밀 곡물 대사 산물 및 지질의 비표적 분석을위한 방법이 제시된다. 이 프로토콜에는 아세토니트릴 대사산물 추출 방법 및 역위상 액체 크로마토그래피 질량 분광법 방법이 포함되며, 양극 및 음전소 이온화 모드로 수집됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자, 환경 및 농업 관행의 관리 사이의 상호 작용을 이해하면 제품 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리 할 수 있습니다. Metabolomics 데이터는 주어진 순간에 이 상호 작용의 판독을 제공하고 유기체의 생화확적인 상태의 유익합니다. 또한, 개별 대사 산물 또는 대사 산물의 패널은 수율 및 품질 예측 및 관리를위한 정확한 바이오 마커로 사용될 수있다. 식물 메타볼로메는 생리적 특성과 바이오마커 발견에 대한 생화학적 통찰력을 제공하는 다양한 물리화학적 특성을 가진 수천 개의 소분자를 함유할 것으로 예측됩니다. 이를 악용하기 위해, 대사체학 연구원의 주요 목표는 단일 분석 내에서 가능한 한 많은 물리 화학적 다양성을 포착하는 것입니다. 여기에서 우리는 필드 성장한 밀 곡물의 분석을 위한 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기지를 둔 표적으로 한 metabolomics 방법을 제시합니다. 이 방법은 액체 크로마토그래피 사분면 용매 관리자를 사용하여 제 3 의 이상을 소개하고 전통적인 역상 그라데이션과 지질 -amenable 그라데이션을 결합합니다. 곡물 준비, 대사 산물 추출, 도구 분석 및 데이터 처리 워크플로우에 대해 자세히 설명합니다. 양호한 질량 정확도 및 신호 재현성이 관찰되었고, 이 방법은 이온화 모드당 약 500개의 생물학적으로 관련된 특징을 산출하였다. 또한, 밀 품종 간의 현저하게 다른 대사 산물 및 지질 특징 신호를 결정했습니다.
서론
농업의 유전자, 환경 및 관리 관행 간의 상호 작용을 이해하면 제품 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리할 수 있습니다. 식물 대사 산물은 게놈, 환경 (기후, 강우 등)과 같은 요인에 의해 영향을 받고 농업 환경에서 작물을 관리하는 방식 (즉, 비료, 살균제 등의 적용)에 의해 영향을받습니다. 게놈과는 달리, 대사체는 이 요인 전부에 의해 영향을 받고 그러므로 metabolomics 데이터는 특정 시간에 이 상호 작용의 생화확적인 지문을 제공합니다. 일반적으로 대사체학 기반 연구에 대한 두 가지 목표 중 하나가 있습니다: 첫째, 유기체의 생화학에 대한 깊은 이해를 달성하고 생리학과 관련하여 섭동 (생체 또는 생체 스트레스)에 대한 반응 메커니즘을 설명하는 데 도움이됩니다. 둘째, 바이오마커를 연구 하에 섭동과 연관시다. 두 경우 모두 이러한 지식을 보유한 결과는 수율 크기와 품질 향상이라는 목표를 달성하기 위한 보다 정확한 관리 전략입니다.
식물 메타볼로메는 다양한 물리 화학적 특성을 가진 수천개의 작은 분자를 포함할 것으로 예측됩니다. 현재, 어떤 대사체학 플랫폼 (주로 질량 분광법 및 핵 자기 공명 분광법)은 단 하나 분석에서 전체 metabolome를 붙잡을 수 없습니다. 이러한 기술 개....
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프로토콜
이 방법은 30개의 샘플(샘플당 약 150개의 시드)에 적합합니다. 10개의 다른 필드 재배 밀 품종의 3개의 생물학 복제본은 여기에서 이용되었습니다.
1. 곡물의 준비
- -80°C 저장고에서 샘플(통곡물)을 회수합니다.
참고: 여러 계절에 샘플을 채취하는 경우 수확 직후에 씨앗의 동결 건조를 권장합니다. 이것은 저장의 다양한 기간 후에 생길 수 있는 대사 산물 농도에 있는 어떤 변경든지 최소화합니다. 이렇게하려면 씨앗을 15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브 (약 300 개의 씨앗이 튜브를 채울 것)로 옮기고 알루미늄 호일로 덮습니다. 핀을 사용하여 호일을 2-3회 관통하고 밤새 전체 곡물을 동결건조(약 24시간). 시료는 이 단계에서 -80°C 냉동고로 복귀되거나 다음 단계가 수행될 수 있다. - 20 s에 대 한 높은 모드에서 두 실행에 대 한 실험실 믹서기를 사용 하 여 씨앗을 갈기.
참고: 이 프로토콜에 사용되는 블렌더는 블렌더를 블레이드 높이로 채우고 비교적 균일하게 분쇄된 곡물 샘플을 제공하기 위해 최소 150개의 씨앗이 필요합니다. - 베이스에서 블렌더를 제거하고 블렌더의 측면을 탭하여 거친 분쇄곡물을 시료 표면에 가져온다. 거친 재료는 폐기하거나 저장할 수 있습니다.
