활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

요약

이 프로토콜의 목적은 마우스 피부에서 치명적이지 않은 수준의 활성 산소 종(ROS)의 일시적인 생체 내 생산을 유도하여 조직의 생리적 반응을 더욱 촉진하는 것입니다.

초록

여기에서 우리는 마우스 피부에서 내인성 활성 산소 종(ROS)의 전환 가능한 생체 내 광생성을 유도하는 프로토콜을 설명합니다. ROS의 이러한 일시적인 현장 생산은 줄기 세포 틈새에서 세포 증식을 효율적으로 활성화하고 화상 치유 및 모낭 성장 과정의 가속화를 통해 강력하게 나타나는 조직 재생을 자극합니다. 이 프로토콜은 내인성 감광제인 프로토포르피린 IX의 전구체로 조직을 치료하고 엄격하게 제어되는 물리화학적 매개변수 하에서 조직에 적색광을 추가로 조사하는 조절 가능한 광역학 치료를 기반으로 합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 ROS 생물학을 분석하는 흥미로운 실험 도구를 구성합니다.

서론

활성 산소종(ROS)은 분자 산소가 화학적으로 환원되어 물을 형성한 결과이며 일중항 산소, 슈퍼옥사이드 음이온, 과산화수소 및 하이드록실 라디칼 ^1,2,3을 포함합니다. ROS는 화학적 반응성이 매우 높기 때문에 수명이 매우 짧습니다. 호기성 유기체에서 ROS는 미토콘드리아에서 호기성 호흡(전자 수송 사슬)의 주요 누출 부산물로서 세포 내부에 부수적으로 형성됩니다. 세포에 높은 수준의 ROS가 일시적으로 축적되면 단백질, 지질 및 당의 돌이킬 수 없는 비활성화와 DNA 분자 ^2,3,4,5에 돌연변이가 도입될 수 있는 산화 스트레스 상태가 발생합니다. 세포, 조직 및 전체 유기체에서 산화적 손상의 점진적인 축적은 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하며 세포 사멸 프로그램의 유도, 여러 병리 및 노화 과정과 관련이 있다 2,3,4,6.

프로토콜

모든 마우스 사육 및 실험 절차는 동물 실험에 관한 지역, 국가, 국제 법률 및 지침에 따라 수행되어야합니다.

1. 꼬리 피부 상피 wholemounts에 있는 모발 성장, 화상 유도 및 장기 BrdU LRCs의 동정의 유도

참고: 아래에 설명된 실험 설계를 위해 10일 또는 7주 된 C57BL/6 마우스, 가급적이면 새끼를 사용하십시오. 모든 실험 절차에서 동물은 표시된 대로 3% 이소플루란 흡입으로 마취되거나 자궁경부 탈구로 안락사됩니다.

1. 두 번째 휴지기 (휴식) 단계 (출생 후 약 50 일)에서 마우스의 등 피부에서 모발 성장 유도
   1. 3 % isoflurane을 흡입하여 마우스를 마취하십시오. 페달 반사의 부족(단단한 발가락 꼬집음)으로 완전한 심부 마취를 확인합니다. 헤어 클리퍼와 제모 크림을 사용하여 각 단일 마우스에서 등 피부의 두 개의 독립적인 영역을 나란히 면도합니다(Table of Materials). 왼쪽은 대조군으로, 오른쪽은 치료에 사용하십시오.
      참고: 면도 후 등 아래 피부가 분홍빛을 띠고 회색/검은색이 아닌지 확인하는데, 이는 이 마우스 균주에서 멜라닌 생성 및 성장기(성장) 단계로의 진입을 나타내는 지표....

결과

마우스 등 및 꼬리 피부에 mALA 전구체를 국소 투여하면 청색광(407nm) 여기 하에서 이 화합물의 적분홍색 형광에 의해 입증된 바와 같이 전체 조직과 눈에 띄게 모낭에 PpIX가 상당히 축적됩니다(그림 2A, C). 2.5-4 J/^cm2 의 플루언스에서 적색광(636nm)으로 처리된 조직을 연속적으로 조사하면 조직, 특히 모낭의 돌출 영역에서 ROS의 일시적인 생성이 촉진됩니다(그림 2B, D).

생체 내 마우스 피부에서 치명적이지 않은 ROS 생산을 켜면 사진 처리 이틀 후 모낭의 돌출 영역에서 체세포 줄기 세포로 분류되는 LRC 수의 상당한 증가가 촉진됩니다(그림 3, 왼쪽 패널). 특히, LRC 수의 증가는 일시적이며 치료 6일 후.......

토론

여기에서 우리는 생리학적 효과와 함께 마우스 피부에서 생체 내에서 내인성 ROS 생산의 일시적인 활성화를 허용하는 방법론을 제시합니다. 이 방법론은 내인성 광감작제 PpIX의 제어된 국소 자극을 유도하기 위한 광역학 절차를 기반으로 합니다(그림 1B). 이 실험적 접근 방식은 외부 ROS 소스(일반적으로 과산화수소)를 사용하고 조직/샘플에서 ROS의 제어된 국소 생산을 허용하는 방법론에 비해 상당한 발전을 구성하는 생체 내 실험 시스템에서 ROS 생물학을 연구하는 흥미로운 도구입니다.

아미노레불리네이트 기반 전구체가 세포 내 PpIX의 축적을 촉진하기 위해 과도하게 투여된다는 점을 감안할 때, 이 방법론의 중요한 단계는 손상 역치 미만이지만 강력한 자극 효과를 나타내는 조직에서 ROS 수준의 일시적인 생성을 유도하기 위해 적절한 광 용량을 설정하는 것입니다. 현재 세포와 조직에서 생성되는 모든 유형의 ROS의 정확한 양을 직접.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo 이미징 시스템(예: 국소 크림 형태의 IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA, 예: METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
전력 에너지 미터(예: ThorLabs 모델 PM100D)	ThorLabs
적색 광원(예: 636nm Aktilite LED 램프	광경화 ASA)