Method Article

피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)는 시험관 내에서 인간 배아 발달의 질병 모델링 및 연구를위한 강력한 도구가되었습니다. 우리는 이전에 자율 신경 병증을 가진 환자에 적용된 교감 특성을 가진 자율 신경의 파생을 위한 분화 프로토콜을 제시했습니다. 그러나, 프로토콜은 녹아웃 세럼 교체(KSR) 및 피더 기반 배양 조건에 기초하여 구축되었으며, 높은 분화 효율을 보장하기 위해, 세포 선별이 필요하였다. 이러한 요인으로 인해 가변성이 높고 비용이 높으며 재현성이 낮습니다. 또한 전기 활성을 포함한 성숙한 교감 특성은 확인되지 않았습니다. 여기서는 피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건에서 PSC 배양 및 분화를 수행하는 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 트렁크 신경 문장을 식별하는 유전 마커가 식별됩니다. 세포 선별없이 20 일 후에 후 신경절 교감 뉴런으로의 추가 분화가 달성됩니다. 전기 생리학적 기록은 기능적 뉴런 정체성을 더 나타낸다. 우리의 분화 된 뉴런에서 검출 된 발사니코틴에 의해 강화 될 수 있으며 아드레날린 수용체 길항제 프로프라놀롤에 의해 억제 될 수있다. 이 프로토콜의 중간 교감 신경 전구체는 최대 2주 동안 신경 구형으로서 유지될 수 있으며, 이는 배양을 확장할 수 있게 한다. 요약하면, 우리의 업데이트 된 교감 신경 분화 프로토콜은 이전 버전에 비해 높은 분화 효율, 더 나은 재현성, 더 많은 유연성 및 더 나은 신경 성숙을 보여줍니다. 이 프로토콜은 자율 신경계에 영향을 미치는 인간의 장애를 연구하는 데 필요한 세포를 연구원에게 제공 할 것입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포스트 갱글리오닉 교감 뉴런 (symN)은 자율 신경계 (ANS)에 속하며 의식과 무관하게 신체의 항상성을 반응하고 조절하는 데 여러 가지 중요한 역할을합니다. 예를 들어, 스트레스는 심박수를 자극하고 심박수, 혈압 및 발한의 증가로 이어지는 전투 또는 비행 반응을 불러일으킵니다. SymN은 유전학, 독성/상해 또는 다른 질병의 동반자로 인해 여러 인간 장애에 영향을 받습니다. 유전 신경병증의 예로는 심민의 심한 dysregulation이 호흡 곤란을 일으키는 유년기 무질서 가족 성 Dysautonomia (FD)가 있습니다, 땀나기, 피부의 얼룩, 구토 발작, 고혈압 및불안에의해 명백한 dysautonomic 위기. 독성의 예는 화학요법 치료이며, 이는 자율 신경세포에 독성 부작용이 있는 것으로 보고되었다2. 자율적 변성 및 하이퍼-내심성 모두 파킨슨병 또는 고혈압 신장 질환과 같은 질병을 유발하거나 동반할 수 있는 것으로 알려져있다3,4. 따라서, 연구를 수행하고 질병의 맥락에서 symN 생물학 및 결함의 메커니즘을 이해할 수있는 것은 신규하고 효과적인 치료의 검색에 도움이됩니다.

해부학
말초 신경계는 감각 및 자율 분열로 나뉩니다. 감각 신경계의 구심성 신경은 고통과 접촉의 감각에 책임 있는 반면, ANS는 두뇌에 모든 기관에서 정보를 중계하는 책임이 있습니다. ANS는 장신경계로 나뉘어져 있으며, 위장관, 이완에 중요한 부교감 신경계, 장기의 활성화/조절에 중요한 교감신경계(SNS)로 나뉩니다. SNS는 2개의 뉴런시스템을5. 척수에 있는 Preganglionic 교감 신경 축은 교감 신경절에 첫번째 프로젝트, 포스트 ganglionic symN 세포 바디가 있는 곳에. 이 뉴런은 바디에 있는 각 기관의 표적 조직을 안쪽에 긴 투영을 보냅니다. preganglionic 뉴런에 의해 전송 되는 신호는 해, 반면 preganglionic symN은 아드레날린 이며 따라서 표현 노르 (NE) 그들의 주요 신경 전달 물질으로. 혈관을 자극하는 것을 포함하여 해인 포스트 갱글리오닉, 교감 신경의 몇몇 주목할 만한 예외가 있습니다. 아드레날린 성 후 신경 세포는 효소 티로신 하이드록실라제 (TH), 방향족 L 아미노산 데카르박실라제 (AAAD), 도파민 β-하이드록실라제 (DBH), 모노 아민 산화효소 (MAO-A)를 발현하며, 모두 NE를 생성하고 대사하는 역할을합니다. 또한, 그들은 NE 재활용 수송기 및 / 또는 수용체 α-아드레날린 수용체 (ADRA2), β-아드레날린 수용체 (ADR2B), 노르 에피네프린 수송기 (NET1) 및 부식모아민 수송기 (VMAT1/2)를 발현합니다.