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결과
식물 대사체는 게놈과 환경의 조합에 의해 영향을, 그리고 또한 농업 설정에서, 작물 관리 정권. 우리는 밀 품종 간의 유전적 차이가 대사 산물 수준에서 관찰 될 수 있음을 보여줍니다, 여기, 이상과 500 곡물 혼자 품종 사이의 상당히 다른 농도를 보여주는 측정 화합물. 양호한 질량 정확도(<10 ppm 오차) 및 내부 표준의 신호 재현성(<20% RSD)(그림2)은음극 및 양성 이온화 모드 모두에 대해 관찰되었다(표3). 기재된 시료 전처리 및 액체 크로마토그래피 질량 분광법 기반 분석은 음의 이온화 모드에서 >900 데톤볼루트 피처와 >1300 데톤볼루트 피처를 양성 이온화 모드에서 산출했습니다. 준비 블랭크(그림3)는시료 제제 및 분석 방법이 유물 특징을 도입했는지 여부를 결정하기 위해 포함되었고, 따라서 모.......
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토론
여기에서, 우리는 밀 곡물의 분석을 위한 LC-MS 기지를 둔 표적되지 않은 metabolomics 방법을 제시합니다. 이 방법은 4개의 획득 모드(역단계 및 지질-반응성 역위상과 양성 및 음수 이온화)를 두 가지 모드로 결합하여 제3 의 이동상을 역위상 구배로 도입한다. 결합된 접근은 밀 품종 사이 강렬에 있는 이의 대략 반을 가진 이온 극성 당 대략 500의 생물학적으로 관련있는 특징을 산출했습니다. 다른 밀 품종의 곡물에서 대사 산물 농도의 중요한 변화는 질병 저항, 스트레스 허용 오차 및 곡물 품질및 수율에 중요한 다른 자형질 특성에 연결 될 수있는 변경 된 생화학을 나타냅니다. 예를 들어, 대사체학 접근법은 새로운 방어 메커니즘12를 설명하고 가뭄 내성13에서대사 산물의 역할을 제안하는 데 사용되어 왔다. 이 프로토콜의 향후 응용 프로그램은 특정 품종의 생화학 적 프로파일을 특정 환경 및 관리 관행에 바람직한 유전 적 특성에 추가로 연.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 서호주 프리미어의 농업 및 식품 펠로우십 프로그램 (일자리, 관광, 과학 및 혁신학과, 웨스턴 오스트레일리아 정부)과 프리미어 펠로우 인 사이먼 쿡 (센터 디지털 농업, 커튼 대학과 머독 대학). 현장 시험 및 곡물 샘플 수집은 서호주 의 지역 로열티 프로그램에 대한 정부의 지원을 받았습니다. 우리는 현장 시험에 기여한 그랜틀리 스테인러와 로버트 프랑스어를 인정합니다. NCRIS가 자금을 지원하는 바이오 플랫폼 오스트레일리아는 장비 자금 조달을 인정받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 13C6-소르비톨 | 머크 시그마-알드리치 | , 605514 | |
| 2-아미노안트라센 | , 머크 시그마-알드리치 | A38800-1 g | |
| 아세토니트릴 | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS 등급 |
| 포름암모늄 | 머크 시그마-알드리치 | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | 버전 1.7 | |
| AnalyzerPro 소프트웨어 | SpectralWorks Ltd. | 7.2단계에 사용되는 데이터 처리 소프트웨어. 버전 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | 7.5단계에 사용되는 데이터 처리 소프트웨어. 버전 1.4 | |
| 밸런스 | 싸토리우스. 정밀 저울 Pty. Ltd. | ||
| d6-트랜스신남산 | Isotec | 513962-250 mg | |
| 포름산 | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| 동결 건조기 (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| 유리 바이알 (2 mL) 및 스크류 캡 뚜껑 (프리 슬릿) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (바이알), VSS-SC91191 (뚜껑) | |
| Sciex TripleToF Sciex | p/n 4456736 | ||
| 용 설치 키트이소프로판올 | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS 등급 |
| 실험실 블렌더 | Waring 상업용 | 모델 HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | 튜닝 솔루션 |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/ 고처리량 대사체학을 위한 MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | 웹 기반 분석 파이프라인. 무료 웹 기반 도구입니다. 버전 4.0. | |
| 메탄올 | , ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS 등급 |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| 마이크로 원심분리기(Eppendorf 5415R) | Eppendorf(Crown Scientific Pty. Ltd.에서 배포) | 5426 No. 0021716 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브(2mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View 소프트웨어 | Sciex | 버전 1.2(64비트) | |
| 피펫 팁(200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR(200 uL), MBP2179-05-HR(1000 uL) | |
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| Sciex 5600 트리플 ToF 질량 | Sciex | ||
| 스크류 캡 용해 튜브(2 mL), 세라믹 비드 포함 | Bertin Technologies | ||
| 포름산나트륨 | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| 조직 용해기/균질기 | Bertin Technologies | 시리얼 0001620 | |
| 용량 플라스크(10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex 믹서 | IKA Works Inc. (Crown Scientific Pty. Ltd.에서 배포) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS 등급 |
| Water's Acquity LC 시스템, 4차 펌프가 장착된 | Waters | ||
| Water의 Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 컬럼 | Waters | p/n 186005614 |
참고문헌
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotyp....
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