Method Article

정성적 및 정량적 조직학적 방법을 사용하여 마우스 배아의 선천성 심장 결함 분석

DOI:

10.3791/60926

⸱

March 10th, 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Institute for Quantitative Health Sciences and Engineering, Michigan State University

In This Article

Summary

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이 프로토콜에서는 선천성 심장 결함과 관련된 마우스의 발달 표현형을 정성적및 정량적으로 분석하는 절차를 설명합니다.

Abstract

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선천성 심장 결함 (CHD)는 모든 살아있는 출생의 1%까지 영향을 미치는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형입니다. 그러나, CHD에 대 한 근본 원인은 여전히 제대로 이해. 개발 마우스는 마우스와 인간 사이의 심장 발달 프로그램이 매우 보존되기 때문에 CHD의 연구를위한 가치있는 모델을 구성한다. 이 프로토콜은 원하는 임신 단계의 마우스 배아를 생산하는 방법, 하류 처리를 위해 심장을 분리하고 보존하는 방법, 조직학에 의한 일반적인 유형의 CHD를 식별하는 정량적 방법(예: 심실 중격)을 상세히 기술합니다. 결함, 심방 중격 결함, 특허 덕터스 동맥 동맥 및 일반적인 근육 다짐 표현형을 측정하는 정량적 조직 적 방법. 이러한 방법은 시료 준비, 수집 및 분석과 관련된 모든 단계를 명확하게 하여 과학자들이 CHD를 정확하고 재현가능하게 측정할 수 있도록 합니다.

Introduction

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CHD는 인간에 있는 출생 결함의 일반적인 모형이고 출생 결함 관련 죽음의 주요한 원인1,2,3,4,5,6. 신생아의 약 90 %가 CHD에서 생존하지만, 환자의 삶과 의료 시스템에 무거운 부담을 부과, 수년에 걸쳐 상당한 이환율 및 의료 개입과 자주연관7,8,9,10. 순전히 유전 적 요인 의 외부, CHD의 원인은 제대로 이해4. 미국 심장 협회 및 기타 소스 에 따라 모든 CHD 케이스의 ~ 56-66 %를 차지하는 미확인 원인2,3,

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Protocol

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이 논문에서 언급된 실험에 사용된 모든 동물은 미시간 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 동물 관리 지침을 사용하여 처리되었습니다.

1. 배아 생산을 위한 C57BL6/J 마우스의 시간 적시 짝짓기

  1. 일단 마우스가 번식 연령 (6-8 주)에 도달하면 하렘 사육 형식 (즉, 한 남성 당 두 마리의 암컷)로 함께 넣습니다. 오후 나 저녁에 언젠가 번식을 위해 그들을 설정합니다.
    참고: 마우스는 하우징 시설 내에서 조명이 꺼진 후 1시간 이내에 번식하는 경우가 많습니다. 암컷은 약 6-8 개월에 번식에서 은퇴해야하며 남성은 늦어도 12 개월 이상 사용해야합니다.
  2. 계량 방법을 사용하여 수정을 결정하는 경우, 큰 그룹에서 마우스를 번식, 계량 방법은 시간 매립 결합이 copulation 플러그만 모니터링되는 방법보다 느린 속도로 진행하기 때문에.
  3. 다음날 아침, 오전 8시부터 오후 12시 사이에 교합 플러그를 확인하십시오. 플러그 분석이 오전 8시 이전에 수행되는 경우, 플러그가 질 운하에 너무 깊어 관찰될 위험이 있습니다. 플러그 분석이 오후 12시 이후에 수행되면 플러그가 떨어질 위험이 있습니다.
    1. 꼬리의 기지에 의해 여성을 잡고 마이크로 파이펫 팁의 사용으로....

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Results

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근육 다짐 지수는 두 개의 서로 다른 환경, 대조군 및 실험 군에서 발전하는 심장 사이에서 비교되었다. 이 프로토콜은 통계 분석을 허용하는 근육 조직의 압축을 정량적으로 분석하는 데 사용되었습니다. 근육 다짐은 비실험 조건에서 개발된 배아에 비해 실험심에서 현저히 감소되는 것으로 나타났다.