개발
배아 발달 시 심멘은 신경관과 오버레이 ectoderm6사이에 나타나는 신경 문장(NC)으로부터 유래되며, 멜라닌세포, 조골세포, 지방세포, 글리아, 장뉴런, 감각 뉴런 및 자율 신경 7을 포함하는 다중 세포 계보로 분화할 수있다. 신경 문장 세포 (NCC)는 배아를 통해서 몇몇 경로를 취하는 높게 철새 세포입니다. NC 개발의 이 초기 단계에서, 세포는 마커 SNAIL1/2, FOXD3 및 SOX108,9,,10,11을표현한다.9, 그들이 채택하는 축 위치와 함께 마이그레이션 경로는 개발할 NC 하위 유형을 결정합니다. 이러한 NC 아류형은 그들의 특이적 HOX 유전자 발현에 의해 구별될 수 있다: 두개골 NCC는 HOX 유전자를 발현하지 않으며, vagal NCC는 HOX 1-5를 발현하고, 트렁크 NCC는 HOX 6-9를 발현하고, 성례 NCC는 HOX 10-1112를발현한다. 그 중, 트렁크 NcC는 symN의 주요 소스로 인식된다. SymN 전구체는 PHOX2B14 및 INSM115의발현을 촉진하는 전사 인자 MASH1/ASCL113을발현한다. 전사 요인의 GATA 가족은 늦은 동정 발달 도중 표현됩니다. GATA2 및 GATA3는 SymN으로 표현되며, 이 시공은 DBH16을활성화합니다. 전사 계수 HAND2는 DBH 및 TH17의발현 및 유지에도 중요하다.

HPSCs(예를 들어, 배아 및 유도 만능 줄기 세포)는 발달 패러다임을 재현하고 다양한 인간 장애의 질병 모델링에 사용될 수 있는 symN을 생성하는 강력한 도구18입니다. 따라서 hPSC에서 symN을 생성하는 동안 개발 지침을 따르고 분화 과정을 따라 적절한 마커의 발현을 평가하는 것이 중요합니다.

이전 symN 프로토콜
몇몇 연구 단은 이전에 hPSCs19,,20,,21에서symN의 생성을 보고했습니다. 이러한 프로토콜을 서로 직접 비교하고 최근22일검토했습니다. 2016년23년,우리는 symN 문자를 가진 자율 뉴런의 생성을 위한 분화프로토콜을 발표했다(도 1A). 이 프로토콜은 미분화 hPSCs 및 세포 분화의 유지보수에 사용된 KSR 기반 배지를 사용하였다. 더욱이, hPSCs는 마우스 배아 섬유아세포(MEF 피더 세포)에서 유지되었다. 우리는 무질서23를모델링하기 위하여 FD를 가진 환자에게서 이 프로토콜 및 PSCs를 이용했습니다. 2019년에는 이 이전 프로토콜24의보다 자세한 버전을 설명했습니다. 요약하면, 신경 운명은 TGF-β 및 BMP 신호화를 처음 2일 동안 차단하기 위해 이중 SMAD억제(25)에 의해 유도되었다. CHIR99021을 이용한 WNT 활성화는 신경 전구를 NC 세포로 승진시켰다. 11일째에, 세포는 CD49D+ 또는+ SOX10+ 인구26,,23에대한 FACS에 의해 분류되었고, 이는 약 40%의 NC 생성 효율을 산출하였다. 따라서, 다음 분화 단계에 대한 효율 및 순도를 보장하기 위해 선별이 필요했다. NFC는 FGF2 및 CHIR의 결합된 처리와 함께 스페로이드로서 유지 및 증폭되었다. 4일 후, NC 스페로이드를 도금하고 BDNF, GDNF 및 NGF를 부여하여 symN 성숙을 완료하였습니다. 이러한 symN은 ASCL1, TH, DBH 및 PHOX2A와 같은 강한 symN 마커를 발현했지만, 니코틴 아세틸콜린 수용체(CHRNA3/CHRNB4) 및 소포 수송기(VMAT1/2)의 발현을 포함하여 보다 성숙한 symn에 대한 마커는 70일 후에도 분화의 일후에도 낮았다. 이 프로토콜에서 HOX 유전자는 공식적으로 시험되지 않았고, 세포의 전기 생리활성을 포함한 성숙한 신경 특성은 확인되지 않았다.

여기서는 symN(그림1B)을생성하기 위해 최적화된 프로토콜을 제시합니다. HPSC는 에센셜 8(E8)미디어(27)를사용하여 비트로넥틴(VTN) 코팅 접시상에서 피더가 없는 조건에서 유지된다. 분화 매체의 공식은 각 단계에서 수정되어 NC인구(28)의비율을 증가시킨다. symN 성숙은 CD49D+/SOX10+ 정렬되거나 정렬되지 않은 대량 NCC 모집단에서 수행할 수 있습니다. 둘 다 30일까지 높은 수준의 symN 마커 식을 보여줍니다. 더욱이, 이 프로토콜로 생성된 symN은 전기 생리학적 기록 및 symN 활성제 및 억제제 화합물을 사용한 치료에 반응한다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고 : H9 PHOX2B : GFP 기자 라인은 오 외19에의해 제공되었다 . 이 백서에 사용된 일부 qPCR 프라이머는 OriGene Technologies로부터 수득되었으며, 몇 가지 서열은 Frith 외20, 30에서,30수득하였다.

