동물 향 신호 샘플링 및 분석

Summary

우리는 동물 통신에서 어떻게 사용될 수 있는지 이해하기 위해 악취 신호를 샘플링하고 분석하기위한 효과적인 방법론을 개발했습니다. 특히, 우리는 동물 냄새와 향기 표시의 휘발성 성분을 분석하기 위해 가스 크로마토그래피 질량 분석과 결합 된 헤드 스페이스 고체 위상 미세 추출을 사용합니다.

Abstract

우리는 가스 크로마토그래피 질량 분광법과 결합된 헤드스페이스 고형 마이크로추출을 사용하여 악취 신호를 샘플링하고 분석하기 위한 효과적인 방법론을 개발하여 동물 통신에 어떻게 사용될 수 있는지 를 이해했습니다. 이 기술은 시료내의 성분의 분리 및 잠정적인 식별을 가능하게 함으로써 악취 분비물의 휘발성 성분의 반정적 분석을 가능하게 하고, 피크 면적 비율의 분석은 신호에 관여할 수 있는 화합물을 나타낼 수 있는 추세를 찾아낸다. 이 현재 접근 방식의 주요 강점은 분석할 수 있는 샘플 유형의 범위입니다. 복잡한 시료 준비 또는 추출에 대한 필요성의 부족; 혼합물의 성분을 분리하고 분석하는 능력; 검출된 구성 요소의 식별; 및 검출된 구성 요소에 대한 반정적 및 잠재적으로 정량적 정보를 제공하는 기능. 방법론에 대한 주요 제한사항은 샘플 자체와 관련이 있습니다. 특정 관심의 구성 요소는 휘발성이 있기 때문에, 이들은 쉽게 손실 될 수 있기 때문에, 또는 그들의 농도 변경, 샘플 저장 및 수집 후 적절 하 게 전송 하는 것이 중요 하다. 이는 또한 샘플 저장 및 운송 조건이 상대적으로 비용이 많이 든다는 것을 의미합니다. 이 방법은 다양한 샘플(소변, 대변, 모발 및 향기-동맥 냄새 분비물 포함)에 적용될 수 있다. 이러한 냄새는 다양한 행렬에서 발생하는 복잡한 혼합물로 구성되므로 개별 성분을 분리하고 생물학적 관심의 화합물을 추출하는 기술의 사용이 필요합니다.

Introduction

동물^1의후각 신호를 뒷받침하는 화학적 변화에 대해서는 거의 알려져 하지 않으며, 악취^2의휘발성 화학 프로파일을 기록하고 정량화하는 방법론적 과제도 알려져 있다. 매우 복잡 한 작업 하는 경우 몇 가지 잠재적인 함정이 있다, 화학 행렬; 여기에는 악취 샘플을 샘플링하고 분석할 때^3이포함됩니다.

울버햄프턴 대학교로잘린드 프랭클린 과학 센터에서 우리는 동물들이 어떻게 사용될 수 있는지 이해하기 위해 냄새와 향기 를 분석하고 있습니다. 우리는 반화학과 행동 생태학, 내분비학 및 세포학을 결합하여 동물 통신에서 후각 신호가 수행하는 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.

우리는 방법론을 개발한 다음 여러 비인간 영장류 (즉, 여우원숭이, 빨간 주름 여우원숭이, 일본 원숭이, 올리브 개코원숭이, 침팬지) 및 기타 포유동물 (즉, 고양이, 소)을 포함한 다양한 종의 냄새와 표시를 분석했습니다. 소변, 대변, 모발 및 향기 냄새 분비물 등 다양한 샘플을 수집하고 분석했습니다. 이러한 냄새와 향기 마크는 화합물의 복잡한 혼합물로 구성되므로 분석에 사용되는 모든 방법론은 일종의 분리 기술을 포함해야합니다. 그림과 같이, 그들은 또한 관심있는 구성 요소를 추출하는 기술의 사용을 필요로 행렬의 범위에서 발생합니다.

