기존의 BODIPY 접합체는 일시성형, 적색 이동 접지 상태 이량체의 착취를 통해 살아있는 세포 단분자 국소화 현미경 검사법(SMLM)에 사용될 수 있습니다. 우리는 나노스코프 길이 척도에서 살아있는 포유류 및 효모 세포에서 세포내 중성 지질과 지방산을 추적하고 해결하기 위해 최적화된 SMLM 프로토콜을 제시합니다.
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방법 논문
라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체
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이 논문에서
요약
초록
단 하나 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM) 기술은 전통적인 형광 현미경 검사법의 광학 회절 한계를 극복하고 ~ 20 nm 정밀도로 세포 내 구조 및 생체 분자의 역학을 해결할 수 있습니다. SMLM의 전제 조건은 수천 개의 데이터 수집 프레임에서 포인트 확산 함수의 주공간적 중복을 피하기 위해 어두운 상태에서 형광 상태로 전환하는 형광단입니다. BODIPYs는 기존의 현미경 검사법에 사용되는 수많은 접합체가있는 잘 확립 된 염료입니다. 적색 이동 BODIPY 접지 상태 이량체 (DII)의과도 형성은 밝은 단일 분자 방출을 가능하게하여 단일 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM)을 가능하게합니다. 여기에서 우리는 살아있는 효모 및 포유류 세포에 있는 전통적인 BODIPY 접합체를 가진 SMLM를 위한 간단하 그러나 다재다능한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 초고해상도 이미지를 획득하고 단일 BODIPY-DII 상태를 추적하여 BODIPY 접합체의 주공간 적 정보를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 나노 스코프 길이 규모에서 살아있는 효모 및 포유류 세포에서 지질 방울 (LDs), 지방산 및 리소좀을 해결하기 위해이 절차를 적용합니다. 또한 다른 형광 프로브와 함께 사용할 경우 BODIPY 염료로 멀티 컬러 이미징 기능을 시연합니다. 우리의 대표적인 결과는 보디피 지방산과 효모의 중성 지질의 차등 공간 분포 와 이동성을 보여줍니다. SMLM에 대한 이 최적화된 프로토콜은 수백 개의 상용 BODIPY 접합체와 함께 사용할 수 있으며 이 작업의 적용을 훨씬 뛰어넘는 나노 스케일에서 생물학적 공정을 연구하는 데 유용한 리소스입니다.
서론
단 분자 국소화 현미경 검사법 (SMLM) 스토크 광학 재건 현미경 검사법 (STORM) 및 광 활성화 국소화 현미경 검사법 (PALM)과 같은 기술은 아베의 광학 회절 한계1,,2 및 단일 생체 분자의 역학을 추적하기위한 정보로 초고해상도 이미지를 생성하는 방법으로등장3,,4. SMLM과 호환되는 프로브에 대한 요구 사항 중 하나는 포인트 확산 함수(PSF)의 공간 중복을 피하기 위해 언제든지 활성 형광단의 수를 제어하는 기능입니다. 각각의 데이터 수집 프레임에서 각 형광형광단의 위치는 해당 포인트 확산 함수를 피팅하여 ~20nm 정밀도로 결정됩니다. 전통적으로, 형광의 온-오프 깜박임은 위성 광 전환1,2,2,5 또는 화학적으로 유도된 본질적인 깜박임6을통해 제어되었습니다. 다른 접근법은 불소-활성화 단백질7,,....
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프로토콜
참고 : 효모 복제 및 내생 태그는 최근 간행물10을참조하십시오.
1. 화상 진찰을 위한 효모 세포 견본의 준비
- w303 효모 균주의 액체 하룻밤 배양을 준비한다. 멸균 된 나무 막대기를 사용하여 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스트로오스가 함유 된 한천 판에서 소량의 효모 세포를 합성 완전 덱스트로스 (SCD) 배지의 ~ 2 mL의 배양 튜브에 넣습니다. 270 rpm 및 30°C에서 흔들리는 인큐베이터에서 밤새 튜브를 인큐베이션합니다.
- SCD에서 세포의 1:50 아침 희석을 수행합니다. 270 rpm 의 흔들림 인큐베이터에서 30°C에서 4시간 동안 희석된 세포를 배양하여, 세포가 지수상에서 성장하고 ~0.6의 광학 밀도(OD)에 도달할 수 있도록 한다.