1. 접시 코팅, 미디어 준비 및 hPSC 유지 보수를위한 설정

  1. 접시 코팅
    1. 비트로넥틴(VTN) 코팅
      1. VTN 의 바이알을 완전히 해동될 때까지 37°C 의 수조에 넣고 완전히 섞어줍니다.
      2. 100mm 페트리 접시의 경우, 1x 인산완식염수(PBS) 7mL를 0.5 mg/mL VTN과 혼합하고, 접시에 VTN 용액을 추가하고, 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
    2. 지하 멤브레인 매트릭스 코팅
      1. 하룻밤 동안 4 °C에서 얼음에 지하 막 매트릭스 (재료 표 참조)의유리병을 해동.
      2. 6웰 플레이트 중 한 웰을 위해 2mL의 DMEM/F12를 100x 지하 멤브레인 매트릭스 20μL과 혼합하고, 접시에 지하 멤브레인 매트릭스 용액을 추가하고, 파라핀 필름으로 접시를 감싸고, 밤새 4°C의 깨끗한 용기에 보관하십시오. 가능한 한 빨리 작업하십시오. 코팅 된 접시는 최대 2 주 동안 4 °C에 보관 할 수 있습니다.
    3. 폴리오니틴 (PO)/라미닌 (LM)/피브로넥틴 (FN) 코팅
      1. 첫날, 24개의 웰 플레이트 중 1개의 웰에 대해 PO 15 μg/mL을 1 mL의 1 mL과 혼합하고 37°C, 5%CO2에서 밤새 배양합니다. LM과 FN을 -20°C에서 하룻밤 동안 해동하고 완전히 해동될 때까지 4°C에서 보관합니다.
      2. 둘째 날에, 흡인 PO 용액은, 1x PBS로 우물 2x를 세척하고, LM의 2 μg/mL및 FN의 2 μg/mL를 포함하는 1 x PBS의 1 mL를 추가하고 5%CO2에서 37°C에서 밤새 배양한다. 이 시점에서 LM/FN 용액이 있는 접시는 건조하지 않는 한 몇 달 동안 인큐베이터에 보관할 수 있습니다. 접시가 마르지 않도록 1x PBS를 더 넣으세요.
  2. 미디어 준비
    1. 에센셜 8 배지(E8)를 E8 보충제 1병을 밤새 4°C에서 해동하여 준비합니다. 필요한 경우 E8 배지와 항생제 500 mL의 보충제를 섞으세요.
      참고: 작업 E8 솔루션은 2주 이내에 사용해야 합니다.
    2. 전체 E8 배지 90 mL과 10 mL의 DMSO를 혼합하여 총 부피를 100 mL로 혼합하여 hPSC 동결 매체를 준비합니다. 필터 살균.
    3. 10μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 및 10 μM Y27632와 100 mL의 총 부피를 혼합하여 100 mL의 필수 6(E6) 배지를 혼합하여 0일에서 1일 차분 매체를 준비합니다.
    4. 100 μM SB 및 0.75 μM CHIR99021과 100 mL의 총 부피를 혼합하여 10일째 10일 분화 매체를 준비한다.
    5. 10일~14일째스페로이드 배지를 B27(50x), N2 1mL(100x), 2 mM L-글루타메이트, 3 μM CHIR99021 및 100 mL의 총 부피에 대해 10 ng/mL FGF2와 신경기체 배지를 혼합하여 준비한다.
    6. 모든 수유에 대해 10일에서 14일째에 신선한 RA 0.5 μM을 추가하여 스페로이드 장기 유지를 위해 14일에서 28일째를 준비합니다.
      참고: RA는 항상 -80°C로 유지하십시오.
    7. Prepare the SymN maturation medium B27(50x), N2의 1 mL(100x), 2 mMM L-글루타메이트, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM 아스코르브산, 0.2 mM dbcAMP 총 부피 100 mL. 용액은 2 주 이내에 사용해야합니다. 각 수유 전에 0.125 μM의 신선한 RA를 추가합니다. 이 솔루션은 14일째(옵션 1) 또는 28일차(옵션 2)부터 사용됩니다.
    8. 총 부피에 필요한 경우 DMEM을 2% FBS, 2 mM L-글루타메이트 및 항생제와 혼합하여 FACS 완충액을 준비합니다.
  3. hPSC 유지 보수
    1. 해동 및 hPSCs 유지
