피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화

포스트 갱글리오닉 교감 뉴런 (symN)은 자율 신경계 (ANS)에 속하며 의식과 무관하게 신체의 항상성을 반응하고 조절하는 데 여러 가지 중요한 역할을합니다. 예를 들어, 스트레스는 심박수를 자극하고 심박수, 혈압 및 발한의 증가로 이어지는 전투 또는 비행 반응을 불러일으킵니다. SymN은 유전학, 독성/상해 또는 다른 질병의 동반자로 인해 여러 인간 장애에 영향을 받습니다. 유전 신경병증의 예로는 심민의 심한 dysregulation이 호흡 곤란을 일으키는 유년기 무질서 가족 성 Dysautonomia (FD)가 있습니다, 땀나기, 피부의 얼룩, 구토 발작, 고혈압 및^불안에의해 명백한 dysautonomic 위기. 독성의 예는 화학요법 치료이며, 이는 자율 신경세포에 독성 부작용이 있는 것으로 보고되었다^2. 자율적 변성 및 하이퍼-내심성 모두 파킨슨병 또는 고혈압 신장 질환과 같은 질병을 유발하거나 동반할 수 있는 것으로 알려져^있다3,4. 따라서, 연구를 수행하고 질병의 맥락에서 symN 생물학 및 결함의 메커니즘을 이해할 수있는 것은 신규하고 효과적인 치료의 검색에 도움이됩니다.

해부학
말초 신경계는 감각 및 자율 분열로 나뉩니다. 감각 신경계의 구심성 신경은 고통과 접촉의 감각에 책임 있는 반면, ANS는 두뇌에 모든 기관에서 정보를 중계하는 책임이 있습니다. ANS는 장신경계로 나뉘어져 있으며, 위장관, 이완에 중요한 부교감 신경계, 장기의 활성화/조절에 중요한 교감신경계(SNS)로 나뉩니다. SNS는 2개의 뉴런^시스템을5. 척수에 있는 Preganglionic 교감 신경 축은 교감 신경절에 첫번째 프로젝트, 포스트 ganglionic symN 세포 바디가 있는 곳에. 이 뉴런은 바디에 있는 각 기관의 표적 조직을 안쪽에 긴 투영을 보냅니다. preganglionic 뉴런에 의해 전송 되는 신호는 해, 반면 preganglionic symN은 아드레날린 이며 따라서 표현 노르 (NE) 그들의 주요 신경 전달 물질으로. 혈관을 자극하는 것을 포함하여 해인 포스트 갱글리오닉, 교감 신경의 몇몇 주목할 만한 예외가 있습니다. 아드레날린 성 후 신경 세포는 효소 티로신 하이드록실라제 (TH), 방향족 L 아미노산 데카르박실라제 (AAAD), 도파민 β-하이드록실라제 (DBH), 모노 아민 산화효소 (MAO-A)를 발현하며, 모두 NE를 생성하고 대사하는 역할을합니다. 또한, 그들은 NE 재활용 수송기 및 / 또는 수용체 α-아드레날린 수용체 (ADRA2), β-아드레날린 수용체 (ADR2B), 노르 에피네프린 수송기 (NET1) 및 부식모아민 수송기 (VMAT1/2)를 발현합니다.

개발
배아 발달 시 심멘은 신경관과 오버레이 ectoderm⁶사이에 나타나는 신경 문장(NC)으로부터 유래되며, 멜라닌세포, 조골세포, 지방세포, 글리아, 장뉴런, 감각 뉴런 및 자율 신경 7을 포함하는 다중 세포 계보로 분화할 수^있다. 신경 문장 세포 (NCC)는 배아를 통해서 몇몇 경로를 취하는 높게 철새 세포입니다. NC 개발의 이 초기 단계에서, 세포는 마커 SNAIL1/2, FOXD3 및 SOX10^{8,9,,10,11을}표현한다.^9, 그들이 채택하는 축 위치와 함께 마이그레이션 경로는 개발할 NC 하위 유형을 결정합니다. 이러한 NC 아류형은 그들의 특이적 HOX 유전자 발현에 의해 구별될 수 있다: 두개골 NCC는 HOX 유전자를 발현하지 않으며, vagal NCC는 HOX 1-5를 발현하고, 트렁크 NCC는 HOX 6-9를 발현하고, 성례 NCC는 HOX 10-11^12를발현한다. 그 중, 트렁크 NcC는 symN의 주요 소스로 인식된다. SymN 전구체는 PHOX2B¹⁴ 및 INSM1^15의발현을 촉진하는 전사 인자 MASH1/ASCL1^13을발현한다. 전사 요인의 GATA 가족은 늦은 동정 발달 도중 표현됩니다. GATA2 및 GATA3는 SymN으로 표현되며, 이 시공은 DBH^16을활성화합니다. 전사 계수 HAND2는 DBH 및 TH^17의발현 및 유지에도 중요하다.

HPSCs(예를 들어, 배아 및 유도 만능 줄기 세포)는 발달 패러다임을 재현하고 다양한 인간 장애의 질병 모델링에 사용될 수 있는 symN을 생성하는 강력한 도구^18입니다. 따라서 hPSC에서 symN을 생성하는 동안 개발 지침을 따르고 분화 과정을 따라 적절한 마커의 발현을 평가하는 것이 중요합니다.

