Method Article

피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)는 시험관 내에서 인간 배아 발달의 질병 모델링 및 연구를위한 강력한 도구가되었습니다. 우리는 이전에 자율 신경 병증을 가진 환자에 적용된 교감 특성을 가진 자율 신경의 파생을 위한 분화 프로토콜을 제시했습니다. 그러나, 프로토콜은 녹아웃 세럼 교체(KSR) 및 피더 기반 배양 조건에 기초하여 구축되었으며, 높은 분화 효율을 보장하기 위해, 세포 선별이 필요하였다. 이러한 요인으로 인해 가변성이 높고 비용이 높으며 재현성이 낮습니다. 또한 전기 활성을 포함한 성숙한 교감 특성은 확인되지 않았습니다. 여기서는 피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건에서 PSC 배양 및 분화를 수행하는 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 트렁크 신경 문장을 식별하는 유전 마커가 식별됩니다. 세포 선별없이 20 일 후에 후 신경절 교감 뉴런으로의 추가 분화가 달성됩니다. 전기 생리학적 기록은 기능적 뉴런 정체성을 더 나타낸다. 우리의 분화 된 뉴런에서 검출 된 발사니코틴에 의해 강화 될 수 있으며 아드레날린 수용체 길항제 프로프라놀롤에 의해 억제 될 수있다. 이 프로토콜의 중간 교감 신경 전구체는 최대 2주 동안 신경 구형으로서 유지될 수 있으며, 이는 배양을 확장할 수 있게 한다. 요약하면, 우리의 업데이트 된 교감 신경 분화 프로토콜은 이전 버전에 비해 높은 분화 효율, 더 나은 재현성, 더 많은 유연성 및 더 나은 신경 성숙을 보여줍니다. 이 프로토콜은 자율 신경계에 영향을 미치는 인간의 장애를 연구하는 데 필요한 세포를 연구원에게 제공 할 것입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포스트 갱글리오닉 교감 뉴런 (symN)은 자율 신경계 (ANS)에 속하며 의식과 무관하게 신체의 항상성을 반응하고 조절하는 데 여러 가지 중요한 역할을합니다. 예를 들어, 스트레스는 심박수를 자극하고 심박수, 혈압 및 발한의 증가로 이어지는 전투 또는 비행 반응을 불러일으킵니다. SymN은 유전학, 독성/상해 또는 다른 질병의 동반자로 인해 여러 인간 장애에 영향을 받습니다. 유전 신경병증의 예로는 심민의 심한 dysregulation이 호흡 곤란을 일으키는 유년기 무질서 가족 성 Dysautonomia (FD)가 있습니다, 땀나기, 피부의 얼룩, 구토 발작, 고혈압 및불안에의해 명백한 dysautonomic 위기. 독성의 예는 화학요법 치료이며, 이는 자율 신경세포에 독성 부작용이 있는 것으로 보고되었다2. 자율적 변성 및 하이퍼-내심성 모두 파킨슨병 또는 고혈압 신장 질환과 같은 질병을 유발하거나 동반할 수 있는 것으로 알려져있다3,4. 따라서, 연구를 수행하고 질병의 맥락에서 symN 생물학 및 결함의 메커니즘을 이해할 수있는 것은 신규하고 효과적인 치료의 검색에 도움이됩니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고 : H9 PHOX2B : GFP 기자 라인은 오 외19에의해 제공되었다 . 이 백서에 사용된 일부 qPCR 프라이머는 OriGene Technologies로부터 수득되었으며, 몇 가지 서열은 Frith 외20, 30에서,30수득하였다.

1. 접시 코팅, 미디어 준비 및 hPSC 유지 보수를위한 설정

  1. 접시 코팅
    1. 비트로넥틴(VTN) 코팅
      1. VTN 의 바이알을 완전히 해동될 때까지 37°C 의 수조에 넣고 완전히 섞어줍니다.
      2. 100mm 페트리 접시의 경우, 1x 인산완식염수(PBS) 7mL를 0.5 mg/mL VTN과 혼합하고, 접시에 VTN 용액을 추가하고, 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
    2. 지하 멤브레인 매트릭스 코팅
      1. 하룻밤 동안 4 °C에서 얼음에 지하 막 매트릭스 (재료 표 참조)의유리병을 해동.
      2. 6웰 플레이트 중 한 웰을 위해 2mL....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는 hPSC에서 symN을 생성하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 여기서 입증된 배양 조건은 이전에 발표된 프로토콜23,,24(도 1A)로부터피더프리 및 화학적으로 정의된 조건으로 개선되었다(도1B). 2개의 옵션이 제공되며, 하나는 20일 이내에 심즈를 만들고 다른 하나는 NCC를 확장하여 더 많은 셀을 생성한 다음 symN으로 분화할 수있습니다(그림 1B,옵션 1 및 2).