      1. VTN 코팅 100mm 접시 를 준비합니다.
      2. 액체 질소에서 직접 hPSCs의 유리병을 해동하려면, 조심스럽게 해동 될 때까지 물에 튜브를 스윙, 37 ° C 수조에 유리병을 넣어. 해동된 hPSCs를 1x PBS의 10 mL을 함유하는 15 mL 튜브로 옮기고, 원심분리기를 200 x g에서 4분 동안 이송한다.
      3. 상급체를 버리고 튜브에 E8 배지 1 mL을 추가합니다. 피펫을 몇 번 완전히 다시 일시 중단한 다음 E8 배지의 9 mL을 추가하여 총 10 mL에 도달합니다.
      4. 100mm 접시에서 VTN 용액을 흡인합니다.
      5. hPSCs를 100mm 접시에 옮기고 부드럽게 흔들어서(위쪽과 왼쪽에서, 원이 아닌) 세포가 접시에 고르게 분포되도록 합니다.
      6. 37 °C에서 배양, 5 %CO2.
      7. 다음 날, 모든 매체를 흡인하고 E8의 10 mL로 공급하십시오.
      8. 다음 3-4 일 동안 매일 이 방법으로 먹이를 다음 분할 준비.
    2. 분할 hPSCs
      참고 : 분할 시점에서 hPSCs는 80 % - 90 % 유동해야합니다. 부드럽고 밝은 가장자리가있는 큰 식민지를 관찰해야합니다. 그러나, 각 식민지 사이의 접촉을 피해야한다(도 2B,일 0 및 도 6B).
      1. 필요에 따라 VTN 코팅 된 100mm 요리를 준비하십시오.
      2. E8을 흡인하고 1x PBS로 1x 분할해야하는 접시를 씻으하십시오.
      3. 1x PBS를 흡인하고 0.25 M EDTA의 4 mL을 추가합니다. 37 °C에서 2 분 동안 배양, 5 %CO2.
        참고: hPSC는 작은 콜로니로 분할/보충되어야 합니다. 단일 세포로의 분리를 방지하기 위해 EDTA로 2 분 이상 치료하지 마십시오. 세포는 2 분 처리 후 접시 표면에 여전히 부착되어야합니다.
      4. EDTA를 흡인하고, E8 배지 10 mL을 접시 표면에 강하게 피펫팅하여 콜로니를 분리하고, 15 mL 튜브에서 모든 배지 및 세포를 수집한다.
      5. hPSC에서 80%-90% 수렴, 분할 식민지 1:15-1:20. 예를 들어, hPSC를 1:20으로 100mm 접시로 분할하려면 500 μL의 E8/hPSCs 용액을 가지고 9.5 mL의 신선한 E8 배지와 혼합하십시오.
      6. VTN 코팅 100mm 접시에 접시 hPSCs.
        참고 : 각 연구자와 세포주에 대해 독립적으로 이상적인 분할 비율을 설정하는 것이 좋습니다.
    3. 동결 hPSCs
      1. 분할 할 준비가 된 hPSC의 100mm 접시 에 대해 3 개의 극저온 과 3.5 mL의 냉동 매체를 준비하십시오.
        참고: 용지와 바이알은 사용 전까지 4°C 또는 얼음 위에 보관해야 합니다.
      2. E8을 흡인하고 접시를 1x PBS로 2x 세척하십시오.
      3. 흡인 1x PBS 및 0.25 M EDTA의 4 mL를 추가하고, 37 °C에서 2 분 동안 배양하고, 5 %CO2에.
        참고: hPSC는 분할될 때 작은 콜로니로 동결되어야 합니다. 단일 세포로의 분리를 방지하기 위해 EDTA로 세포를 2 분 이상 치료하지 마십시오. 세포는 2 분 처리 후 접시의 표면에 여전히 부착해야합니다.
      4. EDTA를 흡인하고, 접시 표면에 10 mL의 10 mL을 강하게 피펫팅하여 식민지를 분리하고, 50 mL 튜브에 있는 모든 배지 및 세포를 수집한다.
      5. 나머지 EDTA를 씻어 4 분 동안 200 x g에서 1 x PBS및 원심 분리기의 20 mL를 추가합니다.
      6. 상급을 버리고 펠릿을 3 mL의 동결 매체로 다시 놓습니다.
      7. hPSC를 3개의 극저온에 균등하게 분배하여 각각 1mL씩 분배합니다.
      8. 밤새 -80°C에서 조절된 냉동 상자 또는 스티로폼 샌드위치에 보관하여 온도 가떨어뜨림을 방지한 다음 액체 질소 탱크로 옮겨 장기간 보관하십시오.

