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방법 논문

편도선 단핵 세포의 격리는 인간 점막 림프구 조직에서 Ex Vivo 타고난 면역 반응을 연구합니다

7.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60914

⸱

2020년 6월 14일

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology, Ulm University Medical Center, 2CNRS UMR-8601, Centre Interdisciplinaire Chimie Biologie, 3Team Chemistry & Biology, Modeling & Immunology for Therapy, Université Paris Descartes, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, 5Pediatric Otolaryngology Department, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Université de Paris, Institut Cochin

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 의정서에서는, 점막 조직에 있는 바이러스성 감염을 모방하고 활성화시 선천적인 면역 반응을 공부하기 위하여 부분적인 외과 편도선 절제술을 겪고 있는 건강한 인간에게서 편도선 단핵 세포를 쉽게 처리하고 배양하는 방법을 설명합니다.

초록

점막 관련 림프조직(MALT)에서 분리된 세포를 연구하면 조직에서 숙주 병원체 상호 작용을 모델링할 수 있기 때문에 점막 면역과 관련된 병리학에서 면역 세포 반응을 이해할 수 있습니다. 조직에서 유래된 분리된 세포는 첫번째 세포 배양 모형인 동안, 조직이 얻기 어려울 수 있기 때문에 그들의 사용은 무시되었습니다. 본 의정서에서는 건강한 인간 편도선으로부터 편도선 단핵세포(TMC)를 쉽게 처리하고 배양하여 활성화 시 선천적인 면역 반응을 연구하고 점막 조직의 바이러스 감염을 모방하는 방법을 설명합니다. 편도선에서 TMC의 격리는 빠르다, 편도선은 거의 어떤 상피를 가지고 모든 주요 면역 세포 유형의 수십억까지 항복하기 때문에. 이 방법은 혈액에서 말초 단핵 세포 (PBMC)의 사용과 유사한 면역 분석, qPCR, 현미경, 유동 세포 측정 등을 포함한 여러 기술을 사용하여 사이토카인 생산을 검출 할 수 있습니다. 또한, TMC는 미래의 독성 검사에 대해 고려해야 할 PBMC보다 약물 검사에 더 높은 민감성을 보여줍니다. 따라서, ex vivo TMC 문화는 쉽고 접근 가능한 점막 모델입니다.

서론

인간의 장기에 대한 연구는 접근성뿐만 아니라 명백한 윤리적 이유로 인해 제한됩니다. 그러나, 그(것)들은 인간 생물학의 복잡성을 완전히 이해하기 위하여 필수적입니다. 고립 된 세포의 배양 (1 차 배양 또는 세포주) 그들의 가용성 때문에 세포 생물학 연구에 표준 시스템. 고립 된 세포 배양은 뛰어난 발견을 허용했지만 생체 기관의 생물학에서 완전히 모방하지 않기 때문에 세포주를 사용하는 것은 면밀한 조사를 받고 있습니다. 그러나, 3차원 세포 또는 조직 이종의 배양은 매우4복잡4,5,,6이다. 실제로, 조직 이나 장기의 조각은 매우 이종성 때문에 그것의 세포 구성 조직에 국소화에 따라 다릅니다. 따라서 조직 블록을 사용하면 많은 기술적 및 생물학적 복제의 분석이 필요하며 많은 수의 기증자 또는 환자가 필요합니다.

