여기서 기재된 것은 플로시드 카세트 알레릭 교환 돌연변이, FLAEM을 사용하여 클라미디아 트라코마티스에서 표적화된, 마커리스 유전자 결실을 위한 방법이다.
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이 논문에서
요약
초록
클라미디아 트라코마티스는 유전적으로 조작하기가 역사적으로 어려웠던 의무적인 세포내 병원체입니다. C. trachomatis가 특권있는 세포 내 틈새 시장을 만들고 유지하기 위해 사용하는 메커니즘을 해명하는 데 결정적인 진전이 유전 도구의 부족으로 인해 제한되었습니다. 다행히도, 최근에 유전 조작 기술에 있는 몇몇 새로운 어드밴스가 있었습니다. 이들 중형-보고된 말투교환 돌연변이 발생(FRAEM)의 개발이다. 이 방법은 항생제 내성 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 선택 카세트의 삽입과 결합된 표적 유전자 결실을 허용한다. 이 전략에 대한 의존은 다운스트림 유전자에 대한 극성 효과의 잠재력으로 인해 다각형 오페론 내의 유전자를 표적으로 할 때 복잡할 수 있습니다. 플록스 카세트 알레릭 교환 돌연변이 발생(FLAEM)은 여기에 설명되어 있는 프로토콜로, 카세트-유도극성 효과를 완화하도록 개발되었다. FLAEM은 Cre-loxP 게놈 편집을 사용하여 알레릭 교환에 의한 표적 결실 후 선택 카세트를 제거합니다. 생성된 균주는 하나 이상의 코딩 서열의 마커리스 유전자 삭제를 포함합니다. 이 기술은 유전자 기능의 직접적인 평가를 용이하게하고 C. trachomatis에 있는 유전 조작을 위한 공구의 레퍼토리를 확장합니다.
서론
클라미디아 트라코마티스는 세균성 성병의 주요 원인이며 인간의 건강에 상당한 부담을 나타냅니다. 매년 1억 명 이상이 C. 트라코마티스1에감염됩니다. 여자에 있는 감염의 대략 70%는 골반 선동적인 선동적인 질병, 자궁 외 임신 및/또는 불모와 같은 해로운 생식 건강 효력에도 불구하고 자각 증상이 없습니다. 질병 후유증은 C. trachomatis 감염에 의해 개시된 면역 병리학과 직접 관련이있습니다 2. 효과적인 백신은 아직 개발되지 않았습니다. 따라서, 세균성 독성 인자 및 기타 세균성 유전자 제품의 기능을 이해하는 것은 중요하고 긴급한 연구 질문입니다.
세포 내 박테리아로서, 숙주 세포 침략, 세포 내 복제, 자손의 방출, 및 숙주 면역 반응의 회피는 중요한 과정입니다. C. trachomatis는 세포 내 발달을 위한 포함이라고 불리는 parasitophorous 막 결합 환액을 형성합니다. 포함 및 다른 많은 중요한 과정의 확립은 타입 III 분비 시스템(T3SS)을 통해 이펙터 단백질의 분비에 의해 달성된다3. 이러한 분비 이펙터의 기능을 해명....
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프로토콜
1. 관심 유전자에 특화된 상동성 무기를 사용하여 pSUmC-4.0의 설계 및 조립
- 상동 재조합에 대한 5' 및 3' 상동성 무기로서 역할을 하기 위해 결실을 위한 표적 유전자의 상류 및 하류 ~3kb 영역을 직접 식별한다(도1).
- 설계 PCR 프라이머를 1) 클라미다이얼 게놈 DNA로부터 3 kb 5' 상동성 암을 증폭시키고 2) Sall 제한 효소 부위에서 소화될 때 pSUmC-4.0에 특이적인 15-30 bp 오버행을 함유한다. pSUmC-4.0과 겹치는 프라이머 영역이 55°C의 용융 온도를 가지며 전체 프라이머의 헤어핀 용융 온도가 <35°C인지 확인합니다.
- 설계 PCR 프라이머는 1) 클라미다이얼 게놈 DNA로부터 3 kb 3' 상동성 암을 증폭시키고 2) SbfI 제한 효소 부위에서 소화될 때 pSUmC-4.0에 특이적인 15-30 bp 오버행을 함유한다. pSUmC-4.0과 겹치는 프라이머 영역이 55°C의 용융 온도를 가지며 전체 프라이머의 헤어핀 용융 온도가 <35°C인지 확인합니다.
- DNA 조립반응(16)후 pSUmC-4.0 벡터내로 각 상동성 암의 삽입을 증폭시키는 PCR 스크리닝 프라이머를 설계한다. 이....