Vaglio 외.⁴ 및 다른^저자5에 의한 이전 연구는 가스 크로마토그래피 질량 분광법 (GC-MS)을 사용한 동적 헤드 스페이스 추출 (DHS)을 사용했으며 직접 용매 추출⁶ 및 복잡한 용매 추출^7도 사용되었습니다. 특히 동적 헤드스페이스 샘플링은 시료 매트릭스(예: 수성 시료의 극지 화합물)에 대한 강한 친화력을 보이는 화합물을 제외한 모든 휘발성 화합물을 궁극적으로 제거하는 불활성 가스의 알려진 부피로 헤드스페이스를 제거하는 것을 포함한다.

현재 방법론의 경우, 우리는 GC-MS와 결합 헤드 스페이스 고체 위상 미세 추출 (HS-SPME)의 기술을 채택했다. 특히, 우리는 이전 GC-MS 실험실^8,9,10에서Vaglio 등에서 이미 사용된 방법론을 개발하고^{강화했습니다.}

용매없는 추출 기술은 이러한 방법이 안정적이고 고체 상 지원에 화합물을 고정하기 때문에 작고 휘발성이 높은 화합물 (그렇지 않으면 샘플에서 쉽게 손실 될 수 있음)을 분석하는 데 매우 효과적입니다. HS-SPME는 흡착 성 폴리머로 코팅된 섬유를 사용하여 시료 헤드스페이스에서 휘발성 화합물을 포획하거나 수성 생물학적^{유체(11)에}침수하여 용존 화합물을 추출한다. 폴리머 코팅은 화합물을 강하게 결합하지 않으므로 GC의 사출 포트에서 가열함으로써 제거할 수 있다. 이 방법은 용매 추출 기술보다 더 강력하며 DHS보다 더 효과적입니다.

현재 접근 방식에서 샘플은 유리 바이알 내에 포함되어 있습니다. 이러한 바이알은 바이알의 헤드 스페이스를 점유하기 위해 향기마크의 휘발성 성분을 촉진하기 위해 동물의 체온을 시뮬레이션하기 위해 40°C의 온도로 따뜻해질 수 있다. 폴리디메틸실록산/디비닐벤젠(PDMS/DVB) 셔벤트 소재의 65 μm로 코팅된 SPME 섬유는 헤드스페이스 환경에 노출되고 샘플로부터휘발성 성분이 섬유에 흡착된다. GC-MS의 입구 포트에서 섬유를 가열할 때, 휘발성 성분은 섬유로부터 탈광된 다음 GC에 의해 분리된다. 질량 스펙트럼 단편화 패턴은 MS를 사용하여 각 구성 요소에 대해 얻어진다. 질량 스펙트럼 데이터베이스에 대한 이러한 질량 스펙트럼을 비교하여 향기 마크의 구성 요소를 잠정적으로 식별할 수 있습니다. 자동 샘플러를 사용하여 여러 샘플을 일괄 처리방식으로 일관되게 분석할 수 있습니다.

SPME 섬유의 각 유형은 극성 화학 물질과 상이한 친화력을 가지고 있음을 감안할 때, 섬유는 일반적으로 대상 화학 화합물의 극성 및 / 또는 분자량에 따라 선택됩니다. 또한, GC 조건은 GC 컬럼의 종류와 표적 화학 화합물의 특성에 따라 변경된다.

이 기술을 통해 샘플내 부품의 분리 및 잠정식별을 가능하게 함으로써 향기 표시의 휘발성 성분을 반정적으로 분석한 다음, 피크 영역 비율을 분석하여 신호에 관여할 수 있는 향기 표시의 구성 요소를 나타낼 수 있는 추세를 찾을 수 있습니다.

이 현재 접근 방식의 주요 강점은 다음과 같습니다.

• 분석할 수 있는 샘플 유형의 범위입니다.
• 복잡한 시료 준비 나 추출이 필요하지 않습니다.
• 휘발성 구성 요소를 분석할 수 있는 기능입니다.
• 혼합물의 성분을 분리하는 기능.
• 검출된 구성 요소를 식별할 수 있습니다.
• 검출된 구성 요소에 대한 반정적 및 잠재적으로 정량적인 정보를 제공하는 기능.