2. 분화를 시작하는 시딩 hPSCs (0 일)

참고: hPSC는 안정화된 후(즉, 해동 후 2~3배 분할됨) 차별화할 준비가 되어 있어야 합니다. 식민지가 건강하고, 매끄럽고 반짝이는 가장자리와 최소한의 분화(그림2B)를가지고 있어야 합니다.

  1. 필요에 따라 0일 전에 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 접시(24개의 우물 또는 6개의 잘 접시)를 준비합니다. 차별화가 시작될 때 RT로 요리를 가져오십시오.
  2. 필요에 따라 0-1 차별화 매체를 만듭니다.
  3. HPCS를 분할 할 준비가 된 Confluent에서 E8을 흡인하고 1 x PBS로 접시를 2 x 씻습니다.
  4. 100 mm 접시 당 0.25 M EDTA의 7 mL를 추가하고 37 °C, 5 % CO2에서15 분 동안 배양하십시오.
    참고: 이 시점에서, EDTA 처리는 단 하나 세포로 분산하기 위하여 머리말을 붙인다.
  5. 모든 hPSCs를 피펫 (그들은 부동해야한다) 50 mL 튜브로 전송합니다. EDTA 용액과 동일한 양 또는 1x PBS를 추가하여 EDTA를 희석시되더하십시오.
  6. 원심분리기 는 200 x g에서 4 분.
  7. 상급체를 버리고, 0-1 분화 배지 및 피펫을 첨가하여 세포를 균질화한다. 더 많은 배지를 첨가한 다음 혼합하여 세포 를 계산하기에 이상적인 농도로 세포 용액을 희석시다.
    참고: 세포 용액을 과도하게 희석하지 마십시오. 하나의 전체 100mm 접시에서 세포는 시작 매체의 5 mL에 희석되어야한다.
  8. 자동화된 셀 카운터 또는 혈세포계를 사용하여 셀 번호를 계산합니다.
  9. 낮은 최종 부피에서 125,000 셀/cm2에 도달하기 위해 필요에 따라 세포 용액을 희석하십시오 (예 : 6 웰 접시에 대해 잘 당 2 mL 또는 24 웰 접시에 대해 잘 당 500 μL).
    참고: 볼륨이 낮을수록 셀이 더 빨리 부착됩니다.
  10. 코팅 된 접시에서 지하 막 매트릭스 용액을 모두 흡인하고 셀 용액을 우물에 플레이트합니다.
  11. 37 °C에서 배양, 5 %CO2.

3. 신경 문장 세포 유도 (1 일째부터 10 일째, 그림 2A)

  1. 1일째에 0-1 분화 배지로 세포를 먹이세요(잘 6가지 요리는 잘 당 3 mL, 잘 요리는 24개에 1mL).
  2. 2일째에는 세포에 2일째-10일 분화 배지(잘 6개의 잘 요리에는 3 mL, 24개의 웰 접시에는 1mL)를 공급합니다.
  3. 지금부터, 세포는 10 일까지 격일로 공급되어야합니다 (즉, 다음 먹이 날은 4 일째가 될 것입니다).
    참고: 6일째부터 NC 능선이 감지되어야합니다(그림 2B). 분화가 일어나고 있는지 확인하기 위해, SOX10/AP2a에 대해 염색될 수 있고 분화의 시간에 따라 마커 유전자 발현에 사용될 수 있는 작은 웰(즉, 24웰)에서 병렬 분화 배양을 수행하는 것이좋습니다(도 2B,C).
  4. 셀을 정렬하는 경우 섹션 4로 진행합니다. 그렇지 않으면 섹션 5로 진행합니다.

4. 신경 문장 마커 CD49D를 위한 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 및 스페로이드에 있는 NC 세포를 응집하는

참고 : FACS 정렬의 경우, 샘플은 얼음에 보관하고 정렬 할 때까지 염색 후 빛에 노출되지 않아야합니다.

  1. 셀이 정렬된 경우 FACS 버퍼를 준비합니다.
  2. 10-14일 스페로이드 배지를 준비합니다.
  3. 10일째에 배지를 제거하고 1x PBS로 1x를 세척합니다.
  4. 해리 액 (재료 표참조)을 잘 당 2 mL에서 6 개의 잘 접시 또는 24 웰 접시에 대해 잘 당 1 mL를 추가하고 37 °C에서 배양하고 20 분 동안 5 % CO2로 배양하십시오.
  5. 모든 hPSCs를 파이펫하고 50 mL 튜브로 옮김을 합니다.
  6. FACS 버퍼와 원심분리기를 200 x g에서 4분 동안 튜브의 나머지 부분을 채웁니다.
    참고: 각 50 mL 튜브는 최대 20 mL 이하의 셀 용액을 수용할 수 있습니다. FACS 버퍼의 부피는 해리 솔루션을 중화할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다.
  7. 상판을 버리고, 적절한 양의 FACS 버퍼(6웰 플레이트당 ~2 mL)로 세포를 재중단하고 셀 수를 결정합니다.
  8. 다음 샘플을 준비합니다.
    1. 샘플 1 (얼룩지지 않은 대조군): FACS 버퍼의 400 μL에서 1 x 106 세포. 20 μm 스트레이너 캡을 통해 세포를 필터링하고 얼음에 튜브를 유지합니다.
    2. 샘플 2(DAPI 전용 대조군): 0.5 ug/mL DAPI를 함유하는 FACS 버퍼의 400 μL에서 1 x 106 세포. 스트레이너 캡으로 FACS 튜브를 통해 세포를 필터링하고 튜브를 얼음 위에 유지하십시오.
    3. 샘플 3 (CD49d 표지): PE/Cy7-컨쥬게이션 CD49D 항체(FACS 버퍼100 μL당 100 μL당 5 μL 6 세포에 대해 5 μL)를 함유한 FACS 버퍼로 나머지 세포를 15 mL 튜브에 중단하고 20 분 동안 얼음에 배양합니다.
  9. FACS 버퍼와 원심분리기를 200 x g에서 4분 동안 튜브를 채웁니다.
  10. 상급을 버리고 제조업체의 지침에 따라 0.5 ug/mL DAPI를 포함하는 FACS 버퍼 1mL에 5-10 x 106 셀을 다시 일시 중단하십시오.
  11. 스트레이너 캡으로 FACS 튜브를 통해 세포를 필터링하고 튜브를 얼음 위에 유지합니다.
  12. FACS 버퍼 의 2 mL을 포함하는 수집 FACS 튜브를 준비합니다.
  13. DAPI 및 PE-Cy7을 감지하여 CD49D+ 모집단을 분리할 수 있는 레이저로 FACS 기계를 정렬합니다.
  14. 정렬 후 정렬된 셀을 세습니다.
  15. 모든 분류된 세포를 10-14일 동안 재중단하여 배지의 500 μL당 0.5 x 106세포의 최종 농도로 재중단한다.
  16. 플레이트 0.5 x 106 셀을 초저 부착 24 웰 플레이트에 잘 넣습니다.
  17. 37 °C에서 세포를 배양, 5 %CO2.