이전 symN 프로토콜
몇몇 연구 단은 이전에 hPSCs^{19,,20,,21에서}symN의 생성을 보고했습니다. 이러한 프로토콜을 서로 직접 비교하고 최근^22일검토했습니다. 2016년^23년,우리는 symN 문자를 가진 자율 뉴런의 생성을 위한 분화프로토콜을 발표했다(도 1A). 이 프로토콜은 미분화 hPSCs 및 세포 분화의 유지보수에 사용된 KSR 기반 배지를 사용하였다. 더욱이, hPSCs는 마우스 배아 섬유아세포(MEF 피더 세포)에서 유지되었다. 우리는 무질서^23를모델링하기 위하여 FD를 가진 환자에게서 이 프로토콜 및 PSCs를 이용했습니다. 2019년에는 이 이전 프로토콜^24의보다 자세한 버전을 설명했습니다. 요약하면, 신경 운명은 TGF-β 및 BMP 신호화를 처음 2일 동안 차단하기 위해 이중 SMAD^{억제(25)에} 의해 유도되었다. CHIR99021을 이용한 WNT 활성화는 신경 전구를 NC 세포로 승진시켰다. 11일째에, 세포는 CD49D+ 또는⁺ SOX10⁺ 인구^26,,23에대한 FACS에 의해 분류되었고, 이는 약 40%의 NC 생성 효율을 산출하였다. 따라서, 다음 분화 단계에 대한 효율 및 순도를 보장하기 위해 선별이 필요했다. NFC는 FGF2 및 CHIR의 결합된 처리와 함께 스페로이드로서 유지 및 증폭되었다. 4일 후, NC 스페로이드를 도금하고 BDNF, GDNF 및 NGF를 부여하여 symN 성숙을 완료하였습니다. 이러한 symN은 ASCL1, TH, DBH 및 PHOX2A와 같은 강한 symN 마커를 발현했지만, 니코틴 아세틸콜린 수용체(CHRNA3/CHRNB4) 및 소포 수송기(VMAT1/2)의 발현을 포함하여 보다 성숙한 symn에 대한 마커는 70일 후에도 분화의 일후에도 낮았다. 이 프로토콜에서 HOX 유전자는 공식적으로 시험되지 않았고, 세포의 전기 생리활성을 포함한 성숙한 신경 특성은 확인되지 않았다.

여기서는 symN(그림1B)을생성하기 위해 최적화된 프로토콜을 제시합니다. HPSC는 에센셜 8(E8)^{미디어(27)를}사용하여 비트로넥틴(VTN) 코팅 접시상에서 피더가 없는 조건에서 유지된다. 분화 매체의 공식은 각 단계에서 수정되어 NC^{인구(28)의}비율을 증가시킨다. symN 성숙은 CD49D⁺/SOX10⁺ 정렬되거나 정렬되지 않은 대량 NCC 모집단에서 수행할 수 있습니다. 둘 다 30일까지 높은 수준의 symN 마커 식을 보여줍니다. 더욱이, 이 프로토콜로 생성된 symN은 전기 생리학적 기록 및 symN 활성제 및 억제제 화합물을 사용한 치료에 반응한다.

참고 : H9 PHOX2B : GFP 기자 라인은 오 외^19에의해 제공되었다 . 이 백서에 사용된 일부 qPCR 프라이머는 OriGene Technologies로부터 수득되었으며, 몇 가지 서열은 Frith 외^{20, 30에서,30}수득하였다.

