동일한 숙주 종으로부터의 1차 항체를 사용하여 멀티플렉스 면역염색을 위해 여러 가지 다른 방법이 확립되었다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀 내장 마우스 부신 절편에서 멀티플렉스 면역 염색 동안 항체 교차 반응성을 차단하기 위해 마이크로파 매개 항체 스트리핑 및 플루오로포폴-티라미드의 사용을 설명한다.
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방법 논문
마우스 부신에 멀티플렉스 면역 염색을 위한 마이크로 웨이브 및 플루오로포어 티라미드 - 동일한 숙주 종에서 분리되지 않은 1 차 항체를 사용하여
이 논문에서
요약
초록
면역 염색은 주어진 단백질의 세포 발현 패턴을 보여주기 위해 생물 의학 연구에서 널리 사용된다. 멀티플렉스 면역 염색은 다중 1 차적인 항체를 사용하여 표지를 허용합니다. 항체 교차 반응성을 최소화하기 위해, 간접 염색을 이용한 멀티플렉스 면역 염색은 다른 숙주 종으로부터의 표지되지 않은 1차 항체를 필요로 한다. 그러나, 상이한 종 항체의 적절한 조합이 항상 이용 가능한 것은 아니다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀-임베디드(FFPE) 마우스 부신 절편상에 대한 다중 면역형광에 대해 동일한 숙주 종(예를 들어, 두 항체가 토끼로부터)으로부터 표지되지 않은 1차 항체를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 항원 회수 단계에서 사용되는 동일한 절차 및 시약을 사용하여 이전에 염색된 1차 항체 복합체의 활성을 제거한다. 슬라이드는 일반적인 면역 염색 프로토콜을 사용하여 제1 차 항체로 염색하고 생체면역이차 항체를 이용한 결합 단계를 따랐다. 이어서, 아비딘-비오틴-과산화증 신호 개발 방법을 기질로서 불소-티라미드와 함께 사용하였다. 제1 차 항체 복합체의 면역활성을 전자레인지에 침지하여 8분 동안 구연산나트륨 용액을 제거하였다. 불용성 형광부-티라미드 증착은 샘플에 남아 있었고, 이는 슬라이드가 다른 1차 항체로 염색될 수 있게 하였다. 이 방법은 대부분의 거짓 양성 신호를 제거하지만, 항체 교차 반응성에서 일부 배경은 남아있을 수 있습니다. 시료가 내인성 비오틴으로 농축되는 경우, 과산화공소 이차 항체는 회수된 내인성 비오틴으로부터 거짓 양성을 피하기 위해 생체연화된 이차 항체를 대체하는데 사용될 수 있다.
서론
멀티플렉스 면역 염색에서, 공액 된 1 차 항체를 사용하여 직접 염색은 유익한 결과를 제공 할 수 있습니다. 이차 항체를 사용하지 않고, 직접 염색 방법은 항체 교차 반응성으로부터거짓 동경화 신호의 위험이 낮다. 그러나, 1차 항체상에 공액된 리포터(플루오로폴레, 효소) 또는 비오틴은 향후 사용을 제한한다. 대안적으로, 간접 면역 염색은 일반적으로 표지된 이차 항체를 가진 비공액 1차 항체를 사용하여 더 강한 신호를 제공한다. 이상적으로, 멀티플렉스 면역염색에 사용되는 비conjugated 1 차 항체는 항체 교차 반응성을 피하기 위해 상이한 숙주 종으로부터 와야 한다. 그러나, 상이한 숙주 종으로부터의 1차 항체의 적절한 조합이 항상 이용 가능한 것은 아니다.
바람직하지 않은 1차 항체와 반응하는 이차 항체의 위험을 제거하기 위해 여러 가지 방법이 확립되었다. 한 가지 일반적인 방법은 제1 차 항체 1로 염색하기 전에 제1 차 항체 복합체에 대한 잔존 결합 에피토프를 차단하는 F(ab) 단일성 항체를 사용하는것이다. 서양 블롯 시트의 스트립 및 재프로브와 유사한 항체 스트리핑은 3,3'-다미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)2 및 형광 티라미드 증착<....
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프로토콜
1. 첫 번째 항체로 염색
- 제왁스와 다음 단계각각에 5분 할당된 FFPE 슬라이드를 재수화: 자일렌 또는 등가 시약 3x, 100% 에탄올 2x, 95% 에탄올 1x, 70% 에탄올 1x, 50% 에탄올 1x 및 증류수 2x.
