 나타내는 모니터링할 수 있습니다. 작은 간섭 (si) RNA를 가진 유전자의 과도 한 녹다운대조적으로, C2C12 분화 도중 또는 myotube 성숙 도중 나중에 표현되는 유전자는 shRNA를 안정적으로 발현하는 C2C12 세포를 생성해서 보다 효율적으로 표적으로 할 수 있습니다. 이 방법의 한계는 CRISPR/Cas9에 기초한 유전자 녹아웃 전략을 사용하여 극복될 수 있는 특정 shRNA에 따라 녹다운 효율의 가변성뿐만 아니라 고려해야 할 shRNA의 잠재적인 오프 타겟 효과이다.

서론

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세포외 매트릭스(ECM) 단백질은 모든 조직에 대한 구조적 지원을 제공하고 세포 세포 통신을 중재하며 세포 운명을 결정합니다. ECM의 형성 및 동적 리모델링은 따라서 조직 및 장기 항상성을 유지하는 데 중요합니다1,2. ECM 단백질을 위해 코딩하는 몇몇 유전자에 있는 병리학적인 이체는 근위축성에서 가성형성에구역 수색하는 표현형을 가진 근골격계 무질서를 초래합니다3,4. 예를 들어, ADAMTSL2의 병원성 변이체는 매우 드문 근골격계 질환인 겔레오피식 이형성증을 일으키며, 이는 가짜 근육, 즉 골격근 질량의 명백한증가5를제시한다. 마우스 및 인간에서유전자 발현 데이터와 함께, 이것은 골격 근 발달 또는 항상성6,7에서ADAMTSL2에 대한 역할을 시사한다.

우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 ADAMTSL2가 세포 배양 설정에서 골격 근육 발달 및 / 또는 항상성을 조절....

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프로토콜

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1. 대장균에서 shRNA 플라스미드 DNA 준비

  1. shRNA 플라스미드를 운반하는 클론 세균 식민지의 생성
    1. 상업적 출처로부터 표적 특이적 shRNA 플라스미드 및 대조군 플라스미드를 운반하는 대장균의 글리세롤 주식을입수한다(재료표).
      참고: 3개의 상이한 shRNA 플라스미드가 사용되었고, 뮤린 아담트슬2 mRNA의 상이한 영역을 표적으로 삼았다. 하나의 shRNA는 재조합 전신 ADAMTSL2 또는 개별 ADAMTSL2 단백질 도메인을 인코딩하는 발현 플라스미드를 사용하여 구조 실험을 용이하게 하기 위해 아담트슬2의 3'-untranslated 영역(3'UTR)을 표적으로 하기 위해 선택되었다. 또한, 스크램블된 shRNA 플라스미드를 음성 대조군으로 포함시켰다. shRNA 서열의 세부 사항은 그림 1A.
    2. 실온(RT)에서 shRNA 세균성 글리세롤 스톡을 해동합니다. 100 μg/mL 암피실린(LB-Amp)으로 보충된 루리아-베르타니(LB) 한천 플레이트에 10 μL의 세균성 글리세롤 스톡을 옮니다.
      참고 : LB-Amp 플레이트는 1L 의 LB 배지 ....

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결과

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puromycin 저항하는 C2C12의 선택은 비 저항성, 즉, 비감염세포의 효율적인 제거로 인해 형질전환 후 10-14일 후에 달성될 수있다(도 1B). 전형적으로, 세포의 80% 이상은 세포 배양 접시에서 분리하고 이 세포는 일상적인 세포 유지 동안 제거됩니다. Puromycin 저항하는 C2C12 세포는 제어 (스크램블드) shRNA를 표현하는 낮은 세포 밀도및 myotube로 분화하는 기능에서 스핀들 모양, 가늘게 한 세포 형태를 유지합니다. 혈청 금단에 따른 C2C12 분화는 밝은 현장 현미경 검사법및 myotube 마커 미오신 중대사슬(MyHC)에 대한 면역염색에 의해 모니터링될 수있다(그림 2). MyHC 양성 myotubes는 분화 개시 후 3-5 일 사이에 관찰됩니다. Myotube는 MyHC 양성 세포 경계 내에서 하나 이상의 DAPI 양성 핵의 존재에 의해 도시된 바와 같이.......