분화 된 세포의 symN 특성을 적절하게 모니터링하기 위해, PHOX2B-eGFP WA09 리포터 라인과 부모 WA09 PSCs 라인19. 모든 분화는 적어도 3개의 생물학적 반복에서 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 최근에 2개의 리뷰를 간행했습니다, 하나는 질병 모델링을 위한 hPSC 파생된 symn의 사용을토론하는 31 뿐만 아니라 유효한 분화 프로토콜22의심층적인 비교. 따라서 여기서는 관심 있는 연구원이 symN을 만드는 데 성공할 수 있도록 현재 프로토콜 문제 해결에 중점을 둡니다. 전체 분화 과정에서 건강한 분화 세포뿐만 아니라 일관된 데이터를 얻기 위해 모든 단계에서의 오염을 신중하게 제어해야합니다. 일상적인 hPSC 유지 보수에서, 마이코 플라즈마 테스트는 격주 또는 매월 수행해야합니다. 세포 선별이 10 일째에 수행되면 모든 배지에 항생제를 첨가하는 것이 매우 좋습니다. 분화를 시작하기 전과 후에 세포 형태를 확인하는 것도 중요합니다. 여기서는 몇 가지 중요한 체크포인트(그림 6A)를제안합니다. 첫째, 분화를 위한 이상적인 hPSC 콜로니는 작은 스파이크가 있는 밝고 매끄러운 가장.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 원고의 비판적 독서와 편집에 대한 하이디 울리히스에게 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100mm 세포 배양 접시Falcon353003
15mL 원뿔형 조직 배양 튜브VWR/Corning89039-664
24웰 조직 배양 플레이트Falcon353047
24웰 초저 부착 플레이트Corning07 200 601 및 07 200 602
5% CO2/20% O2 조직 배양 인큐베이터Thermo Fisher/Life TechnologiesHeracell VIOS 160i
50ml 원뿔형 조직 배양 튜브VWR/Corning89039-656
6웰 조직 배양 플레이트Costar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500세포 해리 솔루션
Anti-AP2a 항체Abcamab108311숙주: 토끼;1:400 희석
항-Ascl1 항체BD Pharmingen 556604숙주: 마우스 IgG1; 1:200 희석
항-CD49D 항체BioLegend304313숙주: 마우스 IgG1; 5 μ 100 &mu에 있는 l/백만 개의 세포; l 볼륨
안티 CD49D 항체 (isotype)BioLegend400125숙주 : 마우스 IgG1; 5 & 100 &mu에 있는 l/백만 개의 세포; l volume
DAPI dyeSigmaD95421:1000 희석
Anti-DBH 항체Immunostar22806숙주: 토끼; 1:500 희석
Anti-GFP 항체Abcamab13970숙주: Chicken; 1:1000 희석
Anti-HOXC9 항체Abcamab50839숙주: 마우스; 1:100 희석
Anti-NET1 항체MabNET17-1호스트: 마우스; 1:1000 희석
Anti-PRPH 항체Santa Cruz BiotechnologySC-377093/H0112호스트: 마우스 IgG2a; 1:200 희석
Anti-SOX10 항체Santa Cruz Biotechnologysc-365692호스트: 마우스 IgG1; 1:100 희석
Anti-TH 항체Pel-FreezP40101- 150호스트: 토끼; 1:500 희석
Ascorbic acidSigmaA8960-5G재고 농도: 100 mM
B27 보충제Thermo Fisher/Life Technologies12587-010재고 농도: 50x
BDNFR& D 시스템248-BD재고 농도 : 10 & g/mL
BMP4R& D Systems314-BP재고 농도: 6 mM
세포 계수기Thermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
세포 계수 챔버 슬라이드InvitrogenC10312
원심분리기Eppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423재고 농도: 6mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627재고 농도: 100mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018재고 농도: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057재고 농도: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 매체gibcoA15165-01
E8 매체gibcoA15169-01재고 농도: 1x
E8 supplementgibcoA15171-01재고 농도: 50x
EDTASigma ED2SS재고 농도: 0.5 M
전기생리학 플레이트(AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS 기계, Beckman CoulterCytoFLEX(FACS용)
FACS 기계, Beckman CoulterMoFlo Astrios EQ(분류용)
FACS 튜브(파란색 필터 캡)Falcon352235
FACS 튜브(흰색 캡)Falcon352063
태아 소 혈청 (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450재고 농도: 10 μ g/mL
GeltrexInvitrogenA1413202기저막 매트릭스; 재고 농도: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN)VWR/Corning47743-654재고 농도: 1 mg/mL
L-glutamineThermo Fisher/Gibco25030-081재고 농도: 200 mM
LN 탱크맞춤형 바이오 제닉 시스템V-1500AB
MEA 리더Axion BioSystemsMaestro Pro
마우스 라미닌 I (LM)R& D Systems3400-010-01재고 농도: 1 mg/mL
N2 보충제Thermo Fisher/Life Technologies17502-048재고 농도: 100x
Neurobasal mediumgibco21103-049재고 농도: 1x
NGFPeproTech450-01재고 농도: 25 μ g/mL
인산염 완충 식염수(PBS)Gibco14190-136재고 농도: 1x
폴리-L-오르니틴 브롬화 수소화물(PO)SigmaP3655재고 농도: 15mg/mL
프리모신(항생제)InvivoGenANTPM1재고 농도: 50mg/mL
qPCR 기계Bio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR 플레이트Bio-Rad LaboratoriesHSP9601
재조합 FGF2R& D Systems233-FB / CF재고 농도 : 10 & g/mL
레티노산시그마R2625재고 농도: 1mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614재고 농도: 10mM
Trypan blueCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700재고 농도: 0.5mg/mL
수조VWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254재고 농도: 10 mM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-ind....

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