점막 관련 림프조직(MALT)은 림프절과 구조적으로 유사하지만 점막 면역7을조절하는 것이 주된 역할이기 때문에 독특한 기능을 가지고 있다. 일반적으로 조직에서 어느 정도 떨어진 곳에 위치한 림프절과 달리, 몰트는 일반적으로 점막 조직의 상피 바로 아래에 위치합니다. 조직학적으로, 그들은 주로 B와 T 세포의 고농도로 구성되지만 대식세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포도 구성됩니다. 몰트는 인체에 있는 림프구 조직의 대략 50%를 구성합니다. 몰트는 그들의 위치에 따라 9개의 그룹으로 세분화됩니다: GALT (창자-), BALT (기관지-), NALT (비강), CALT (결막), LALT (후두), SALT (피부), VALT (불보-), O-MALT (조직), D-MALT (확산). O-MALT는 주로 Waldeyer의 편도선 링의 편도선으로 구성되어 있으며 가장 접근 하기 쉬운 MALT8,,9입니다. 실제로, 오로하린에 위치한 편도선은 (잠재적) 침습적미생물(10)으로부터소화 및 호흡기를 보호하는 주요 장벽을 구성한다. 또한 편도선은 혈관, 신경 및 림프를 포함하는 결합 조직의 캡슐에 의해 지원되는 미세 한 층상 편평상피비상각성 상피로 덮여 있어 면역세포(11,12)에12쉽게 접근할 수 있다. 또한 편도선 절제술은 편도선 제거의 수술로, 수면 장애 호흡을 가진 어린이에게 수행되는 일반적인 절차로, 편도선은 생리적 환경에서 쉽게 사용할 수 있는조직(13)입니다.

편도선은 점막 면역을 관련시키는 병리에서 면역 세포 반응의 연구를 허용합니다. 실제로, HIV 감염에서는 편도선이 고농도의 면역 세포로 구성되기 때문에 바이러스 복제의 주요 대상이지만순환(14,,15)에서검출되지 않는 다량의 사이토카인을 생성한다. 꾸준한 상태에서, 선천성 같이 세포의 희소한 인구는 편도선을 포함하여 각종 점막 조직에 존재합니다, 그러나 본질적으로 혈액에서 결석합니다.

따라서 편도선(TMC)의 단일 핵 세포는 PBMC보다 관련성이 높으며 복잡한 모델이며 더 심오한 질문에 답할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 조직 이출의 사용은 복잡할 수 있고 항상 타고난 면역 연구 결과와 관련되지 않을 수 있습니다. 따라서, TMC16을사용하여 점막 면역 활성화를 연구하는 모델을 확립했다. 여기서는 신선한 인간 편도선에서 TMC를 효율적으로 격리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 전 생체 내 연구에 대한 무결성을 유지하면서 많은 수의 면역 세포를 복구 할 수 있습니다.

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프로토콜

표본은 연구 목적을 위해 특별히 수집되지 않으며 연구 결과는 침략적인 것으로 간주되지 않습니다. 그러나 인간 편도선 수집은 지역 관계 당국의 윤리적 승인이 필요합니다. 우리의 경우, 그것은 코미테 드 보호 데 페르소네스 (IDRCB / EUDRACT: 2018A0135847)에 의해 승인되었다. 또한, 각 환자 또는 법정 대리인의 동의는 실험 결과를 해석하는 데 도움이 될 수 있는 기증자의 개인 데이터(예: 성별, 연령, 이력)를 획득하도록 요청됩니다.

1. 인간 편도선 조직 취급

  1. 모든 기증자의 편도선에 25mL PBS 1x를 함유한 멸균 50mL 바이알 1개에 넣고 실온(RT)에서 실험실로 이송합니다(바이알, 안전 상자 및 가방 의 세 가지 수준의 보호 를 사용).
    참고: 전체 절차는 생물학적 안전 수준 2 실험실에서 수행되어야합니다. 모든 인간 표본은 이전에 자격을 갖추지 못했으며 전염성 요원을 포함할 수 있기 때문에 주의하여 처리되어야 합니다.
  2. 각 사용 사이에 모든 도구를 청소합니다.
    1. 사용 후, 세포 스트레이너를 분해하고 세제 용액 (H2O의1/10 부피 세제)을 포함하는 욕조에서 다른 모든 악기 (예 : 유봉, 집게)를 밤새 보관하십시오.
    2. 각 기구를 브러시하여 조직을 제거하고 맑은 물로 씻습니다.
    3. 모든 부품을 잘 건조한 다음, 10메쉬 스틸 그리드 위에 60메쉬 스틸 그리드를 배치하여 셀 스트레이너(85mL, 37mm 직경)를 준비하고 링을 단단히 닫습니다.
    4. 모든 도구를 멸균 백과 오토클레이브에 놓습니다.