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토론

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우리는 여기에서 C2C12 근강초체에 있는 ECM 단백질의 안정한 녹다운을 위한 프로토콜및 myotubes로 C2C12 근세포의 분화의 표현형 분석을 위한 기술합니다. 여러 가지 요인이 실험 결과를 결정하며 신중하게 고려해야 합니다. 증식 상에서 C2C12 세포를 유지하는 것은 C2C12 세포를 근구 전구체 상태로 유지하는 중요한 단계이다. C2C12 세포의 능력을 유지하여 지속적으로 myotube로 분화하는 것은 i) 세포의 통로 수, ii) 일상적인 유지 동안 배양된 세포의 밀도, 및 iii) 영양소 가용성에 따라 달라지며, 세포 배양 배지11,12,13의빈번하고 정기적인 보충이 요구된다. 몇몇 알려지지 않은 기계장치 때문에, 더 높은 통로 수 C2C12 세포는 또한 추가 근막융합(11)에대한 잠재력을 잃는다. C2C.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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D.H.는 국립 보건원 (국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소, NIAMS, 교부금 번호 AR070748)과 레니 & 피터 W. 월 정형 외과, 아이칸 의과 대학의 종자 기금에 의해 지원됩니다. 시나이 산.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세톤피셔 화학 191784
한천피셔 생물 시약BP1423
암피실린피셔 생물 시약BP1760-5
자동 세포 계수기 Countesse IIInvitrogenA27977
Bradford 시약Thermo ScientificP4205987
C2C12 세포ATCCCRL-1772
챔버 슬라이드InvitrogenC10283
클로로포름Fisher 화학 183172
DMEMGIBCO11965-092
DMSOFisher BioreagentsBP231-100
DNase I (Amplification Grade)Invitrogen18068015
Fetal bovine serumVWR97068-085
GAPDHEMD MilliporeMAB374
글리신VWR Life Sciences19C2656013
염소-안티-마우스 2차 항체(IRDYE 800CW)
염소-안티 마우스 2차 항체(로다민-레드)잭슨 면역 연구133389
HCl피셔 케미컬A144S
인큐베이터(셰이커)Denville Scientific Corporation1704N205BC105
메르캅토에탄올Amresco, VWR Life Sciences2707C122
Midiprep 플라스미드 추출 키트Qiagen12643
Myosin 4 (myosin heavy chain)Invitrogen14-6503-82
마운팅 매체Invitrogen2086310
NaClVWR Life Sciences241
비이온 계면활성제/세제VWR Life Sciences18D1856500
파라포름알데히드MP199983
PBSFisher BioreagentsBP399-4
PEIPolysciences23966-1
페니실린/스트렙토마이신 항생제GIBCO15140-122
페트리디쉬코닝353003
폴리프로필렌 튜브Fisherbrand149569C
프로테아제 억제제 칵테일 정제Roche33576300
Puromycin FisherScientificBP2956100
PCR(실시간)Applied Biosystems4359284
반응 튜브Eppendorf22364111
Reverse Transcription, Master MixApplied Biosystems
RIPA buffer, Thermo ScientificTK274910
sh control plasmidSigma-Aldrich07201820MN
sh 3086 plasmidSigma-AldrichTRCN0000092578
sh, 972 plasmidSigma-Aldrich
sh 1977 plasmidSigma-AldrichTRCN0000092582
분광 광도계 (Nanodrop)Thermo ScientificNanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix AppliedBiosystems743566
Trichloroacetic acidAcros Organics30145369
Trizol reagentAmbion
Trypan blueGIBCO15250-061
트립톤피셔 생물 시약BP1421
트립신 EDTA 0.25%Gibco-Life Technology Corporation2085459
물(DEPC 처리 및 뉴클레아제 없음)Fisher Bioreagents186163
Western blotting apparatusBioradMini Protean Tetra Cell
효모 추출물Fisher BioreagentsBP1422
Li-C90130-02 : , , 4368814 , , , , TRCN0000092579254707

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extrace....

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C2C12 MyoblastsshRNA KnockdownExtracellular Matrix ProteinsPuromycin SelectionCell DifferentiationWestern Blot AnalysisMyosin Heavy ChainSerum Free DMEMBright Field MicroscopyGene Expression Analysis

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