1. 접시 코팅, 미디어 준비 및 hPSC 유지 보수를위한 설정

1. 접시 코팅
   1. 비트로넥틴(VTN) 코팅
      1. VTN 의 바이알을 완전히 해동될 때까지 37°C 의 수조에 넣고 완전히 섞어줍니다.
      2. 100mm 페트리 접시의 경우, 1x 인산완식염수(PBS) 7mL를 0.5 mg/mL VTN과 혼합하고, 접시에 VTN 용액을 추가하고, 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 지하 멤브레인 매트릭스 코팅
      1. 하룻밤 동안 4 °C에서 얼음에 지하 막 매트릭스 (재료 표 참조)의유리병을 해동.
      2. 6웰 플레이트 중 한 웰을 위해 2mL의 DMEM/F12를 100x 지하 멤브레인 매트릭스 20μL과 혼합하고, 접시에 지하 멤브레인 매트릭스 용액을 추가하고, 파라핀 필름으로 접시를 감싸고, 밤새 4°C의 깨끗한 용기에 보관하십시오. 가능한 한 빨리 작업하십시오. 코팅 된 접시는 최대 2 주 동안 4 °C에 보관 할 수 있습니다.
   3. 폴리오니틴 (PO)/라미닌 (LM)/피브로넥틴 (FN) 코팅
      1. 첫날, 24개의 웰 플레이트 중 1개의 웰에 대해 PO 15 μg/mL을 1 mL의 1 mL과 혼합하고 37°C, 5%_CO2에서 밤새 배양합니다. LM과 FN을 -20°C에서 하룻밤 동안 해동하고 완전히 해동될 때까지 4°C에서 보관합니다.
      2. 둘째 날에, 흡인 PO 용액은, 1x PBS로 우물 2x를 세척하고, LM의 2 μg/mL및 FN의 2 μg/mL를 포함하는 1 x PBS의 1 mL를 추가하고 5%_CO2에서 37°C에서 밤새 배양한다. 이 시점에서 LM/FN 용액이 있는 접시는 건조하지 않는 한 몇 달 동안 인큐베이터에 보관할 수 있습니다. 접시가 마르지 않도록 1x PBS를 더 넣으세요.
2. 미디어 준비
   1. 에센셜 8 배지(E8)를 E8 보충제 1병을 밤새 4°C에서 해동하여 준비합니다. 필요한 경우 E8 배지와 항생제 500 mL의 보충제를 섞으세요.
      참고: 작업 E8 솔루션은 2주 이내에 사용해야 합니다.
   2. 전체 E8 배지 90 mL과 10 mL의 DMSO를 혼합하여 총 부피를 100 mL로 혼합하여 hPSC 동결 매체를 준비합니다. 필터 살균.
   3. 10μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 및 10 μM Y27632와 100 mL의 총 부피를 혼합하여 100 mL의 필수 6(E6) 배지를 혼합하여 0일에서 1일 차분 매체를 준비합니다.
   4. 100 μM SB 및 0.75 μM CHIR99021과 100 mL의 총 부피를 혼합하여 10일째 10일 분화 매체를 준비한다.
   5. 10일~14일째스페로이드 배지를 B27(50x), N2 1mL(100x), 2 mM L-글루타메이트, 3 μM CHIR99021 및 100 mL의 총 부피에 대해 10 ng/mL FGF2와 신경기체 배지를 혼합하여 준비한다.
   6. 모든 수유에 대해 10일에서 14일째에 신선한 RA 0.5 μM을 추가하여 스페로이드 장기 유지를 위해 14일에서 28일째를 준비합니다.
      참고: RA는 항상 -80°C로 유지하십시오.
   7. Prepare the SymN maturation medium B27(50x), N2의 1 mL(100x), 2 mMM L-글루타메이트, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM 아스코르브산, 0.2 mM dbcAMP 총 부피 100 mL. 용액은 2 주 이내에 사용해야합니다. 각 수유 전에 0.125 μM의 신선한 RA를 추가합니다. 이 솔루션은 14일째(옵션 1) 또는 28일차(옵션 2)부터 사용됩니다.
   8. 총 부피에 필요한 경우 DMEM을 2% FBS, 2 mM L-글루타메이트 및 항생제와 혼합하여 FACS 완충액을 준비합니다.
3. hPSC 유지 보수
   1. 해동 및 hPSCs 유지
      1. VTN 코팅 100mm 접시 를 준비합니다.
      2. 액체 질소에서 직접 hPSCs의 유리병을 해동하려면, 조심스럽게 해동 될 때까지 물에 튜브를 스윙, 37 ° C 수조에 유리병을 넣어. 해동된 hPSCs를 1x PBS의 10 mL을 함유하는 15 mL 튜브로 옮기고, 원심분리기를 200 x g에서 4분 동안 이송한다.
      3. 상급체를 버리고 튜브에 E8 배지 1 mL을 추가합니다. 피펫을 몇 번 완전히 다시 일시 중단한 다음 E8 배지의 9 mL을 추가하여 총 10 mL에 도달합니다.
      4. 100mm 접시에서 VTN 용액을 흡인합니다.
      5. hPSCs를 100mm 접시에 옮기고 부드럽게 흔들어서(위쪽과 왼쪽에서, 원이 아닌) 세포가 접시에 고르게 분포되도록 합니다.
      6. 37 °C에서 배양, 5 %_CO2.
      7. 다음 날, 모든 매체를 흡인하고 E8의 10 mL로 공급하십시오.
      8. 다음 3-4 일 동안 매일 이 방법으로 먹이를 다음 분할 준비.
   2. 분할 hPSCs
      참고 : 분할 시점에서 hPSCs는 80 % - 90 % 유동해야합니다. 부드럽고 밝은 가장자리가있는 큰 식민지를 관찰해야합니다. 그러나, 각 식민지 사이의 접촉을 피해야한다(도 2B,일 0 및 도 6B).
      1. 필요에 따라 VTN 코팅 된 100mm 요리를 준비하십시오.
      2. E8을 흡인하고 1x PBS로 1x 분할해야하는 접시를 씻으하십시오.
      3. 1x PBS를 흡인하고 0.25 M EDTA의 4 mL을 추가합니다. 37 °C에서 2 분 동안 배양, 5 %_CO2.
         참고: hPSC는 작은 콜로니로 분할/보충되어야 합니다. 단일 세포로의 분리를 방지하기 위해 EDTA로 2 분 이상 치료하지 마십시오. 세포는 2 분 처리 후 접시 표면에 여전히 부착되어야합니다.
      4. EDTA를 흡인하고, E8 배지 10 mL을 접시 표면에 강하게 피펫팅하여 콜로니를 분리하고, 15 mL 튜브에서 모든 배지 및 세포를 수집한다.
      5. hPSC에서 80%-90% 수렴, 분할 식민지 1:15-1:20. 예를 들어, hPSC를 1:20으로 100mm 접시로 분할하려면 500 μL의 E8/hPSCs 용액을 가지고 9.5 mL의 신선한 E8 배지와 혼합하십시오.
      6. VTN 코팅 100mm 접시에 접시 hPSCs.
         참고 : 각 연구자와 세포주에 대해 독립적으로 이상적인 분할 비율을 설정하는 것이 좋습니다.
   3. 동결 hPSCs
      1. 분할 할 준비가 된 hPSC의 100mm 접시 에 대해 3 개의 극저온 과 3.5 mL의 냉동 매체를 준비하십시오.
         참고: 용지와 바이알은 사용 전까지 4°C 또는 얼음 위에 보관해야 합니다.
      2. E8을 흡인하고 접시를 1x PBS로 2x 세척하십시오.
      3. 흡인 1x PBS 및 0.25 M EDTA의 4 mL를 추가하고, 37 °C에서 2 분 동안 배양하고, 5 %_CO2에.
         참고: hPSC는 분할될 때 작은 콜로니로 동결되어야 합니다. 단일 세포로의 분리를 방지하기 위해 EDTA로 세포를 2 분 이상 치료하지 마십시오. 세포는 2 분 처리 후 접시의 표면에 여전히 부착해야합니다.
      4. EDTA를 흡인하고, 접시 표면에 10 mL의 10 mL을 강하게 피펫팅하여 식민지를 분리하고, 50 mL 튜브에 있는 모든 배지 및 세포를 수집한다.
      5. 나머지 EDTA를 씻어 4 분 동안 200 x g에서 1 x PBS및 원심 분리기의 20 mL를 추가합니다.
      6. 상급을 버리고 펠릿을 3 mL의 동결 매체로 다시 놓습니다.
      7. hPSC를 3개의 극저온에 균등하게 분배하여 각각 1mL씩 분배합니다.
      8. 밤새 -80°C에서 조절된 냉동 상자 또는 스티로폼 샌드위치에 보관하여 온도 가떨어뜨림을 방지한 다음 액체 질소 탱크로 옮겨 장기간 보관하십시오.

2. 분화를 시작하는 시딩 hPSCs (0 일)

참고: hPSC는 안정화된 후(즉, 해동 후 2~3배 분할됨) 차별화할 준비가 되어 있어야 합니다. 식민지가 건강하고, 매끄럽고 반짝이는 가장자리와 최소한의 분화(그림2B)를가지고 있어야 합니다.

