질량 분광법 유도 게놈 마이닝 프로토콜이 확립되고 여기에 설명되어 있습니다. 그것은 게놈 순서 정보 및 LC-MS/MS 분석을 기반으로 하고 복잡한 미생물 및 식물 추출물에서 분자의 식별을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
천연 제품으로 덮인 화학 공간은 엄청나고 널리 인식되지 않습니다. 따라서, 자연에서 그 기능및 잠재적인 인간 이익(예를 들면, 약물 발견 신청을 위한)의 광범위한 평가를 수행하는 편리한 방법론이 요구된다. 이 프로토콜은 게놈 채굴(GM)과 분자 네트워킹(MN)의 조합을 설명하며, 전체 게놈 시퀀싱에서 유전자 클러스터 인코딩 주석과 조잡한 대사 추출물의 화학 구조 시그니처와 일치하는 두 가지 현대적 접근법을 설명합니다. 이것은 새로운 자연 개체의 발견을 향한 첫 번째 단계입니다. 이러한 개념은 함께 적용될 때 MS 유도 게놈 마이닝으로 정의됩니다. 이 방법에서, 주요 성분은 이전에 지정 (MN을 사용하여), 구조적으로 관련된 새로운 후보는 게놈 서열 주석 (GM을 사용하여)와 연관된다. GM과 MN을 결합하는 것은 이미 알려진 화합물에서 유사체를 식별하기 위해 새로운 분자 백본을 대상으로하거나 신진 대사 프로파일을 수확하는 수익성있는 전략입니다.
서론
이차 물질 대사의 조사는 수시로 활성 분획에 속하는 성분의 정제, 식별 및 특성에 선행된 특정 생물학 활동에 대한 조추출물을 검열하는 것으로 구성됩니다. 이 과정은 여러 화학 물질의 격리를 촉진, 효율적인 것으로 입증되었습니다. 그러나 요즘에는 재발견비율이 높기 때문에 실현 불가능한 것으로 보입니다. 제약 산업이 전문 대사 산물의 역할과 기능에 대한 지식없이 혁명을 일으켰기 때문에 자연을 정확하게 나타내지 않은 실험실 조건에서 식별이 수행되었습니다1. 오늘날, 자연 신호 영향의 더 나은 이해가있다, 분비, 그리고 탐지 낮은 농도에서 대부분의 대상의 존재. 또한, 프로세스의 규제는 학계 와 제약 산업이 지식을 활용하는 데 도움이 될 것입니다. 그것은 또한 침묵 하는 생 합성 유전자 클러스터와 관련 된 대사 산물의 직접 적인 격리를 포함 하는 연구 혜택을 것입니다 (BGCs)2.
이러한 맥락에서, 게놈 염기서열 분석의 발전은 미생물 대사 산물 선별에 대한 관심을 새롭게 하고 있다. 이는 발견되지 않은 생합성 클러스터의 게놈 정보를 분석하면 실험실 조건하에서 관찰또는 생성되지 않은 새로운 화합물을 코딩하는 유전자가 밝혀지므로. 많은 미생물 전체 게놈 프로젝트 또는....
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프로토콜
1. 생합성 유전자 클러스터용 게놈 채굴
- MS 유도 게놈 채굴을 위한 생합성 유전자 클러스터(BCG)를 선출하는 첫 번째 단계로 전체 게놈 시퀀싱(WGS)을 수행합니다. 관심균(박테리아)의 전체 게놈 드래프트는 고품질 게놈 DNA를 이용한 일루미나 미세크 기술에 의해 얻어질 수 있다: 산탄총 TruSeq PCR-프리 라이브러리 준비 및 넥스트세라 메이트 페어 라이브러리 준비 키트33.
참고: 시퀀싱 후, 일루미나 산탄총 라이브러리와 일루미나 메이트 페어 라이브러리는 Newbler v3.0(로슈, 454) 어셈블러 프로그램 (에서 발견 ) FgeneSB를 기반으로 파이프라인을 사용하여 추가 (에서 발견 & http://www.softberry.com/berry.phtml?주제=fgenesb_annotator&그룹=도움말&하위 그룹=파이프라인>33 미생물학 자원 공지 사항 (MRA)은 사용 가능한 저장소에 기탁 된 미생물 자원의 가용성을 게시하는 기사가있는 완전히 열린 액세스 저널입니다 (에서 발견 ). 후보 단백질 코딩 유전자는 RAST 서버 부호34를사용하여 식별되며, 전체 게놈 산탄총 (WGS) 프로젝트는 DDB....