참고: 절차는 어떤 신진 대사 상태가 공부되고 있는지에 따라 여기에서 달라질 수 있습니다. BODIPY 접합체는 지수 성장 단계에서 세포를 필요로하지 않는다. 그러나 고정 된 단계 동안 죽은 세포에서 자가 형광을 인식해야하며, 배경 신호가 너무 강해서 단일 BODIPY-DII 방출기를 분석할 수 없습니다. - 금식 세포를 연구하기 위해, 배지 교환없이 2 일 동안 효모 배양을 ....
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결과
여기서, 우리는 위의 프로토콜에 기초하여 BODIPY 접합체를 사용하여 SMLM에 대한 최적화된 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석 절차를 제시한다(도1A). SMLM 데이터를 획득하고 분석하기 위한 워크플로우의 예를 설명하기 위해 효모에서 BODIPY(493/503)를 사용하여 광학 회절 한계 미만의 LD를해결합니다(그림 1B-F).-F GFP, mEos2와 같은 다른 프로브와 함께 BODIPY의 상이한 다중 컬러 이미징 모드의 예는 도 2에도시되어 있다. 우리는 효모에서 대사 상태를 ~48 h에 대해 동일한 배지로 성장시킴으로써 조절 상태를 조작하고 BODIPY-C12가 먹이 조건 하에서 LDs로 의한 혼입과 는 대조적으로 금식 시 세포 주변부에서 움직이지 않는 비 LD 클러스터를 형성한다는 것을 보여줍니다
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토론
이 프로토콜에서는 기존의 BODIPY 접합체를 사용하여 공간 해상도가 상당히 개선된 SMLM 이미지를 얻는 방법을 시연했습니다. 이 방법은 이중 분자 만남을 통해 일시적으로 형성되는 기존의 BODIPY 염료의 이전에 보고된 적색 이동 DII 상태를 악용하는 것을 기반으로 합니다. 이러한 상태는 특히 흥분 하고 적색 이동 파장으로 감지 될 수 있으며 SMLM에 대 한 충분히 희소 하 고 수명이 짧은. 레이저 파라미터와 함께 BODIPY 단량체의 농도를 조정함으로써 현지화 및 신호 대 잡음의 최적의 밀도를 달성할 수 있습니다. 우리는 지방산 유사체와 중성 지질의 세포 내 분포와 이동성을 ~ 30 nm 해상도 (이론적 톰슨의 공식)로 사육 및 단식 조건 하에서 살아있는 효모 세포에서 해결했습니다. 또한 BODIPY DII 상태의 ~40%가 20Hz에서 2개 이상의 데이터 수집 프레임에 머물러 있어 단일 분자 추적이 서로 다른 조건에서 이동성을 정량화할 수 있다는 것을 발견했습니다. 우리의 결과는.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 R21GM127965의 밑에 건강의 국가 학회의 일반 의학의 국가 학회에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | 녹색 지방산 아날로그 |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | 빨간색 지방산 아날로그 |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | SCD용 아미노산 |
| 포도당 | 그마-알드리치 | G7021 | SCD 용 탄소원 |
| 셀비스 | C8-1.58-N | 챔버 커버 글라스 | |
| 에이트 웰, Lb-Tek II | 시그마-알드리치 | 챔버 커버 글라스 | |
| ET525/50 | 크로마 | 대역 통과 필터 | |
| ET595/50 | 크로마 | 대역통과 필터 | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | 데이터 수집 소프트웨어 | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD 카메라 광자 검출 용 | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | 여기 용 레이저 | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | 단일 분자 현지화 소프트웨어 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | 세포 배양 |
| 생세포 이미징 솔루션에 | ThermoFisher | A14291DJ | 이미징 버퍼 |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy 기반 리소좀 마커 |
| 포유류 ATCC U2OS 세포(버지니아주 매너서스) | Dr. Jochen Mueller(미네소타 대학교) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | 오일 이멀젼 목적 | |
| : 페니실린 스트렙토 마이신 | Gibco | 15140-122 | 항생제 |
| 나트륨 피루브 산 | Gibco | 11360-070 | 세포 배양 보충제 |
| T562lpxr | 크로마 | 빔 스플리터 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | 부착 세포 |
| W303 MATa 균주 | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | 의 해리부모 효모 균주 |
| 효모 질소 염기 | 시그마 - 알드리치 | Y1250 | 아미노산이없는 질소 염기 |
| zt405 / 488 / 561 / 640rdc | 크로마 | 쿼드 밴드 이색성 거울 |
참고문헌
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.
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재인쇄 및 허가