1. 필요에 따라 0일 전에 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 접시(24개의 우물 또는 6개의 잘 접시)를 준비합니다. 차별화가 시작될 때 RT로 요리를 가져오십시오.
2. 필요에 따라 0-1 차별화 매체를 만듭니다.
3. HPCS를 분할 할 준비가 된 Confluent에서 E8을 흡인하고 1 x PBS로 접시를 2 x 씻습니다.
4. 100 mm 접시 당 0.25 M EDTA의 7 mL를 추가하고 37 °C, 5 % CO_2에서15 분 동안 배양하십시오.
   참고: 이 시점에서, EDTA 처리는 단 하나 세포로 분산하기 위하여 머리말을 붙인다.
5. 모든 hPSCs를 피펫 (그들은 부동해야한다) 50 mL 튜브로 전송합니다. EDTA 용액과 동일한 양 또는 1x PBS를 추가하여 EDTA를 희석시되더하십시오.
6. 원심분리기 는 200 x g에서 4 분.
7. 상급체를 버리고, 0-1 분화 배지 및 피펫을 첨가하여 세포를 균질화한다. 더 많은 배지를 첨가한 다음 혼합하여 세포 를 계산하기에 이상적인 농도로 세포 용액을 희석시다.
   참고: 세포 용액을 과도하게 희석하지 마십시오. 하나의 전체 100mm 접시에서 세포는 시작 매체의 5 mL에 희석되어야한다.
8. 자동화된 셀 카운터 또는 혈세포계를 사용하여 셀 번호를 계산합니다.
9. 낮은 최종 부피에서 125,000 셀/^cm2에 도달하기 위해 필요에 따라 세포 용액을 희석하십시오 (예 : 6 웰 접시에 대해 잘 당 2 mL 또는 24 웰 접시에 대해 잘 당 500 μL).
   참고: 볼륨이 낮을수록 셀이 더 빨리 부착됩니다.
10. 코팅 된 접시에서 지하 막 매트릭스 용액을 모두 흡인하고 셀 용액을 우물에 플레이트합니다.
11. 37 °C에서 배양, 5 %_CO2.

3. 신경 문장 세포 유도 (1 일째부터 10 일째, 그림 2A)

1. 1일째에 0-1 분화 배지로 세포를 먹이세요(잘 6가지 요리는 잘 당 3 mL, 잘 요리는 24개에 1mL).
2. 2일째에는 세포에 2일째-10일 분화 배지(잘 6개의 잘 요리에는 3 mL, 24개의 웰 접시에는 1mL)를 공급합니다.
3. 지금부터, 세포는 10 일까지 격일로 공급되어야합니다 (즉, 다음 먹이 날은 4 일째가 될 것입니다).
   참고: 6일째부터 NC 능선이 감지되어야합니다(그림 2B). 분화가 일어나고 있는지 확인하기 위해, SOX10/AP2a에 대해 염색될 수 있고 분화의 시간에 따라 마커 유전자 발현에 사용될 수 있는 작은 웰(즉, 24웰)에서 병렬 분화 배양을 수행하는 것이좋습니다(도 2B,C).
4. 셀을 정렬하는 경우 섹션 4로 진행합니다. 그렇지 않으면 섹션 5로 진행합니다.

4. 신경 문장 마커 CD49D를 위한 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 및 스페로이드에 있는 NC 세포를 응집하는

참고 : FACS 정렬의 경우, 샘플은 얼음에 보관하고 정렬 할 때까지 염색 후 빛에 노출되지 않아야합니다.

1. 셀이 정렬된 경우 FACS 버퍼를 준비합니다.
2. 10-14일 스페로이드 배지를 준비합니다.
3. 10일째에 배지를 제거하고 1x PBS로 1x를 세척합니다.
4. 해리 액 (재료 표참조)을 잘 당 2 mL에서 6 개의 잘 접시 또는 24 웰 접시에 대해 잘 당 1 mL를 추가하고 37 °C에서 배양하고 20 분 동안 5 % CO_2로 배양하십시오.
5. 모든 hPSCs를 파이펫하고 50 mL 튜브로 옮김을 합니다.
6. FACS 버퍼와 원심분리기를 200 x g에서 4분 동안 튜브의 나머지 부분을 채웁니다.
   참고: 각 50 mL 튜브는 최대 20 mL 이하의 셀 용액을 수용할 수 있습니다. FACS 버퍼의 부피는 해리 솔루션을 중화할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다.
7. 상판을 버리고, 적절한 양의 FACS 버퍼(6웰 플레이트당 ~2 mL)로 세포를 재중단하고 셀 수를 결정합니다.
8. 다음 샘플을 준비합니다.
   1. 샘플 1 (얼룩지지 않은 대조군): FACS 버퍼의 400 μL에서 1 x 10⁶ 세포. 20 μm 스트레이너 캡을 통해 세포를 필터링하고 얼음에 튜브를 유지합니다.
   2. 샘플 2(DAPI 전용 대조군): 0.5 ug/mL DAPI를 함유하는 FACS 버퍼의 400 μL에서 1 x 10⁶ 세포. 스트레이너 캡으로 FACS 튜브를 통해 세포를 필터링하고 튜브를 얼음 위에 유지하십시오.
   3. 샘플 3 (CD49d 표지): PE/Cy7-컨쥬게이션 CD49D 항체(FACS 버퍼¹⁰⁰ μL당 100 μL당 5 μL 6 세포에 대해 5 μL)를 함유한 FACS 버퍼로 나머지 세포를 15 mL 튜브에 중단하고 20 분 동안 얼음에 배양합니다.
9. FACS 버퍼와 원심분리기를 200 x g에서 4분 동안 튜브를 채웁니다.
10. 상급을 버리고 제조업체의 지침에 따라 0.5 ug/mL DAPI를 포함하는 FACS 버퍼 1mL에 5-10 x 10⁶ 셀을 다시 일시 중단하십시오.
11. 스트레이너 캡으로 FACS 튜브를 통해 세포를 필터링하고 튜브를 얼음 위에 유지합니다.
12. FACS 버퍼 의 2 mL을 포함하는 수집 FACS 튜브를 준비합니다.
13. DAPI 및 PE-Cy7을 감지하여 CD49D⁺ 모집단을 분리할 수 있는 레이저로 FACS 기계를 정렬합니다.
14. 정렬 후 정렬된 셀을 세습니다.
15. 모든 분류된 세포를 10-14일 동안 재중단하여 배지의 500 μL당 0.5 x 10^6세포의 최종 농도로 재중단한다.
16. 플레이트 0.5 x 10⁶ 셀을 초저 부착 24 웰 플레이트에 잘 넣습니다.
17. 37 °C에서 세포를 배양, 5 %_CO2.