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결과
이 프로토콜은 게놈 채굴, 이종 발현 및 MS-유도/코드 접근법의 조합을 사용하여 새로운 특수 발리노마이신 유사체 분자에 액세스하는 방법을 성공적으로 예시하였다. 표적에 대한 게놈-분자 간 워크플로우, valinomycin(VLM)은 도 8에나타내고 있다. 연쇄상 구균 sp. CBMAI 2042 초안 게놈은 실리코에서 분석되고, VLM 유전자 클러스터는 그 때 이종 호스트로 확인되고 옮겨졌다. 이종및 야생형 균주는 적절한 발효 조건을 이용하여 삼중항으로 경배되었고, 에틸 아세테이트로 분할하고, 조추출물을 생성하기 위해 농축되었다. 제품으로부터, MS/MS 데이터는 분자 네트워킹을 위한 탠덤 MS 대사산물 프로파일을 생성하기 위해 인수되었다. 도 9는 Streptomyces sp. CBMAI 2042 원유 추출물로부터 MS/MS 데이터로부터 수득된 클러스터된 이온을 나타내며, 이에 대한 특징적.......
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토론
이 프로토콜의 가장 큰 장점은 새로운 분자, 특히 구조적 유사체2의구조를 해명하기 위해 MS 데이터와 함께 대사 프로파일및 브리지 게놈 정보를 신속하게 복제하는 능력입니다. 게놈 정보에 기초하여, 다른 천연물 화학형은 폴리케타이드 (PK), 비리보소몰 펩티드 (NRP), 글리코실화 천연물 (GNP)뿐만 아니라 비밀BGC. Metabolomic 스크리닝은 실험실 조건 하에서 특정 균주에 의해 생성된 활성화된 BGC 프로파일 및 화학적 다양성의 증거를 산출합니다. 따라서, BGC는 분자 네트워킹에 의해 발견된 유사성에 의해 촉진되는 이미 알려진 BGC와 관련된 새로운 화합물 또는 알려지지 않은 유사체의 직접 생산을 복제할 수 있다. 따라서 이 절차는 천연 공급원에서 생산되는 귀중한 화합물을 구별하는 데 도움이 되며 천연 제품 파이프라인에서 흔히 볼 수 있는 향후 격리 단계에 대한 가이드로 사용될 수 있습니다.
MS-유도 게놈 채굴은 펩티도게.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 연구에 대한 재정 지원은 상파울루 연구 재단에 의해 제공되었다 - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 및 2014/50249-8~ L.G.O; 2013/12598-8 및 2015/01013-4~ R.S.; 및 2019/08853-9- C.F.F.A. B.S.P, C.F.F.A., 및 L.G.O.는 국가 과학 기술 개발위원회 - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4, 및 313492/2017-4)로부터 펠로우십을 받았습니다. L.G.O.는 또한 과학의 여성을 위한 프로그램(2008, 브라질 판)에서 제공하는 보조금 지원에 감사드립니다. 모든 저자는 CAPES (고등 교육 인력의 개선을위한 조정)가 브라질에서 졸업 후 프로그램을 지원하기위한 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토니트릴 | 테디아 | AA1120-048 | HPLC 등급 |
| 한천 | 옥소이드 | LP0011 | NA |
| 아프라마이신 | 시그마 알드리치 | A2024 | NA |
| 카르베니실린 | 시그마 알드리치 | C9231 | NA |
| 원심분리기 | 에펜도르프 | NA | 5804 |
| 클로람페니콜 | 시그마 알드리치 | C3175 | NA |
| 컬럼 C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µ m, 1200bar 압력 한계 P/N 757700-902 |
| Kanamycin | Sigma Aldrich | K1377 | NA |
| Manitol P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | NA | NA 5418 |
| Nalidixic acid | , Sigma, Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash, High-Fidelity PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | NA |
| Q-TOF 질량 분석기 | , Agilent technologies | NA | 6550, iFunnel, Q-TOF, LC/MS |
| Sacarose, P.A.- A.C.S. | Synth, | NA | NA |
| Shaker/Incubator | Marconi | MA420 | NA |
| 염화나트륨 | Synth | , NA | P.A. - ACS |
| , 콩 추출물 | NA | NA | |
| NA, 자당, | Synth, | NA | P.A. - ACS, |
| Thermal Cycles | Eppendorf | NA | Mastercycler, Nexus Gradient |
| Thiostrepton, | Sigma Aldrich | T8902 | NA |
| 트립톤 | 옥소이드 | LP0042 | NA |
| 트립톤 대두 육수 | 옥소이드 | CM0129 | |
| NA UPLC | 애질런트 테크놀로지 | NA | 1290 인피니티 LC 시스템 |
| 효모 추출물 | 옥소이드 | LP0021 | NA |
참고문헌
- Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
- Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8)....
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