Protocol

1. 샘플 컬렉션

1. 다음 중 하나인 샘플 냄새는 다음과 같습니다.
   1. 멸균 필터 용지(예: 향기-동맥 냄새 분비물)에 향기 표시를 통해 습관적인 연구 과목(예: 동물원 영장류)에 의해 자발적으로 풀어놓거나 바이알(예: 소변)으로 직접 수집합니다.
   2. 양성 강화 훈련을 사용하여 훈련 연구 과목 후 멸균 면봉을 문질러 수집합니다.
   3. 연구 과목의 세면봉후 멸균 면봉을 문질러 수집합니다.
2. 샘플을 멸균 10mL 나사로 덮인 투명 유리 바이알에 넣고 FTFE/실리콘 셉타를 통합한 나사 토핑 캡으로 밀봉합니다. 즉시 -20 °C에 저장합니다.
   참고: 니트릴 장갑과 같은 깨끗한 개인 보호 장비를 사용하는 것이 중요합니다. 자주 변경합니다. 샘플 및 바이알과의 직접적인 피부 접촉을 피하십시오. 새로운 바이알을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 사용되는 바이알의 경우 바이알을 미리 청소한 다음 동일한 프로토콜을 사용하는 것이 중요합니다.
3. 향기 표시를 수집할 때마다 환경 공백을 가져 가라. 예를 들어 샘플링 미디어(예: 필터 용지 또는 면봉)와 샘플링이 수행되는 동안 환경에 노출되는 헤드스페이스 바이알을 수집합니다.

2. 샘플 준비

1. 향기가 나는 필터 용지 또는 면봉의 머리에서 대략 10mm 정사각형의 블레이드로 절단하여 현장에서 샘플을 준비하고 10mL 나사 로 얹은 헤드 스페이스 바이알에 배치합니다.
2. 각 샘플이 준비된 후 적절한 항균 물티슈 및/또는 알코올을 사용하여 샘플링 매체를 절단하는 데 사용되는 블레이드를 폐기하거나 청소하고 철저히 건조시다.
3. 모든 샘플을 -20°C에 저장합니다.
   참고 : -20 °C또는 필드에서 실질적으로 가능한 한 낮은 선호.

3. 분석 준비

1. 냉동실에서 샘플을 제거하고 적어도 1 시간 동안 실온에 자연스럽게 따뜻하게 할 수 있습니다.
2. 다음과 같이 GC-MS에 분석 메서드를 설정합니다.
   1. SPME 분석 조건의 경우, 제조업체의 지시를 따라 SPME 섬유를 처음 사용하기 전에 컨디셔닝하십시오: 섬유 전조건(5분 동안 260°C), 시료 배양(2분 동안 40°C), 추출 시간(15분), 탈광 시간(2분), 섬유 후상태(20분 동안 260°C).
   2. 다음 GC 조건을 사용: 컬럼 (HP5-MS 30 m x 0.25 mm; 0.25 μm), 인젝터 온도 (270 °C), 유량 (1 mL/분), 사출 모드 (스플리트), GC 오븐 프로파일 (2 분 동안 45 °C; 4 °C/분 내지 170 °C; 20 °C/Min ~ 30 °C /Min ~ 30 °C /M)를 전송하십시오.
      참고: 샘플 보존 시간 일관성 을 개선하기 위해 분석 방법은 보존 시간이 잠겨 있습니다.)
   3. 다음 MSD 조건을 사용합니다: 용매 지연(2.5분) 및 스캔 범위(29 내지 400 amu).
      참고: 이전 프로토콜^4에서10~400개의 범위가 사용되었습니다.
3. 섬유 컨디셔닝 장치에 퍼지 가스 공급이 켜져 있는지 확인합니다.
   참고: SPME 어셈블리가 자동 샘플러에 올바르게 설치되고 자동 샘플러 트레이, 섬유 컨디셔닝 장치 및 GC 입구 포트에 정렬되는 것이 중요합니다. 정렬이 올바르지 않으면 SPME 섬유가 손상되거나 파괴될 수 있습니다.