5. 스페로이드에 있는 NC 세포를 집합하기

1. FACS를 사용하여 NC 세포를 분리하고 대신 스페로이드로 직접 집계하지 않는 경우, 먼저 단계 4.2-4.5에 설명된 대로 세포를 준비합니다.
2. 튜브의 나머지 부분을 1x PBS로 채우고 원심 분리기를 200 x g에서 4 분 동안 채웁니다.
3. 상판을 버리고, 적당한 양의 10-14스페로이드 배지(예를 들어, 6웰 플레이트에 대해 웰당 배지의 ~2 mL)로 세포를 재중단하고, 세포 수를 결정하기 위해 카운트한다.
4. 10-14일 동안 세포를 희석하여 배지 500 μL당 0.5 x 10^6세포로 희석하였다.
5. 초저 부착 24 웰 플레이트에서 웰당 셀 현탁액의 플레이트 500 μL.
6. 37 °C에서 세포를 배양, 5 %_CO2.

6. NC 스페로이드 유지 보수 및 교감 선조 유도 (10 일째부터 14 일, 그림 4A)

1. 옵션 1: 최소한의 스페로이드 배양
   1. 11일째에는 10일부터 기존 배지를 흡인하지 않고 NC 스페로이드에 10-14일의 500 μL을 첨가합니다. 37 °C에서 배양, 5 %_CO2.
   2. 12일째, 플레이트를 기울여 우물 한쪽에 NC 스페로이드를 축적합니다. 조심스럽게 흡입하고 가능한 한 많은 매체를 폐기하고 10-14 스페로이드 배지의 1 mL로 먹이십시오.
   3. 14일까지 매일 세포에 먹이를 주십시오.
   4. 선택 사항: 스페로이드가 응집되어 큰 덩어리를 생성하는 경우 파이펫을 사용하여 스페로이드 덩어리를 부수게 합니다. 이것은 또한 개별 스페로이드가 너무 커지지 않도록 합니다.
      참고: 이상적인 스페로이드 크기 범위는 약 100-500 μm이어야 합니다. 그 범위 내에서, 개별 스페로이드의 크기는 중요하지 않습니다. 그러나 매끄럽고 선명한 가장자리와 같은형태(그림 3 및 그림 6)는추가 성공을 위해 중요합니다. 14일째에, 각 24웰 플레이트는 이상적으로 위에서 언급한 크기 범위 내에서 서로 다른 크기의 약 50-60개의 스페로이드를 함유하고 있습니다.
2. 옵션 2: 확장된 스페로이드 배양
   1. 15일째, NC 스페로이드를 유지하기 위해, 0.5 μM RA를 함유하는 10-14일의 1.5 mL로 사료한다. 37 °C, 5 %_CO2에서배양.
      참고: RA는 모든 수유에 신선하고 항상 -80°C에 보관해야 합니다.
   2. 지금부터, 매일 28까지 먹이를 다음 스페로이드의 도금 (섹션 7.1)을 계속.
      참고 : 성장하는 스페로이드는 1 mL 파이펫으로 파이펫을 만들어 일주일에 약 1 배나 분할됩니다. 대략 1:2-1:4의 비율로 분할됩니다. 2 주 확장 기간 내에서, 세포는 대략 숫자에서 네 배가되어야한다.

7. SymN 분화 및 성숙 (옵션 1 : 14 일 후; 옵션 2: 28일 이후)

1. 일반 요리에 도금 스페로이드
   1. PO/LM/FM 코팅 24웰 플레이트를 준비합니다.
   2. 0.125 μM RA(모든 사료에 신선한 첨가)와 10 μM Y27632(14일째만)를 포함하는 symN 배지를 준비합니다.
   3. 14일째, 플레이트를 기울여 우물 한쪽에 NC 스페로이드를 축적합니다. 가능한 한 많은 배지를 조심스럽게 흡인하고 폐기하고 1 mL의 symN 배지로 공급하십시오.
   4. 코팅된 플레이트에서 LM/FN을 제거합니다.
   5. 24 웰 플레이트에서 각각 잘 분할하고 플레이트하여 4 개의 새로운 웰, 코팅 된 24 웰 플레이트로 분리합니다. 각 원래 우물은 ~ 50-60 스페로이드를 포함하는 1 mL을해야합니다. 이것은 250 μL을 산출하고, 새로운 판에 각 우물에 대해 대략 10-15 개의 스페로이드를 함유합니다.
   6. 웰 당 250 μL의 추가 매체를 추가하십시오.
      참고: 이것은 1:4의 분할입니다. 분할이 상대적으로 균일하게 되도록 용액 내에 스페로이드가 제대로 분포되어 있는지 확인하십시오. 최종 숫자는 symN 생성 성공에 영향을 미치지 않으므로 스페로이드 수는 계산되지 않습니다.
   7. 37 °C, 5 %_CO2에서배양.
   8. 15일째(또는 옵션 2의 경우 29일째)에는 모든 배지를 0.125 μM RA를 포함하는 1 mL의 symN 배지로 대체하여 사료를 공급합니다. 지금부터, 뉴런은 20 일 (또는 옵션 2의 경우 35 일째)까지 2 일마다 공급되어야합니다.
   9. 20일(또는 옵션 2의 경우 35일째) 후, 뉴런은 기존 배지(500 μL)의 절반만 신중하게 대체하여 공급되어야 합니다. 이제부터는 매체가 빠르게 노란색으로 바뀌지 않는 한 매주 먹이를 주어 보시면 됩니다.
   10. 원하는 시간까지 매주 먹이를 유지하십시오.
       참고: 심민은 중추와 같은 구조로 집계되는 경향이 있으며 문화 요리에서 분리되기 쉽습니다. 이를 방지하기 위해 반수유와 최소한의 취급을 권장합니다.
2. 전기 생리학 기록을 위한 도금 전지
   1. PO / LM / FM 코팅 96 잘 전기 생리 판을 준비합니다.
   2. 0.125 μM RA(모든 사료에 신선한 첨가)와 10 μM Y27632(14일째만)를 포함하는 symN 배지를 준비합니다.
   3. 14일째에는 모든 스페로이드를 수집한 다음 200 x g에서 4분 동안 원심분리합니다.
   4. 상판을 버리고 2 mL의 해리 액을 추가하고 혼합물을 초저 부착 판의 우물 중 하나에 다시 옮니다. 37°C에서 배양하고, 20-45분 동안 5%_CO2로 배양한다.
      참고 : 스페로이드의 크기에 따라 해리 기간은 20 분 이상 일 수 있습니다. 세포의 해리를 10 분마다 최대 45 분까지 확인하십시오. 선택적으로, DNase의 0.1 mg / mL은 죽은 세포가 죽은 세포에서 자유 DNA를 방지하여 용액을 끈적 거리는 것을 방지할 수 있습니다. 스페로이드가 완전히 해리되면 집계되지 않기 때문에 이 프로토콜에서는 선택 사항입니다.
   5. 피펫을 완전히 분리한 다음 200 x g에서 4 분 동안 원심 분리합니다.
   6. 상급체를 버리고 적절한 양의 symN 배지로 셀을 다시 일시 중단하고 셀 수를 계산합니다.
   7. PO/LM/FN 코팅 전기 생리학 우물에서 100,000/cm^2로 세포를 플레이트하여 웰당 총 부피 200μL을 플레이트합니다.
   8. 15일째(또는 옵션 2의 경우 29일째)에는 섹션 7.1과 동일한 수유 과정을 따르십시오. 15일 이후의 총 부피(또는 옵션 2의 경우 29일)는 웰당 300 μL이어야 합니다.
   9. 20일 이후(또는 옵션 2의 경우 35일) 이후 다중 전극 어레이 기계를 사용하여 전기 신호를 측정합니다.
      참고: 옵션 2에서는 14일부터 28일까지 언제든지 스페로이드를 도금할 수 있습니다. 첫 번째 전기 신호 측정은 스페로이드를 도금한 후 1주일 후에 수행될 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 hPSC에서 symN을 생성하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 여기서 입증된 배양 조건은 이전에 발표된 프로토콜23,,24(도 1A)로부터피더프리 및 화학적으로 정의된 조건으로 개선되었다(도1B). 2개의 옵션이 제공되며, 하나는 20일 이내에 심즈를 만들고 다른 하나는 NCC를 확장하여 더 많은 셀을 생성한 다음 symN으로 분화할 수있습니다(그림 1B,옵션 1 및 2).