참고: 슬라이드는 이 재수화 단계에서 최종 단계에서 장착될 때까지 촉촉한 상태를 유지해야 합니다. - 선택적 항원 회수의 경우, 슬라이드를 끓는 구연산나트륨 용액(10 mMM, pH = 6.0)의 275 mL에 8분 동안 놓습니다. 용액을 끓이게 하려면 슬라이드를 14 x 9.5 x 9cm3(W x L X H) 파이펫 팁 박스의 바닥에 평평하게 놓고 70% 전원을 70% 전원으로 70% 전원으로 700W 전자레인지에 8분간 돌리세요. 그런 다음 전자 레인지에서 파이펫 팁 상자를 제거하고 뚜껑을 열고 용액을 실온 (RT)에서 적어도 20 분 동안 식힙니다.
- PBST를 포함하는 코플린 항아리에 슬라이드를 전송합니다 (0.1 % 폴리 소르베이트 20/80와 인산완충 식염수). PBST로 5분 3x로 씻으소서. 즉시 다음 단계로 이동하지 않을 경우, 즉시 다음 단계로 이동하지 않을 경우, 몇 시간 동안 RT또는 4 °C에서 1-2 일 동안 코플린 항아리에 PBST와 함께이 단계에서 슬라이드를 저장합니다....
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결과
결과는 항원 회수 단계 1.2를 포함하는 기재된 모든 단계로 처리된 샘플로부터 수득되었다. 여기에서 사용된 모든 이차 항체는 생체화되었다. 플루오로포레-티라미드는 제1 차 및 제1차 항체로부터의 신호를 개발하기 위해 사용되었다. 이미지는 FITC 큐브(녹색 형광의 경우), TxRED 큐브(Cy3용), DAPI 큐브(DAPI용)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 캡처되었습니다.
마이크로 웨이브 매개 스트리핑은 교차 반응성을 제거합니다.
마우스 FFPE 부신 절편은 2차 토끼 항체를 사용하여 염색되었다. 스트리핑(도1A-C)을제거하지 않고, TH에 대한 이차 항체는 3βHSD(+) 부위를 포착하고 부신 피질에서 적색 신호를 주었다(도
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토론
멀티플렉스 면역염색은 2개 이상의 항원들의 세포 동국화를 검사하는데 유용하다. 이 널리 사용되는 기술은 1 차 항체가 다른 기자 (직접 염색)와 공액 될 때 설득력있는 동국화 결과를 제공합니다. 그러나, 직접 염색은 일반적으로 1 차적인 항체를 검출하기 위하여 공액한 이차 항체를 관련시키는 간접 염색에 비교된 더 약한 신호를 제공합니다. 간접 염색에서, 고품질 멀티플렉스 면역염색 결과는 이차 항체가 상이한 1차 항체를 구별할 수 있는지 여부에 의존한다. 가능한 항체 교차 반응성으로 인해, 간접 염색 방법을 활용한 멀티플렉스 염색은 상이한 숙주 종으로부터의 1차 항체로 보다 명확하게 볼 수 있다. 칼 과 다른 항체 교차 반응성을 차단하기 위해 비공액 IgG F(ab) 단편을 사용하여프로토콜을 개발하였다 1. 유사한 전략은 조직에 있는 어떤 내인성 마우스 면역 글로불린검출에서 반대로 마우스 이차 항체를 방지하기 위하여 F(ab) monomeric 반대로 마우스 항체를 사용하는 "마우스 에 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 NIH R00 HD032636에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated 당나귀 안티 마우스 | 잭슨Immuno | 715-066-151 | 1:500 희석 |
| Biotinylated 당나귀 안티 토끼 | 잭슨Immuno | 711-066-152 | 1:500 희석 |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μ g/mL in distilled |
| 형광 현미경 | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1,000 희석 |
| 전자레인지, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| 마우스 anti-CYP2F2 | Santa Cruz | SC-374540 | 1:250 희석 |
| 마우스 anti-TH | 산타크루즈 | SC-25269 | 1:1,000 희석 |
| 노멀 당나귀 세럼 | 잭슨이뮤노 | 017-000-121 | PBST |
| 래빗 안티-20&알파 2% 세럼; HSD | Kerafast | EB4002 | 1:500 희석 |
| 토끼 안티 3&베타; HSD | TransGenic | KO607 | 1:250 희석 |
| Rabbit anti-TH | NOVUS | NB300-109 | 1:1,000 희석 |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam | ab32572 | 1:500 희석 |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1,000 희석 |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 희석 |
| TSA 플루오레세인 티라미드 | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 희석 |
참고문헌
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C.
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재인쇄 및 허가