5. 스페로이드에 있는 NC 세포를 집합하기

  1. FACS를 사용하여 NC 세포를 분리하고 대신 스페로이드로 직접 집계하지 않는 경우, 먼저 단계 4.2-4.5에 설명된 대로 세포를 준비합니다.
  2. 튜브의 나머지 부분을 1x PBS로 채우고 원심 분리기를 200 x g에서 4 분 동안 채웁니다.
  3. 상판을 버리고, 적당한 양의 10-14스페로이드 배지(예를 들어, 6웰 플레이트에 대해 웰당 배지의 ~2 mL)로 세포를 재중단하고, 세포 수를 결정하기 위해 카운트한다.
  4. 10-14일 동안 세포를 희석하여 배지 500 μL당 0.5 x 106세포로 희석하였다.
  5. 초저 부착 24 웰 플레이트에서 웰당 셀 현탁액의 플레이트 500 μL.
  6. 37 °C에서 세포를 배양, 5 %CO2.

6. NC 스페로이드 유지 보수 및 교감 선조 유도 (10 일째부터 14 일, 그림 4A)

  1. 옵션 1: 최소한의 스페로이드 배양
    1. 11일째에는 10일부터 기존 배지를 흡인하지 않고 NC 스페로이드에 10-14일의 500 μL을 첨가합니다. 37 °C에서 배양, 5 %CO2.
    2. 12일째, 플레이트를 기울여 우물 한쪽에 NC 스페로이드를 축적합니다. 조심스럽게 흡입하고 가능한 한 많은 매체를 폐기하고 10-14 스페로이드 배지의 1 mL로 먹이십시오.
    3. 14일까지 매일 세포에 먹이를 주십시오.
    4. 선택 사항: 스페로이드가 응집되어 큰 덩어리를 생성하는 경우 파이펫을 사용하여 스페로이드 덩어리를 부수게 합니다. 이것은 또한 개별 스페로이드가 너무 커지지 않도록 합니다.
      참고: 이상적인 스페로이드 크기 범위는 약 100-500 μm이어야 합니다. 그 범위 내에서, 개별 스페로이드의 크기는 중요하지 않습니다. 그러나 매끄럽고 선명한 가장자리와 같은형태(그림 3 및 그림 6)는추가 성공을 위해 중요합니다. 14일째에, 각 24웰 플레이트는 이상적으로 위에서 언급한 크기 범위 내에서 서로 다른 크기의 약 50-60개의 스페로이드를 함유하고 있습니다.
  2. 옵션 2: 확장된 스페로이드 배양
    1. 15일째, NC 스페로이드를 유지하기 위해, 0.5 μM RA를 함유하는 10-14일의 1.5 mL로 사료한다. 37 °C, 5 %CO2에서배양.
      참고: RA는 모든 수유에 신선하고 항상 -80°C에 보관해야 합니다.
    2. 지금부터, 매일 28까지 먹이를 다음 스페로이드의 도금 (섹션 7.1)을 계속.
      참고 : 성장하는 스페로이드는 1 mL 파이펫으로 파이펫을 만들어 일주일에 약 1 배나 분할됩니다. 대략 1:2-1:4의 비율로 분할됩니다. 2 주 확장 기간 내에서, 세포는 대략 숫자에서 네 배가되어야한다.