분화 된 세포의 symN 특성을 적절하게 모니터링하기 위해, PHOX2B-eGFP WA09 리포터 라인과 부모 WA09 PSCs 라인19. 모든 분화는 적어도 3개의 생물학적 반복에서 수행되었고, 적어도 하나의 항계 후 독립적인 분화 실험으로 정의되고/ 또는 세포의 갓 해동된 바이알로부터 유래하였다. 미분화 hPSCs의 합류가 80%-90%에 도달했을 때 분화가 유도되었다. hPSC 식민지는 둥글고, 반짝이고 매끄러운 가장자리와 거의 또는 전혀 차별화가 없었다. 식민지는 서로 만지지 않아야합니다(그림 2B, 일 0). 이전에 neurectoderm 유도에 사용되었던 전형적인 이중 SMAD 억제25대신, WnT 및 BMP4 신호와 결합된 TGF-β 억제는 초기 신경 문장 마커 AP2a의 강력한 발현으로 이어졌다. 신경 문장 마커 SOX10은 4일째부터 10일째까지 발현되었다(도2B). NCC는 6일부터 조밀하고 어두운 능선에서 나타났다. 이러한 능선은 SOX10(그림 2B,화살표)을 표현했다. 이전에 NCC 단계에서 SOX10이 세포 표면 마커 CD49D23,,26및 따라서 CD49D와 상관관계가 있음을 나타내었으며, 따라서 CD49D는 SOX10 궤적으로부터 어떠한 형광포를 보고하지 않는 NC 세포를 분류하는데 이용될 수 있다. 도 2C는 시간이 지남에 따라 NCC 마커 유전자의 발현을 나타낸다. 도 2D는 당사의 분화 효율이 80% 이상임을 나타냅니다. 나머지 세포의 동일을 확인하기 위해, qRT-PCR은 BryT 발현 중배엽, SOX17 발현 내배엽 및 PAX6 발현 신경내피동을 포함하는 세포 유형을 오염시키는 시험하기 위해 사용되었다; 모든 것이 결석하거나 매우 낮은 수준에서 표현된 것으로 나타났습니다(표시되지 않은 데이터; 모든 프라이머에 대한 보충 표 1 참조). 그러나, 일부 SIX1/EYA1+ 플라코드는 나머지 세포 유형의 소스일 수 있는(데이터가 표시되지 않음)으로 검출되었다.+ 추가적으로, 나머지 세포 유형은 이미 더 분화된 NCC 유도체일 수 있다. NCC의 HOX 코드는 이 단계에서평가되었다(도 2E). 그러나, 이 초기 단계에서 HOX 신호는 매우 낮았다 (규모 참고), 이러한 NCC는 두개골 - NC 문자 중 하나 또는 아직 NCC 하위 문자문자를 채택하지 않은 것을 시사.

10일째에 NCC는 약 80% CD49D+ NCC(그림2D)를산출한 FACS를 사용하여 정제될 수 있었다. 일반적인 게이팅 전략의 예는 그림 2D에표시됩니다. 선별 후, 세포를 NC 스페로이드로서 응집하였다(도3A). NCC를 확장하고 트렁크-NC-유사 특성을 유도하기 위해, 세포는 FGF2 및 CHIR의 조합으로 처리하였다. 우리는 CD49D+ 인구에 대한 정렬이 나중에 더 나은 또는 더 순수한 symN 의 문화를 산출하는지 테스트했습니다. 그림 3B는 정렬되지 않은 것과 정렬된 CD49D+ 정렬된 셀모집단을 비교합니다. 왼쪽에, 그것은 긍정적 인 정렬 및 정렬되지 않은 인구가 유사한 방식으로 NC 스페로이드를 만든 것을 볼 수 있습니다, 부정적인 정렬 된 세포가 제대로 집계하지 않은 반면, 둥근하지 않았다, 부드럽고 건강한 찾고 스페로이드와 3-4 일 이내에 사망. 더욱이, NC 전구마커에 대한 qRT-PCR을 통해 14일째에 NC 스페로이드를 비교했을 때, 정렬된 세포와 정렬되지 않은 세포 사이의 유의한 차이는 검출될 수 없었다. 눈에 띄게, 이 시점에서 교감 전구 마커의 발현은 여전히 낮았고 SOX10 수준은 여전히 높은 상태를 유지했으며, 이는 스페로이드가 여전히 NC 특성을 가진 세포로 구성되었다는 것을 시사한다. 도금 후 1일(15일째), PO/LM/FN 접시에 잘 부착된 미분류 및 CD49D+ 스페로이드와 신경질성 자성장을 명확하게 관찰할 수 있었다(그림3B,D15 및 도 3C,D29). 정렬되지 않은 문화어와 정렬된 문화어는 35일째에 병렬로 더 수행되었지만 큰 차이는 보이지 않았습니다(데이터가 표시되지 않음). 따라서 정렬 단계가 symN 생성에 필수적이지 않으므로 이 프로토콜의 선택적 단계라고 결론지을 수 있습니다. 그러나 80% CD49D+ 셀을 생성하지 않는 덜 효율적인 차별화의 경우 정렬 절차를 권장합니다.