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결과
FLAEM을 사용하여 C. trachomatis에서 마커리스 유전자 삭제를 위한 방법은 신중한 복제 및 변환 기술에 의존합니다. 성공적인 알레릭 재조합은 필수적인 첫 번째 단계이며 pSUmC-4.0 복제 벡터내로 상동성 암의 식별 및 삽입이필요합니다(도 1). 마커리스 유전자 결실을 위한 필수적인 제2단계는 도 2에나타난 Cre-lox 게놈 편집에 의한 형광 리포터 및 항생제 선택 카세트의 제거이다. 이러한 각 단계를 수행하는 데 사용되는 벡터는 그림 3에추가됩니다. 도 4는 야생형 C. 트라코마티스로시작할 때 마커리스 결실 돌연변이를 생성하는 변형 전략의 개략적 표현을 나타낸다.
대표적인 데이터는 tmeA가 유전자 결실.......
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토론
여기에 설명된 프로토콜은 FLAEM에 의한 C. 트라코마티스의 마커리스 유전자 결실의 생성을 위해 비필수 유전자의 표적 삭제를 허용하고 카세트 유도 극성 효과를 제거한다. 이 프로토콜은 pSUmC 4.0 자살 벡터에 삽입된 5' 및 3' 상동성 무기의 신중한 설계, C. 트라코마티스의 효율적인 변형 및 분리된 돌연변이 균주의 신중한 스크리닝에 의존합니다. 이 방법을 통해 성공적인 게놈 공학은 불형성이고 표적으로 한 유전자 삭제의 사이트에 단 하나 loxP 흉터 순서를 포함하는 박테리아에서 유래합니다. 더욱이, 이 방법은 동일한 C. 트라코마티스 균주 내에서 유전자의 순차적 표적화에 적응될 가능성이 있다.
5' 및 3' 상동성 무기의 신중한 설계와 자살 벡터에 삽입하는 것은 복제 프로세스의 첫 번째이자 가장 중요한 단계입니다. 3 kb 상동성 무기가 가장 효율적인 전점 재조합을 제공한다는 것이 밝혀졌습니다. 이 무기의.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 보건원, NIAID (보조금 A1065530 및 Al124649)에서 K.A. 필드에 공중 위생 서비스 보조금에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | 분자 생물학 등급 |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS 유기물 | 233131000 | |
| CaCl2 버퍼 | 10mM Tris pH 7.4, 50mM 염화칼슘 이수화물 | ||
| 염화칼슘 이수화물 | 시그마 | C7902-500G | 세포 배양 |
| 에 적합시클로헥시미드 | 시그마 | 7698-1G | |
| dam-/dcm- 유능한 E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | 멸균 여과 세포 배양 테스트 |
| 글루타민산 | Sigma | G8415-100G | L-글루타민산 |
| 성장 매체 #1 | RPMI 1640 배지에는 10%(vol/vol) 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)이 보충되었습니다. | ||
| 성장 배지 #2 | RPMI 1640 배지는 10%(vol/vol) 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS) 및 1 &마이크로가 보충되었습니다. g/mL 시클로헥시미드 | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | 인산나트륨 일염기 |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | 인산나트륨 이염기성 |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 클로닝 키트 | 새 제품 England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | 세포 배양에 적합한 생물시약 |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | 함유 2mM L-글루타민 |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| 선택 매체 #1 | RMPI 10% FBS, 1 &마이크로; g/mL 시클로헥시미드, 500 &마이크로; g/mL 스펙티노마이신 및 DMSO | ||
| 10 | FBS, 1 &마이크로; g/mL 시클로헥시미드, 500 &마이크로; g/mL 스펙티노마이신 | ||
| 선택 매체 #3 | RPMI 10% FBS, 1 &마이크로; g/mL 시클로헥시미드, 50ng/mL aTc 및 0.6 &마이크로; g/mL 페니실린 | ||
| 아세트산 나트륨 완충액 | 시그마 | S7899-100ML | 3M |
| SOC 성장 매체 | 뉴잉글랜드 BioLabs | B9020SVIAL | |
| 스펙티노마이신 디하이드로클로라이드 펜타하이드레이트, 세포 배양 등급 | Alfa Aesar | J61820 | |
| 자당 시 | 그마 | S1888-1KG | 세포 배양 |
| 에 적합한 생물 시약자당-인산-글루타메이트 완충액(SPG) | 37.5g 자당, 1.25g Na2HPO4, 0.18g NaH2PO4, 0.36 글루탐산 500ml 조직 배양 등급 물 | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | 초순수 등급 |
| 트립신-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| 물 | 시그마 | W3500-500ML | 멸균 여과, BioReagent, 세포 배양에 적합 |
참고문헌
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
- Stephen, R. S.
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재인쇄 및 허가