2. 편도선 단핵세포의 인간 편도선 조직 및 격리의 해부(TMC)

  1. 세포 스트레이너를 150 x 25mm2 2(SPL150) 세포 배양 접시에 놓고 모든 계측기를 다른 SPL150에 배치하여 멸균상태를 유지합니다.
  2. 멸균 포셉을 사용하여 유리병에서 세포 여조로 편도선을 옮김합니다. 또한 편도선을 퇴각한 일부 세포를 포함하는 모든 PBS에 부어 넣습니다. 필요한 경우 더 많은 PBS를 추가하여 그리드에 몰입합니다.
    참고: 조직은 탈수를 피하기 위해 항상 침지해야합니다.
  3. 포셉과 메스를 사용하여 소작, 피 묻은 및 자궁 근종 조직을 제거하십시오.
    참고: 어린이에게서 제거된 편도선은 이 단계가 필요하지 않습니다.
  4. 메스와 구부러진 핀셋을 사용하여 직경 이0.5cm 미만의 작은 조각으로 조직을 잘라냅니다. 작은 조각이 항상 침지 될 수 있도록 모든 조직을 잘라.
  5. 세포 스트레이너에 조직의 몇 조각을 놓고 흰색 스트로마의 정말 얇은 층이 남아있을 때까지 유리 유봉그리드에 긁어. 그리드가 막히는 것을 방지하기 위해 스트로마를 제거하고 버립니다.
  6. 모든 조직이 그리드를 통해 압착되면 10mL 파이펫을 사용하여 모든 셀 서스펜션을 그리드로 전송하고 마지막으로 긁어냅니다.
  7. 10mL 파이펫으로 셀 서스펜션을 멸균 바이알로 옮킨다. 그리드와 셀 스트레이너를 PBS 1x로 세척합니다. 셀 서스펜션을 벤치에서 RT에서 5분 동안 쉬게 하십시오. 이 단계는 남은 스트로마, 죽은 세포 및 방출 된 DNA의 강수및 응집을 허용하고 다음 단계를 용이하게합니다.
  8. 멸균 70 μm 체를 새로운 50mL 유리병 위에 놓고(봉투에서 조심스럽게 제거) 셀 서스펜션을 10mL 파이펫으로 부드럽게 전달합니다. 펠릿이 자주 존재하기 때문에 서스펜션을 혼합하지 마십시오. 체가 막힌 경우 멸균 1 mL 파이펫 팁의 뒷면을 사용하여 체에 세포를 긁어 넣습니다. 필요에 따라 체를 자주 변경합니다.
  9. 4°C에서 10분 동안 250 x g의 세포를 원심분리합니다.
  10. 상체를 버리고 유리병을 부드럽게 혼합하여 펠릿을 다시 한 다음 PBS의 35 mL에서 세포를 다시 중단하십시오.
  11. 새로운 바이알에서 새로운 70 μm 체를 위에 놓고 셀 서스펜션을 10mL 파이펫으로 전달합니다. 체가 막힌 경우 2.7 단계에서 자세히 설명된 기술을 사용하십시오.

3. 세포 밀도 그라데이션에 의한 TMC 의 격리

참고: TMC는 2.10 단계 후에 사용할 수 있습니다. 그러나, 더 명확한 세포 용액을 얻고 다른 세포 이물질 및 임의의 적혈구를 제거하기 위하여, 단핵 세포의 세포 밀도 그라데이션 절연을 능력을 발휘하는 것이 좋습니다.