다음으로, 이러한 NC 스페로이드가 NC 정체성을 잃지 않고 유지될 수 있는지 테스트했습니다(그림3A,옵션 2). NCC는 최대 2주 동안 스페로이드로 배양하였다(도3C). 29일째에 28일째 스페로이드 및 도금 세포의 형태는 옵션 1의 14일 및 15세포와 비교했을 때 유사하였다. 28일째, SOX10 발현은 14일째와 유사한 수준으로 유지되었다. 그러나, 초기 동정선 마커(즉, ASCL1, PHOX2B, 및 GATA3)의 발현이증가(도 3C,오른쪽), FGF2, WNT 및 RA 시그널링에서 확장배양이 성숙 및 후방화로 이어졌다는 것을 시사한다(도4C 및 F). 유사한 효력은 이전에 Kirino 외21에의해 보고되었습니다.

NC 팽창 후(옵션 1 또는 옵션 2), 스페로이드를 PO/LM/FN 코팅 접시에 도금하고 symN을 성숙시키기 위해 여러 신경 인자를 함께 제공하였다(그림4A). 20일째와 35일째(옵션 1 및 2에서 도금 후 1주일) 신경구는 부착된 스페로이드로부터 연장되는 방사형 패턴으로 관찰되었다(도4A,오른쪽). 더욱이, 노르에피네프린(NE) 합성 및 수송(즉, TH, AAAD, DBH)과 관련된 마커를 발현하였다(도4B). 오염된 세포 유형의 존재를 여기에서 다시 검사하였고, 부교감 뉴런을 나타낼 수 있는 ChAT의 발현이 발견되었다(도4B,E). 그러나, ChAT는 또한 해 심민으로 표현된다. VIP의 매우 낮은 수준, 또 다른 부교감 마커, 검출 되었다 (데이터는 도시되지 않음). 더욱이, BRN3A, ISL1 및 RUNX1의 낮은 수준이 검출되었다(그림 4B,E),이는 감각 뉴런 또는 삼차 뉴런, 즉 플라코드의 유도체를 나타낼 수 있었다. 최소 EDNRB(장뉴런 표시) 및 OLIG2(마킹 모터뉴런)가 검출되었다(데이터는 표시되지 않음). 비 신경 세포의 신원은 불분명 남아있다. 그러나, 우리의 이전 symN 프로토콜23의결과에 기초하여, 그들은 가장 가능성이 αSMA+ 근섬유 아세포였다. HOX 유전자의 발현은 재검사되었고, HOX5-9가 발현되어 트렁크 정체성을 시사하는 것으로 나타났다. HOX10(성례-NC를 나타내는)은 발현되지않았다(도 4C, F). 마지막으로, 니코틴 아세틸콜린 수용체(CHRNA3/4) 및 아드레날린 수용체(ADRA2A/B2) NE 수송기(NET, SCL6A2) 및 소포 수송기(VMAT1)를 포함하는 성숙한 마커를 발현하였다(도4D,G). 옵션1(도 4E-G)과비교하여 옵션 2로 유도된 세포에서 이들 유전자의 발현에서 유의한 차이가 발견되지 않았다.

또한 H9-PHOX2B:GFP 리포터 라인에서 이 프로토콜을 수행하여 결과를확인했습니다(그림 5). 20일까지, 세포는 뉴런의 조밀한 잔디를 형성하고 훨씬 더 높은 밀도의 클러스터로 응집되어 매우 높은 분화 효율을나타낸다(도 5A,맨 위 행). 염색은 대부분의 symN이 이러한 클러스터에서 덩어리가 되는 것으로 나타났으며, 이는 전체 적인 분화 효율의 평가 및 정량화를 어렵게 만들었다. 특정 symN 마커의 염색 및 공동 지역화를 강조하기 위해 클러스터 외곽의 덜 조밀한 영역에 중점을 두어 중점을 두어 중점을 두어 클러스터 의 외곽에 초점을 맞췄습니다(그림 5A, 오른쪽의 노란색 상자 참조). 이것은 또한 대부분의 오염세포가 있던 곳에, 그래서 전반적인 효율성을 판단하기 위하여 좋은 지역이 아니었습니다. 그럼에도 불구하고, 전형적인 symN 마커; 주변경막(PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1(팬 뉴런), DBH 및 NET1(심핀 바디 및 축색을 따라 점으로 표현됨, 도 5A,하단); 감지되었습니다. 다중 전극 어레이(MEA) 접근법은 전기 적 활성을 측정하기 위해 사용되었으며, 미분화 hPSCs의 음성 제어에 비해 초당 약 3-5 개의 스파이크에서 발사된 20 개의 symN이 발견되었습니다(그림 5B). 각 전극(도 5B,밝은 필드의 검은 점)을 제대로 기록하기 위해 세포를 웰에 고르게 분포하는 것이 중요합니다. 20일에서 30일째심은 또한 1 μM 니코틴으로 자극되었고, 이는 생체 내에서 심근의 프리갱글리온 신호를 모방하고 세포내 평균 발사 속도를 증가시켰습니다. 뉴런의 억제도 측정되었다. β2-아드레날린 수용체(ADRB2)는 symN 축슨 단말에 위치하며, NE분비(29)에대한 양성 피드백 루프를 생성한다. 1 μM 프로프라놀롤(β2-아드레날린 수용체 길항제)으로 symn을 치료하는 것은 그들의 활성을 억제하였다(도5C,오른쪽). 이러한 결과는 이 프로토콜에서 생성된 symN이 기능적으로 활성화되어 있음을 시사합니다.