4. 분석

1. GC-MS 자동 샘플러 트레이의 첫 번째 위치에 빈 헤드스페이스 바이알(시스템 공백 역할을 함)을 배치합니다. 자동 샘플러 트레이의 두 번째 위치에 환경 공백을 배치합니다. 자동 샘플 트레이의 후속 위치에 분석을 위한 샘플을 배치합니다.
2. 분석 서열을 만들어 샘플 트레이 내의 각 샘플을 분석합니다.
   1. 매스헌터 홈 화면에서 시퀀스를 | 선택 로드 시퀀스.
   2. 적절한 정보를 삽입하여 모든 공백 및 샘플에 대한 시퀀스 테이블을 완료합니다. 완료된 시퀀스 테이블을 저장합니다.
      참고: 시퀀스 테이블에 대한 정확한 정보는 테이블의 실험실 서식에 따라 달라집니다. 최소 정보에는 일반적으로 샘플 유형, 샘플 이름, 유리병 위치 및 번호, 분석 방법 및 데이터 파일 위치 및 이름(샘플 이름과 일치하는 데이터 파일 이름의 할당은 향후 데이터 처리를 돕습니다)가 포함됩니다. 분석 중에 시퀀스에 추가 샘플을 추가할 수 있습니다.
3. 시퀀스를 선택하여 시퀀스를 실행| 시퀀스를 실행합니다.
4. 분석 후 가능한 한 빨리 냉동실에 샘플을 반환합니다.
   참고: 시료를 재분석할 수 있지만, 일부 휘발성 성분은 초기 분석 중에 완전히 추출되었을 수 있으며 일부 화합물은 40°C에서 열 및 세균 분해를 겪었을 수 있으므로, 따라서 생성된 크로마토그램은 원래 향 마킹을 철저히 대표하지 못할 수 있다.

5. 데이터 분석

참고: 초기 데이터 분석에는 ChemStation 소프트웨어 및 NIST(국립 표준 기술 연구소) 질량 스펙트럼 데이터베이스, 버전 MSD F.01.2317을 사용하여 피크를 잠정적으로 식별하는 데 함께 보존 시간 및 피크 영역 데이터를 얻기 위해 크로마토그램의 통합이 포함됩니다. 데이터 분석은 수동으로 또는 반자동 방법을 통해 수행 될 수있다. 반자동 방법을 사용하는 경우 미정 식별을 확인하기 위해 수동 데이터 분석을 수행하는 것이 때로는 유용합니다.

1. 왼쪽 탐색 모음에서 적절한 파일을 클릭하여 데이터 파일을 엽니다. 총 이온 크로마토그램(TIC)이 데이터 분석 화면의 상단 창에 표시됩니다.
2. RTE 통합기를 사용하여 TIC를 통합하려면 크로마토그램 | 선택합니다. 통합.
3. 3x 기준 노이즈보다 큰 피크가 통합되도록 통합 매개 변수를 조정합니다. 크로마토그램 | 선택 MS 신호 통합 매개 변수. 출력 상자에서 최소 피크 영역을 적절히 조정합니다(1.0은 예제에서 허용 가능한 결과를 생성합니다).
4. 피크를 식별하고 요약 보고서를 생성하려면 보고서 내보내기 | 선택 라이브러리 검색 결과는 XLS로 보고합니다.
   참고: 표시되는 라이브러리 일치 항목 수와 함께 검색할 스펙트럼 라이브러리는 라이브러리 검색을 수행하기 전에 소프트웨어 내에서 미리 설정해야 합니다.
5. 결과 스프레드시트 보고서에는 각 피크에 대한 통합 데이터와 ID 할당을 위한 임시 스펙트럼 라이브러리 일치가 포함됩니다. 일반적으로 라이브러리 품질/라이브러리 일치는 >80이어야 임시 식별을 수락해야 합니다. 스프레드시트를 저장합니다.
6. TIC에서 직접 피크를 식별합니다.
   1. 관심의 절정을 선택합니다.
   2. 피크가 작으면 왼손 마우스 버튼을 아래로 눌러 피크 주위에 상자를 그려 확대하여 상자를 최대 위로 늘이고 놓습니다.
   3. 커서 라인을 배치하여 피크의 가장 높은 지점(또는 바로 그 후)에 있습니다.
   4. 오른쪽 마우스 버튼을 두 번 클릭하면 피크의 질량 스펙트럼이 데이터 분석 화면의 아래쪽 창에 나타납니다.
   5. 스펙트럼 라이브러리를 검색하려면 스펙트럼 창의 아무 곳이나 커서를 이동하고 오른손 마우스 버튼을 두 번 클릭합니다. 라이브러리 검색 결과가 새 창에 나타납니다.
   6. 관심 스펙트럼에서 배경 노이즈를 제거하려면 먼저 문제의 피크의 오른손 마우스 버튼을 두 번 클릭합니다. 그런 다음 관심의 피크 바로 앞에 피크가없는 영역에서 오른쪽 마우스 버튼을 두 번 클릭합니다. 크로마토그램 | 선택 스펙트라를 뺍니다. 빼진 스펙트럼은 데이터 분석 화면의 아래쪽 창에 표시되며 창 헤더의 SCAN 데이터 옆에 '(-)'가 표시됩니다.