관찰 타이밍이 부정확해 보이는 경우 배아는 폐기되었습니다. 배아의 성장을 저해하는 것은 실험의 치료의 결과일 수 있고, 발달 진행의 범위가 있지만, 번식은 배아 발달의 타이밍을 보장하기에 충분히 간격을 두었다. 배아의 발판은 Theiler 스테이징21을사용하여 수행되었다. 샘플은 슬라이스가 일관성을 반영하지 않거나 명백한 눈물이나 주름이 있는 경우 제대로 슬라이스되지 않은 것으로 간주되었습니다. 염색은 조직 가장자리를 만들기에 충분한 .......

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Discussion

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이 프로토콜은 배아 심장에서 심장 발달의 분석에 관련된 기술을 탐구합니다. 이 방법의 몇몇 제한은 현미경 화상 진찰을 가진 사례 및 기술, 필요로 할 수 있는 예비 기술에 필요한 물리적 손재주입니다. 저온 유지 작업에서 얻은 조각이 지저분하면 헤마톡실린 및 에오신 얼룩이 명확하지 않거나 현미경에서 찍은 이미지가 조명이 좋지 않은 경우 ImageJ와 함께 사용되는 방법이 작동하지 않습니다. ImageJ 소프트웨어의 임계값 피쳐의 한계는 픽셀 값에 의존하는 임계값의 한쪽 끝에 위치한 픽셀을 선택한다는 것입니다. 따라서 임계값의 잘못된 쪽에 있는 모든 픽셀이 계산에 잘못 포함되거나 제외됩니다. 궁극적으로, 문제 해결 연구에 사용 하기 위해 프로토콜의 채택에 필요한 것입니다.

심장 추출이 너무 어려운 경우 2.8 단계로 건너 뛰는 것이 좋습니다. 또한 흉강에서 심장과 폐 이상을 제거하는 것이 좋습니다. 그런 다음 대상이 더 크고 조작하기 쉬워지며 심장과 미세 집게 사이의 직접적인 접촉이.......

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Disclosures

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저자는 보고할 공개가 없습니다.

Acknowledgements

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Aguirre Lab은 수상 번호 K01HL135464에 따라 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소와 수상 번호 19IPLOI34660342에 따라 미국 심장 협회에 의해 지원됩니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL 원뿔형 튜브FisherScientific# 1495970C
C57BL/6J MiceJackson LabsC57BL/6J - 재고
Coplin Staining Jars (x6)VWR Scientific# 25457-006
Coverslips 24X50MM #1.5VWR Scientific# 48393-241
Cryostat - Leica CM3050SLeicaN/A
해부 접시Fisher Scientific# 50930381
Dumont #5 - 세밀한 집게 (x2)Fine Science Tools# 11254-20
Eosin Y SolutionMillipore Sigma# HT110116-500ML
에틸 알코올 (순수, 200 proof)Fisher Scientific# BP2818-500
에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)Millipore Sigma# E9884-100G
EukittMillipore Sigma# 03989-100ML
미세 가위미세 과학 도구# 14060-10
형광 스테레오 현미경 Leica M165 FCLeicaN/A
글리신Millipore Sigma# 410225-250G
Graefe 집게미세 과학 도구# 11052-10
Graphpad Prism 8 소프트웨어Graphpad
ImageJ SoftwareImageJ
KimwipesFisher Scientific# 06666A
Mayer의 헤마톡실린 솔루션Millipore Sigma# MHS16-500ML
마이크로피펫 팁 - p200Fisher Scientific# 02707448
Microsoft Excel 소프트웨어Microsoft
OCT CompoundVWR Scientific# 102094-106
Olympus CkX53 현미경Olympus
페인트 브러시(최소 2개)
파라포름알데히드VWR Scientific# 02150146014% 용액으로 만들기(PBS에 용해)
파스퇴르 피펫Fisher Scientific# 13-711-7M
페니실린-스트렙토마이신ThermoFisher Scientific# 15140122
인산염 완충 식염수(PBS)ThermoFisher Scientific# 70011044전에 10배에서 1배로 희석하십시오
.스케일 메틀러 톨레도# MS1602TS
스케일메틀러 톨레도# MS105
메스 핸들 #3VWR Scientific# 10161-918
메스 블레이드VWR Scientific# 21909-612
스퀘어 몰드VWR Scientific# 100500-224OCT 몰드 용
설탕Millipore Sigma# S9378-500G
Superfrost Plus SlidesFisher Scientific# 1255015
수술용 가위파인 사이언스 도구# 14002-14
Tissue-Tek Accu-Edge 일회용 마이크로톰 블레이드VWR Scientific# 25608-964
여행 규모AcculabVIC 5101
XyleneMillipore Sigma214736-1L
000664 사용하기

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
  2. Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72

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