  1. 새로운 50mL 바이알에 밀도 그라데이션 배지(d = 1.076 g/mL)의 15mL을 추가합니다. 밀도 그라데이션 매체 위에 TMC 솔루션을 붓고 밀도 그라데이션 매체와 서스펜션의 혼합을 최소화하도록 주의하십시오.
  2. 원심 분리는 가속과 브레이크 오프RT에서 30 분 동안 1,000 x g에서 솔루션을 제공합니다.
  3. 10mL 파이펫으로 제거하고 TMC와 밀도 그라데이션 매체 사이의 인터페이스를 방해하지 않고 상위 층(대부분 PBS 1x 포함)을 폐기합니다.
    참고: TMC에는 적혈구수가 적어 지므로 용액이 분명합니다. 따라서 PBS의 TMC 용액과 밀도 그라데이션 매체 사이의 인터페이스는 시각화가 어려울 수 있다. 이에 따라 밀도 그라데이션이 수행되기 전에 20m HEPES(FBS 제외)로 보충된 RPMI 1640에서 세포를 재장전할 수 있다.
  4. 멸균 1mL 파이펫 팁으로 TMC를 제거하고 새로운 50mL 바이알에 넣습니다.
  5. 태아소 세럼(FBS)의 2%를 함유한 PBS 50mL와 2mM EDTA 및 원심분리기를 4°C에서 g 10분 동안 250xg로 첨가하여 세포를 세척하여 나머지 혈소판을 제거한다.
  6. 반복 단계 3.5, 하지만 4 °C에서 10 분 동안 400 x g에서 튜브원심분리.
  7. 10% 열 불활성 FBS, 2mM L-글루타민 및 항생제 용액(100 U/mL 페니실륨 및 100 μg/mL 연쇄 절제술)으로 RPMI 1640을 보충하여 배양 배지(R10)를 준비한다.
  8. R10의 10mL에서 TMC를 다시 중단하고 셀을 계산합니다. 평균적으로 이 기술은 편도선 한 켤레당 5 x 108-2 x 109 TMC를 생성합니다. 세포는 이제 전혈(예: 특정 세포 형, 세포 배양, 유동 세포측정, RT-qPCR, 동결 등)에서 PBMC와 같은 조사에 사용될 수 있다.
  9. 필요한 경우 1 차 세포 동결을위한 표준 기술을 사용하여 추가 사용을 위해 세포를 동결하십시오.
    1. 셀 수를 계산합니다.
    2. 세포를 원심 분리하고 상신을 제거합니다. 1 x 108 셀/mL의 최종 농도를 위해 충분한 100% FBS에 펠릿을 녹인 다음 동일한 부피를 80% FBS + 20% DMSO 용액으로 추가합니다. 그런 다음 셀은 5 x 107 셀 /mL에 있을 것입니다. 이 단계는 4°C에서 수행해야 하며 FBS 및 DMSO 용액은 사용하기 전에 4°C로 유지되어야 합니다.
    3. 셀 용액의 1mL를 냉동튜브에 분배하고 세포 동결 속도를 제어하기 위해 하룻밤 사이에 4 °C에 있는 느린 동결 용기에 넣습니다. -80 °C에 놓습니다.
    4. 세포를 해동하려면, 일정한 동요와 함께 몇 초 동안 37 °C에서 따뜻한 목욕에 극저온을 놓습니다. 세포가 해동되기 시작하자마자 R10 및 원심분리기의 49mL로 전송하여 DMSO를 제거합니다. 셀을 계산하고 이를 PBMC로 사용합니다.
      참고: TMC를 동결하고 해동하면 이물질을 제거하지만 일부 희귀 세포 유형도 손상됩니다. 해동 후 덩어리 나 파편이 존재하는 경우, 그것을 사용하기 전에 멸균 70 μm 체를 통해 세포 현탁액을 통과하는 것이 가장 좋습니다.