Results

이 프로토콜에 따라, 우리는 잠정적으로 적혈구 여우원숭이(바레시아 variegata rubra)에의해 필터 종이에 자발적으로 방출 된 14 개의 아노 생식기 향기 마크의 분석에서 총 32 휘발성 화학 화합물을 식별하고 신호기^(12)의특징과 냄새 프로파일을 비교하였다. 탄화수소, 테르펜, 테르펜 알코올 및 케톤과 같은 자연적으로 발생하는 휘발성 화합물은 이러한 프로파일 내에 존재했으며 이전에 다른 동물 종의 적합성에 대한 성 페로몬 및 단서 역할을 하는 것으로 밝혀진 화합물을 포함시켰습니다. 잠정적으로 확인된 화합물은 표 1에나열됩니다. 대표적인 크로마토그램(대조군에서 1개, 여우원숭이 향마크로부터 1개)이 도 1에도시되어 있다. 구성 요소의 수와 상대적 풍부는 샘플에서 샘플마다 다른 연구 과목에 걸쳐 다양합니다. 그러나, 6개의 화합물(벤잘데히드, 2-에틸-1-헥사놀, p-크레솔, 시스-...

Discussion

샘플 수집 시 생성된 환경 제어와 시스템 블랭크 모두 제어 샘플의 사용은 향기 마크 샘플을 해석하는 데 매우 중요합니다. 샘플링 환경이나 기악 시스템에 기인하는 모든 피크는 관심 의 피크만 해석에 포함되도록 향기 표시 샘플에서 제외해야합니다. 이러한 컨트롤은 계측의 '상태'를 평가하고 모니터링하는 역할도 할 수 있습니다.

프로토콜에는 각 추출 전후에 섬유를 조절하는 단계가 포함되어 있습니다. 이는 자동 샘플러를 사용하여 쉽게 이루어지며 샘플에서 샘플로의 교차 오염이 없음을 보장합니다.

방법론에 대한 주요 제한사항은 샘플 자체와 관련이 있습니다. 수집 후 적절하게 저장되고 전송되는 것이 중요합니다. 특정 관심의 구성 요소는 휘발성이며, 이들은 쉽게 손실 될 수 있습니다, 또는 농도 변경. 현재 샘플은 일반적으로 -20°C에서 냉동 저장 및 전송됩니다. 그 결과 이러한 샘플의 저장 및 운송에 상당한 비용이 소요됩니다. 분석을 위해 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mL 오토샘플러 바이알	Agilent	5188-5392	18mm 바이알 캡이 있는 10ml 스크류탑 바이알
	Agilent	8010-0139	마그네틱 with PTFE/실리콘 격막
오토샘플러 Agilent		GC120 PAL 오토샘플러
모세관 컬럼	Agilent	HP5-MS	30 m x 0.25 mm; 0.25 µ m
데이터 분석 소프트웨어			Agilent-ChemStation
가스 크로마토그래프	Agilent	7890B
입구 격막	Agilent	5182-3442	Merlin microseal
질량 선택 검출기	Agilent	5977A
보고 소프트웨어		Microsoft-Excel
Spectral 라이브러리	NIST	-	NIST/EPA/NIH 질량 스펙트럼 라이브러리
스펙트럼 라이브러리 검색 프로그램	NIST-MS		검색 v.2.2
비분할 입구 라이너	Agilent	5190-4048
SPME 섬유	Agilent	SU57345U	65 µ m PDMS/DVB 파이버