7. SymN 분화 및 성숙 (옵션 1 : 14 일 후; 옵션 2: 28일 이후)

  1. 일반 요리에 도금 스페로이드
    1. PO/LM/FM 코팅 24웰 플레이트를 준비합니다.
    2. 0.125 μM RA(모든 사료에 신선한 첨가)와 10 μM Y27632(14일째만)를 포함하는 symN 배지를 준비합니다.
    3. 14일째, 플레이트를 기울여 우물 한쪽에 NC 스페로이드를 축적합니다. 가능한 한 많은 배지를 조심스럽게 흡인하고 폐기하고 1 mL의 symN 배지로 공급하십시오.
    4. 코팅된 플레이트에서 LM/FN을 제거합니다.
    5. 24 웰 플레이트에서 각각 잘 분할하고 플레이트하여 4 개의 새로운 웰, 코팅 된 24 웰 플레이트로 분리합니다. 각 원래 우물은 ~ 50-60 스페로이드를 포함하는 1 mL을해야합니다. 이것은 250 μL을 산출하고, 새로운 판에 각 우물에 대해 대략 10-15 개의 스페로이드를 함유합니다.
    6. 웰 당 250 μL의 추가 매체를 추가하십시오.
      참고: 이것은 1:4의 분할입니다. 분할이 상대적으로 균일하게 되도록 용액 내에 스페로이드가 제대로 분포되어 있는지 확인하십시오. 최종 숫자는 symN 생성 성공에 영향을 미치지 않으므로 스페로이드 수는 계산되지 않습니다.
    7. 37 °C, 5 %CO2에서배양.
    8. 15일째(또는 옵션 2의 경우 29일째)에는 모든 배지를 0.125 μM RA를 포함하는 1 mL의 symN 배지로 대체하여 사료를 공급합니다. 지금부터, 뉴런은 20 일 (또는 옵션 2의 경우 35 일째)까지 2 일마다 공급되어야합니다.
    9. 20일(또는 옵션 2의 경우 35일째) 후, 뉴런은 기존 배지(500 μL)의 절반만 신중하게 대체하여 공급되어야 합니다. 이제부터는 매체가 빠르게 노란색으로 바뀌지 않는 한 매주 먹이를 주어 보시면 됩니다.
    10. 원하는 시간까지 매주 먹이를 유지하십시오.
      참고: 심민은 중추와 같은 구조로 집계되는 경향이 있으며 문화 요리에서 분리되기 쉽습니다. 이를 방지하기 위해 반수유와 최소한의 취급을 권장합니다.
  2. 전기 생리학 기록을 위한 도금 전지
    1. PO / LM / FM 코팅 96 잘 전기 생리 판을 준비합니다.
    2. 0.125 μM RA(모든 사료에 신선한 첨가)와 10 μM Y27632(14일째만)를 포함하는 symN 배지를 준비합니다.
    3. 14일째에는 모든 스페로이드를 수집한 다음 200 x g에서 4분 동안 원심분리합니다.
    4. 상판을 버리고 2 mL의 해리 액을 추가하고 혼합물을 초저 부착 판의 우물 중 하나에 다시 옮니다. 37°C에서 배양하고, 20-45분 동안 5%CO2로 배양한다.
      참고 : 스페로이드의 크기에 따라 해리 기간은 20 분 이상 일 수 있습니다. 세포의 해리를 10 분마다 최대 45 분까지 확인하십시오. 선택적으로, DNase의 0.1 mg / mL은 죽은 세포가 죽은 세포에서 자유 DNA를 방지하여 용액을 끈적 거리는 것을 방지할 수 있습니다. 스페로이드가 완전히 해리되면 집계되지 않기 때문에 이 프로토콜에서는 선택 사항입니다.
    5. 피펫을 완전히 분리한 다음 200 x g에서 4 분 동안 원심 분리합니다.
    6. 상급체를 버리고 적절한 양의 symN 배지로 셀을 다시 일시 중단하고 셀 수를 계산합니다.
    7. PO/LM/FN 코팅 전기 생리학 우물에서 100,000/cm2로 세포를 플레이트하여 웰당 총 부피 200μL을 플레이트합니다.
    8. 15일째(또는 옵션 2의 경우 29일째)에는 섹션 7.1과 동일한 수유 과정을 따르십시오. 15일 이후의 총 부피(또는 옵션 2의 경우 29일)는 웰당 300 μL이어야 합니다.
    9. 20일 이후(또는 옵션 2의 경우 35일) 이후 다중 전극 어레이 기계를 사용하여 전기 신호를 측정합니다.
      참고: 옵션 2에서는 14일부터 28일까지 언제든지 스페로이드를 도금할 수 있습니다. 첫 번째 전기 신호 측정은 스페로이드를 도금한 후 1주일 후에 수행될 수 있습니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는 hPSC에서 symN을 생성하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 여기서 입증된 배양 조건은 이전에 발표된 프로토콜23,,24(도 1A)로부터피더프리 및 화학적으로 정의된 조건으로 개선되었다(도1B). 2개의 옵션이 제공되며, 하나는 20일 이내에 심즈를 만들고 다른 하나는 NCC를 확장하여 더 많은 셀을 생성한 다음 symN으로 분화할 수있습니다(그림 1B,옵션 1 및 2).