4. 흐름 세포측정에 의한 TMC의 페노티핑

  1. 5 mL 세포측정관에 시험하고 배치해야 하는 각 항체 혼합물 패널에 대한 이전 용액에서 5 x 106 세포를 검색합니다. 스테인드되지 않은 컨트롤을 위해 1 x 106 셀을 검색합니다.
  2. PBS 및 원심분리기의 세포를 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 세척합니다. PBS의 500 μL (1 x 106 세포 /mL)에서 그들을 다시 중단하고 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 생존 얼룩으로 인큐베이션하십시오.
  3. 셀 서스펜션 100 μL 당 5 μL 열 비활성화 된 인간 AB 혈청을 추가하고 어둠 속에서 4 ° C에서 15 분 동안 배양하십시오.
  4. PBS + 2 % FBS + 2 mM EDTA (워시 버퍼) 및 원심분리기400 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 세포를 세척하십시오.
  5. 표 1에상세한 바와 같이 항체를 포함하는 500 μL의 세척 버퍼에서 TMC를 다시 중단한다. 어둠 속에서 4 °C에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오.
  6. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 세척 버퍼및 원심분리기에서 셀을 세척합니다. 파라포름알데히드(PFA)의 0.5%를 포함하는 PBS의 500 μL에서 TMC를 다시 중단합니다. 혈류 세포측정에 의해 획득 될 때까지 4 °C에서 어둠 속에서 유지하십시오.
    참고: PFA는 위험합니다. 상용 즉시 사용할 수 있는 솔루션을 사용하여 0.5% PFA 솔루션을 준비합니다.
항 체복제플루오로크롬회사
라이브 데드BV405써모피셔 과학
CD3SP34-2V500BD 파밍겐
CD8SK1아맥얀BD 파밍겐
CD8BW135/80비오블루밀테니 바이오텍
CD4RPA-T4PE-Cy7BD 파밍겐
CD45HI30PerCP-cy5.5Bd
CD19HD237Ecd베크만 쿨터
CD202H7알렉사 플루어 700BD 파밍겐
CD14M5E2PE-cy7BD 파밍겐
CD14M5E2ApcBD 파밍겐
CD163G8APC-H7BD 파밍겐
CD56MEM188PeBD 파밍겐
CD1237G3PeBD 파밍겐
BDCA-1L161퍼시픽 블루BD 파밍겐
BDCA-3AD5-14H12Fitc밀테니 바이오텍
BDCA-4AD5-17F6Apc밀테니 바이오텍
HLA-DRG646-6PerCP-cy5.5BD 파밍겐
CD11c3.9알렉사 플루어 700에바이오사이언스

표 1: 유동 세포측정에 의한 세포 특성화를 위한 항체 목록.

5. TMC 활성화 및 사이토카인 생산 측정의 예

  1. R10 배지에서 TMC를 희석하여 2 x 106 셀/mL의 농도를 얻습니다.
  2. R10 의 200 μL에 400,000 TMC를 96 개의 잘 둥근 하단 플레이트에 배포합니다.
  3. 세포를 활성화하려면 TLR7/8 작용제 레시퀴모드(R848)의 5μg/mL을 하룻밤 사이에 추가합니다.
  4. 플레이트원심분리기를 원심분리하고 TMC의 상체를 검색하여 추가 분석을 위해 동결합니다. 사이토카인 생산은 제조업체의 프로토콜에 따른 유동 사이토미터를 사용하여 동시에 다중 수용성 사이토카인을 정량화하기 위해 비드 기반 면역 분석제를 사용하여 평가될 것이다.
  5. 제조업체의 프로토콜에 따라 발광 세포 생존 가능성 분석기를 사용하여 세포의 생존 가능성을 평가합니다. 간단히, 우물에 세포 생존용액 60 μL을 추가하고 10 분 이내에 발광을 측정합니다 (1 s / 잘 획득).

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결과

우리는 먼저 배양에 존재하는 세포의 면역 프로파일을 특성화하고 TMC의 양을 분석했습니다. 우리는 유동 세포측정을 사용하여 편도선에서 TMC를 표현했습니다. 도 1에도시된 바와 같이, 혈액으로부터 PBMC에 존재하는 모든 주요 면역 세포 유형은 편도선으로부터 TMC에서 나타내고 있었다. 그러나, TMC에서 B 세포를 제외한 모든 세포 유형의 빈도는 PBMC보다 낮았다.