그림 1: symN 분화 프로토콜의 개략적 그림 및 비교. (A)젤트너 등의 이전 프로토콜 등23. (B)최적화된 프로토콜. 옵션 1은 20일 길이이며 NC 스페로이드 배양량은 4일만 포함되어 있습니다. 옵션 2는 35일 길이이며 더 많은 NC 세포를 생산할 수 있는 2주 NC 스페로이드 팽창 단계를 포함합니다. VTN = vitronectin, PO = 폴리-L-오르니틴, LM = 라미닌, FN = 피브로넥틴, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = 레티노산, AA = 아스코르브산, NFs = NGF+BDNF+GF. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: NC 유도. (A)0일째부터 10일째까지 NC 유도에 대한 타임라인 및 트리트먼트. (B)밝은 현장 현미경으로 2일마다 NC 능선의 형태 및 형성을 모니터링하였다. 세포는 2일째 이후 각 시점에서 AP2A(적색) 및 SOX10(녹색)에 대해 공동 염색하였다. 모든 면역형광 사진은 DAPI로 반염색되었다. 빨간색 화살표는 능선의 구조를 나타냅니다. (C)2일부터 10일까지 NC 마커의 발현 프로파일에 대한 qRT-PCR 분석. (D)CD49D+ NC 인구(왼쪽)에 대해 10일째에 FACS 정렬의 대표적인 플롯. 일반적인 게이팅 전략 및 등각형 제어는 처음 네 개의 플롯에 표시됩니다. 10일째에 CD49D+ 세포 백분율의 정량화도 수행되었다.+ (E)2-10일째부터 HOX 유전자의 발현 프로파일에 대한 qRT-PCR 분석. NC = 신경 문장. 오차 바는 n ≥ 3 생물학적 반복의 데이터에서 유래, 적어도 하나의 분할 된 PSC 문화에서 별도의 일에 수행 독립적 인 분화 실험으로 정의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 신경 문장 유지 보수 및 확장. (A)10일~14일 동안 NC 확장을 위한 타임라인 및 트리트먼트 옵션 10일~10일~28일 문화 옵션 2. (B)NC 스페로이드 형성은 11일째(스페로이드 형성 후 1일)부터 14일째(즉, 도금일)까지 밝은 현장 현미경검사법에 의해 모니터링되었다. 분류되지 않은, CD49D+및 CD49D-인구를 비교했다.- 15일째에 도금된 세포도 도시된다. 세포는 CD49D에서 스페로이드를 제대로 형성하지못하였다- 그룹 및 도금 후 사망했다. 14일째 세포는 symN 전구체의 발현 프로파일에 대한 qRT-PCR 분석(오른쪽)에 의해 조사되었다. 정렬되지 않은 CD49D+ 모집단을 비교하였다(n ≥ 3). (C)NC 스페로이드는 최대 2주 동안 유지될 수 있다. 스페로이드는 15일째부터 28일째(착륙일)까지 밝은 현장 현미경검사법에 의해 모니터링되었습니다. 29일째에 도금된 세포도 도시되어 있다. 28일째 스페로이드는 symN 전구체(오른쪽)의 발현 프로파일에 대한 qRT-PCR 분석에 의해 조사되었다. 정렬되지 않은 CD49D+ 모집단을 풀(n ≥ 3)했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: SymN 분화 및 성숙. (A)14일째에 도금 후 의회 및 트리트먼트 옵션 1 또는 28일 옵션 2. 밝은 필드 현미경 사진 (오른쪽)은 20 일과 35 일째에 각각 symn을 보여줍니다 (두 옵션 에 대한 도금 후 1 주). (B–D) 20-30일 사이의 symN 속성의 발현 프로파일에 대한 옵션 1 qRT-PCR 분석. 정렬되지 않은 및 CD49D+ 모집단이 풀로 정렬되었습니다. (E–G) 35일 이후의 symN 속성의 발현 프로파일에 대한 옵션 2 qRT-PCR 분석. 정렬되지 않은 CD49D+ 모집단을 풀(n ≥ 3)했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: symN의 기능적 특성화. (A, 맨 위 행) 20일째에 symN 클러스터의 밝은 필드 이미지와 PRPH 및 TH 이중 양성 세포를 나타내는 스테인드 이미지는 주로 클러스터에 위치한다. (A, 하단) 다중 symN 마커(분리된 채널)는 20일째에 면역형광 염색에 의해 확인되었다. 노르에피네프린 수송기(NET1)는 세포체 표면뿐만 아니라 축색과 모수석을 따라 위치했다. 그것은이 배율에 점으로 나타났다. 모든 면역형광 사진은 DAPI로 반염색되었다. (B)20일째(위)에 symN에 대한 다중전극 어레이(MEA) 분석의 대표적인 히트맵. 밝은 필드 그림(아래쪽)은 심넨의 밀도와 전극 분포(8개의 검은색 점)를 보여줍니다. 정렬되지 않은 CD49D+ 모집단이 여기에 풀로 되어 있습니다. (C)1 μM 니코틴 및 1 μM 프로프라놀롤의 처리하에 20-30일 동안평균 발사율을 각각 5분(오른쪽)으로 정량화하였다. 정렬되지 않은 CD49d 양성 집단으로부터의 결과를 풀화하였다(n ≥ 3). 웰치의 보정, p 값:*<0.05와 짝이 없는, 두 꼬리 t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6: 분화를 진행하기에 부적절한 조건하에서 세포의 예. (A) B-E. (B)hPSCs (a) 건강한 콜로니및 많은 분화 세포를 가지며, (b) 0일째에 일부 콜로니 들 사이에 병합 및 분화된 테두리를 갖는다. 빨간색 화살표는 병합된 영역을 나타냅니다. (C)산등성이에 거품 같은 물집이 있는 10일째에 NCC. 빨간색 화살표는 맨 위 행의 물집을 나타냅니다. 맨 아래 행은 더 높은 배율을 나타냅니다. 우리는 물집의 세포 정체성을 확인할 수 없었습니다. 그러나, 더 많은 물집의 존재는 더 낮은 SOX10/CD49D 표현과 상관관계가 있는 것처럼 보입니다. (D)14일째에는 가장자리가 매끄럽고 둥근 모양이 결여된 불규칙한 스페로이드. (E)20일째에 건강에 해롭고 죽어가는 심미인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없다.