방법 논문

RNA-Seq 분석에 의한 인간 1차 각질 세포의 생체외 분화 의 특성화

DOI:

10.3791/60905

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2020년 5월 16일

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1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기에 제시된 RNA-seq 분석에 의한 분자 수준에서의 특성화에 의해 접촉 억제에 의한 인간 1차 각질 세포의 체외 분화를 위한 단계별 절차이다.

초록

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인간 1 차 각질 세포는 표피 분화 및 관련 질병에 대한 연구를위한 시험관 내 모델로 자주 사용됩니다. 다양한 유도 조건을 이용하여 2차원(2D) 침수 된 매너로 배양된 각질 세포의 체외 분화를 위한 방법이 보고되었다. 여기에 기재된 시험관내 각질 세포 분화 방법에 대한 절차는 RNA-seq에 의한 접촉 억제 및 후속 분자 특성화에 의한 것입니다. 간단히 말해서, 각질 세포는 완전히 수렴될 때까지 성장 요인으로 보충되는 정의된 각질 세포 배지에서 재배됩니다. 분화는 각질 세포 사이의 긴밀한 접촉에 의해 유도되고 매체에서 성장 인자를 배제함으로써 더욱 자극된다. RNA-seq 분석을 사용하여, 1) 분화된 각질 세포는 분화 도중 뚜렷한 분자 서명을 나타내고 2) 동적 유전자 발현 패턴은 표피 계층화 도중 세포를 크게 닮은 것으로 나타났다. 일반적인 각질 세포 분화에 비교하는 것과 관해서는, 전사 인자 p63의 돌연변이를 운반하는 각질 세포는 그들의 분화 결함과 일치하여 변경된 형태학 및 분자 서명을 나타낸다. 결론적으로, 이 프로토콜은 RNA-seq 데이터의 생물정보 분석에 중점을 두고 2D 내 각질 세포 분화 및 분자 특성화를 위한 단계를 자세히 설명합니다. RNA 추출 및 RNA-seq 절차는 잘 문서화되었기 때문에, 이 프로토콜의 초점이 아닙니다. 체외 각막 세포 분화 및 생물 정보 분석 파이프 라인의 실험 절차는 건강하고 병이 있는 각질 세포에서 표피 분화 도중 분자 사건을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서론

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인간의 피부에서 유래된 인간 1차 각질세포는 표피1,2,3,4의생물학을 연구하기 위해 세포 모델로 자주 사용된다. 표피의 계층화는 2D 침수 단층 패션 또는 3D 공기 리프트 organotypic 모델2,3,5,6,7에서각질 세포 분화에 의해 모델링 될 수 있습니다. 3D 모델은 표피 구조와 기능을 평가하는 것이 점점 더 중요해지고 있지만, 2D 분화 모델은 여전히 널리 사용되고 있습니다.

혈청, 고농도 칼슘, 저온 및 표피 성장 인자 수용체2,3의억제를 포함하여 2D에서 각질 세포 분화를 유도하는 다양한 조건이 적용되었다.....

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프로토콜

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피부 생검은 건강한 자원 봉사자 또는 p63 돌연변이를 가진 환자의 트렁크에서 취하여 1 차적인 각질 세포 문화를 설정했습니다. 인간 1 차 각질 세포 확립에 관한 모든 절차는 Radboud 대학 Nijmegen 의료 센터의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). 정보에 입각한 동의가 얻어졌습니다.

1. 접촉 억제에 의한 인간 1차 각질 세포 분화

  1. 필요한 경우 각질 세포 성장 배지(KGM)를 케라틴세포유저(재료표)로부터준비한다.
  2. 미리 준비된 주식을 사용하여 500mL 확산 배지를 만듭니다(KGM-pro; 표 1참조).
  3. 500mL 분화 매체를 만듭니다(KGM-dif; 표 2참조).
    참고: 보충제를 갖춘 KGM은 2주 동안 4°C로 보관할 수 있습니다. 더 긴 저장을 위해 -20°C에서 알리인용 및 저장될 수 있습니다.
  4. 세포 증식 능력에 따라 5.0-20 x 103 세포/cm2의밀도에서 1 차 각질 세포를 종자. 세포를 커버하기에 충분한 KGM-프로 배지....

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결과

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정상적인 각질 세포 분화 및 RNA-seq 분석
이 실험에서, 5명의 개인에게서 유래된 각질 세포 라인은 분화 및 RNA-seq 분석을 위해 사용되었다. 도 1은 분화 및 RNA-seq 분석 결과의 실험 적 절차를 요약한다. 분화 시 정상적인 각질 세포 및 세포 형태 변화의 체외 분화 절차의 개요는 도 1A에도시된다. 원리 성분 분석(PCA)은 분화를 겪고 있는 각질 세포가 연결되었지만 뚜렷한 전반적인 유전자 발현프로파일(도 1B)을보였다. 고가변 유전자는 분화(도1C)동안유전자 발현 역학 및 패턴을 시각화하기 위해 kmeans에 의해 클러스터되었다.

유전자의 각 클러스터는 각질 세포 분화 특징 유전자 (예를 들어, 증식을 위한 KR.......

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토론

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이 작품은 RNA-seq 분석을 사용하여 인간 각질 세포 분화 및 후속 특성화를 유도하는 방법을 설명합니다. 현재 문헌에서는, 인간 각질세포분화에 대한 많은 연구가 2,3,23의분화를 유도하는 방법으로높은 칼슘 농도 또는 혈청을 사용하는 두 가지 다른 방법을 사용한다. 이전 보고서는 이 세 가지 다른 방법3을 신중하게 비교하고 이러한 방법이 각질 세포 분화의 뚜렷한 생물학을 나타낼 수 있음을 보여 주었다. 이 같은 보고서에서, 저자는 혈청에 의해 유도된 분화세포가 건선 피부에서 발현되지만 정상 표피에서는 발현되지 않는 KRT16 및 SKALP/PI3와 같은 높은 증식 전위 및 발현 유전자를 가지고 있으며, 따라서 혈청 유도 분화 모델을 건선을 연구하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다. 대조적으로, 접촉 억제 및 성장 인자.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 과학 연구를위한 네덜란드 조직에 의해 지원되었다 (NWO / ALW / MEERVOUD / 836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/오픈 대회/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); 라드부 드 대학 펠로우십 (H.Z.); 중국장학원 교부금 201406330059(J.Q.).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bioanalyzer 2100AgilentG2929BA
소 뇌하수체 추출물 (BPE)LonzabulletKit
CFX96 Real-Time systemBio-RadqPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Sigma-AldrichD8537
Epidermal Growth factor (EGF)LonzaPart of the bulletKit
에탄올 아민 >= 98%Sigma-AldrichE9508
고감도 DNA 칩Agilent5067-4626
HydrocortisonLonzabulletKit
인슐린LonzabulletKit 부품
iQ SYBR Green KitBioRad170-8886
iScript cDNA 합성Bio rad1708890
KAPA Library Quant KitRoche07960255001저농도 측정 키트
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase,RocheKK8540RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKitLonza192060
NanodropdeNovixDS-11 FX (model)Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurement
NEXTflex DNA 바코드 -24IllumniaNOVA-5141036 bp long primers
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122
RNA Pico ChipAgilent5067-1513

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation o....

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Human Primary KeratinocytesIn Vitro DifferentiationRNA Seq AnalysisContact InhibitionEpidermal DifferentiationGene Expression ProfilingPrincipal Component AnalysisK Means ClusteringGene Ontology AnalysisP63 Mutations

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