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그림 1: 편도선에서 TMC의 표토. 건강한 기증자로부터 TMC는 인간 편도선 조직의 해부 및 세포의 격리 후에 얻어졌습니다. (A)세포...

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토론

인간 편도선은 점막 계면에서 타고난 면역 반응을 연구하기 위한 통합 및 생리학적 전 생체 모델을 나타내며, 이는 이차 림프구 기관의 역할을 모방하기 때문이다. 흥미롭게도, TMC의 세포 조성은 PBMC와 유사하며 혈액으로부터 PBMC와 다를 수 있지만 모든 주요 세포 집단을포함한다(도 1). 추가 인구는 또한 발견될 수 있습니다, 모든 면역 반응은 조직에서 시작되기 때문에 (점막 또는 이차 림프구 기관) 혈액에서 하지.

인간 조직의 사용뿐만 아니라 세포 배양 또는 혈액 세포의 사용은 각각 자신의 장점이 있다. 그러나, 연구 사이토카인 분비 및 세포 활성화의 경우, 조직 이식은 최고의 모델이 아니었다. 사실, 우리는 조직 이출의 상부에서 어떤 IFN 생산을 감지 할 수 없습니다(도 2B). 우리는 그것이 직접 주변 세포에 의해 소비되는 것을 추측...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 기관 국립 드 라 Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P)에 의해 지원되었다. H) 실험 및 N.B. 펠로우십 (AAP 2017 166). N.S.는 동호회ANRS(AAP 2016 1), 유럽 분자생물학기구 EMBO(LT 834 2017), 울름대학교 의과대학 의학학부의 스타트업 자금 조달 프로그램 "바우스타인", 도이치 포르스충스게마인샤프트 DFG(SM 544/1)의 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10 메쉬 스틸 그리드 - 1910 µ mDutscher198586셀 스트레이너 Cellector
60 메쉬 스틸 그리드에 넣기 위해 - 230 &마이크로; mDutscher198591세포 여과기 Cellector
70 µ에 넣으려면; m 흰색 ClearLine 셀 스트레이너Dutscher141379C
Anios Excell D 세제Dutscher59852
세제 항생제 용액, 100xThermo Fisher15140122100 U/mL 페니실륨 및 100 μ g/mL 스트렙토마이신 - 배양 배지에 추가
FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mLBD Biosciences352063FACS 튜브
Cell strainer Cellector, 85 mL 및 37 mm 직경Dutscher198585
CellTiter-Glo (CTG) 발광 세포 생존도 분석PromegaG7572생존도 분석
원심분리기 5810 REppendorf
원뿔형 튜브 Falcon 50 mLDutscher352070
곡선 핀셋Dutscher711200
디메틸 설폭사이드(DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(PBS)Sigma-AldrichD8537칼슘 및 마그네슘 없음
EnVisionPerkinElmer발광 측정
소 태아 혈청(FBS)배양 배지에 추가하려면
형광 라벨 항체표 1
유리 유봉Dutscher198599
Hepes (1 M)Thermo Fisher1563005620 mM
인큐베이터
LEGENDplex Human Anti-Virus Response PanelBioLegend740390비드 기반 면역분석
림포렙StemCell7801밀도 구배 매체
Mr. Frosty 용기Thermo Fisher5100-0001완속 냉동 용기
피어스 16% 포름알데히드(w/v), 메탄올 무함유Thermo Fisher28908
Resiquimod (R848)InvivoGentlrl-r848TLR7/8 작용제
RPMI-1640 중간Sigma-AldrichR8758
SPL 세포 배양 접시, 150 mm x 25 mm (SPL150)Dutscher330009
수술용 칼날 멸균 N° 23Dutscher132523
UltraComp eBeads 보상 비드Thermo Fisher01-2222-41
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020PBS에서 세척 버퍼를 만들기 위해
BD 를 참조하십시오. 에서 사용

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