분화 된 세포의 symN 특성을 적절하게 모니터링하기 위해, PHOX2B-eGFP WA09 리포터 라인과 부모 WA09 PSCs 라인19. 모든 분화는 적어도 3개의 생물학적 반복에서 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 최근에 2개의 리뷰를 간행했습니다, 하나는 질병 모델링을 위한 hPSC 파생된 symn의 사용을토론하는 31 뿐만 아니라 유효한 분화 프로토콜22의심층적인 비교. 따라서 여기서는 관심 있는 연구원이 symN을 만드는 데 성공할 수 있도록 현재 프로토콜 문제 해결에 중점을 둡니다. 전체 분화 과정에서 건강한 분화 세포뿐만 아니라 일관된 데이터를 얻기 위해 모든 단계에서의 오염을 신중하게 제어해야합니다. 일상적인 hPSC 유지 보수에서, 마이코 플라즈마 테스트는 격주 또는 매월 수행해야합니다. 세포 선별이 10 일째에 수행되면 모든 배지에 항생제를 첨가하는 것이 매우 좋습니다. 분화를 시작하기 전과 후에 세포 형태를 확인하는 것도 중요합니다. 여기서는 몇 가지 중요한 체크포인트(그림 6A)를제안합니다. 첫째, 분화를 위한 이상적인 hPSC 콜로니는 작은 스파이크가 있는 밝고 매끄러운 가장...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 원고의 비판적 독서와 편집에 대한 하이디 울리히스에게 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100mm 세포 배양 접시Falcon353003
15mL 원뿔형 조직 배양 튜브VWR/Corning89039-664
24웰 조직 배양 플레이트Falcon353047
24웰 초저 부착 플레이트Corning07 200 601 및 07 200 602
5% CO2/20% O2 조직 배양 인큐베이터Thermo Fisher/Life TechnologiesHeracell VIOS 160i
50ml 원뿔형 조직 배양 튜브VWR/Corning89039-656
6웰 조직 배양 플레이트Costar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500세포 해리 솔루션
Anti-AP2a 항체Abcamab108311숙주: 토끼;1:400 희석
항-Ascl1 항체BD Pharmingen 556604숙주: 마우스 IgG1; 1:200 희석
항-CD49D 항체BioLegend304313숙주: 마우스 IgG1; 5 μ 100 &mu에 있는 l/백만 개의 세포; l 볼륨
안티 CD49D 항체 (isotype)BioLegend400125숙주 : 마우스 IgG1; 5 & 100 &mu에 있는 l/백만 개의 세포; l volume
DAPI dyeSigmaD95421:1000 희석
Anti-DBH 항체Immunostar22806숙주: 토끼; 1:500 희석
Anti-GFP 항체Abcamab13970숙주: Chicken; 1:1000 희석
Anti-HOXC9 항체Abcamab50839숙주: 마우스; 1:100 희석
Anti-NET1 항체MabNET17-1호스트: 마우스; 1:1000 희석
Anti-PRPH 항체Santa Cruz BiotechnologySC-377093/H0112호스트: 마우스 IgG2a; 1:200 희석
Anti-SOX10 항체Santa Cruz Biotechnologysc-365692호스트: 마우스 IgG1; 1:100 희석
Anti-TH 항체Pel-FreezP40101- 150호스트: 토끼; 1:500 희석
Ascorbic acidSigmaA8960-5G재고 농도: 100 mM
B27 보충제Thermo Fisher/Life Technologies12587-010재고 농도: 50x
BDNFR& D 시스템248-BD재고 농도 : 10 & g/mL
BMP4R& D Systems314-BP재고 농도: 6 mM
세포 계수기Thermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
세포 계수 챔버 슬라이드InvitrogenC10312
원심분리기Eppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423재고 농도: 6mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627재고 농도: 100mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018재고 농도: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057재고 농도: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 매체gibcoA15165-01
E8 매체gibcoA15169-01재고 농도: 1x
E8 supplementgibcoA15171-01재고 농도: 50x
EDTASigma ED2SS재고 농도: 0.5 M
전기생리학 플레이트(AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS 기계, Beckman CoulterCytoFLEX(FACS용)
FACS 기계, Beckman CoulterMoFlo Astrios EQ(분류용)
FACS 튜브(파란색 필터 캡)Falcon352235
FACS 튜브(흰색 캡)Falcon352063
태아 소 혈청 (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450재고 농도: 10 μ g/mL
GeltrexInvitrogenA1413202기저막 매트릭스; 재고 농도: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN)VWR/Corning47743-654재고 농도: 1 mg/mL
L-glutamineThermo Fisher/Gibco25030-081재고 농도: 200 mM
LN 탱크맞춤형 바이오 제닉 시스템V-1500AB
MEA 리더Axion BioSystemsMaestro Pro
마우스 라미닌 I (LM)R& D Systems3400-010-01재고 농도: 1 mg/mL
N2 보충제Thermo Fisher/Life Technologies17502-048재고 농도: 100x
Neurobasal mediumgibco21103-049재고 농도: 1x
NGFPeproTech450-01재고 농도: 25 μ g/mL
인산염 완충 식염수(PBS)Gibco14190-136재고 농도: 1x
폴리-L-오르니틴 브롬화 수소화물(PO)SigmaP3655재고 농도: 15mg/mL
프리모신(항생제)InvivoGenANTPM1재고 농도: 50mg/mL
qPCR 기계Bio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR 플레이트Bio-Rad LaboratoriesHSP9601
재조합 FGF2R& D Systems233-FB / CF재고 농도 : 10 & g/mL
레티노산시그마R2625재고 농도: 1mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614재고 농도: 10mM
Trypan blueCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700재고 농도: 0.5mg/mL
수조VWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254재고 농도: 10 mM

References

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