이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 분열이 발달, 조직 항상성 및 질병 과정과 어떻게 통합되는지에 대한 우리의 이해에 필수적입니다. (1) 정자를 포함하는 전체 Drosophila 고환은 현미경 검사법을 위해 준비하기 가 상대적으로 쉽기 때문에, (2) 정자 세포의 큰 크기는 고해상도 화상 진찰을 위해 그(것)들을 잘 적색하고, (3) 강력한 Drosophila 유전 공구는 생체 내 분석과 통합될 수 있기 때문에 만연증을 겪고 있는 혈소판 세포는 이 분석을 위해 이상적입니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 제 3 instar 애벌레 및 초기 pupae에서 전체 고환의 준비를 위한 쉽게 접근가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 준비된 전체 고환에 있는 meiotic 정자 를 확인하는 방법과 시간 경과 현미경 검사법에 의해 그(것)들을 사는 심상하는 방법을 기술합니다. 전체 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 프로토콜도 제공됩니다. 애벌레 고환의 사용은 정자 세포 분석을 위해 성인 고환을 사용하는 사용 가능한 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 것은, 애벌레 고환은 성인 고환 보다는 세포로 더 작고 적게 혼잡하고, 이것은 크게 정액 세포의 고해상도 화상 진찰을 촉진합니다. 이러한 장점과 프로토콜의 적용을 입증하기 위해, 우리는 시간 경과 공초점 현미경검사법에 의해 이미지된 단일 정자 세포에서 세포 분열 동안 스핀들 미세소관에 대하여 소포체의 재분배를 보여주는 결과를 제시한다. 프로토콜은 형광 태그 단백질 또는 세포 기관 마커의 수의 발현과 결합 될 수있다, 유전자 돌연변이 및 기타 유전 도구뿐만 아니라, 전체 조직과 장기의 생리적 맥락에서 세포 분열 메커니즘의 분석을 위해이 접근 방식을 특히 강력.
서론
세포 분열은 배양1에서자란 세포주를 사용하여 종종 연구된다. 우리는 이 연구 결과2에서근본적인 기계장치의 귀중한 통찰력 그리고 이해의 재산을 얻고 있는 동안, 배양에서 성장한 세포는 온전하고 살아있는 조직에서 생기는 세포 분열의 생리학을 완전히 되풀이할 수 없습니다. 예를 들어, 손상되지 않은 조직 및 장기에서 세포는 자손 세포가 조직 내에 적절하게 위치할 수 있도록 적절한 장소와 적절한 시기에 분할하여 적절한 분화 또는 기능적 프로그램을 겪을 수 있도록 하고 세포 증식이 조직 성장 또는 항상성과 적절하게 조정되도록 해야 합니다3. 한편, 배양에서 성장한 세포의 경우, 세포 분열은 일반적으로 배양 배지4의성장 인자에 의해 조절되며, 따라서 우리는 이러한 세포로부터 조직 구조 또는 발달 신호전달과 같은 환경적 요인이 분열 과정에 어떻게 영향을 미치는지 배울 수 없다. HeLa 및 U2OS 세포와 같은 세포 분열을 연구하는 데 사용되는 많은 세포주가 전이성 종양5에서유래되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 이러한 암세포의 기본 생리학의 많은 양상, 예: 세포 주기 조절 기....
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프로토콜
1. 해부를 위한 동물, 도구 및 미디어 준비
- 수컷과 암컷이 날아다니는 것을 교차하여 원하는 유전자형의 자손을 얻습니다. meiotic spermatocytes의 확인 및 발판을 위한 유용한 형질전환 마커는 meiotic 스핀들 및 RFP-히스톤 2A를 표지하는 GFP-tubulin을 포함합니다8. 십자가 당 5 ~10 암컷을 사용하고 세 번째 instar 애벌레가 바이알의 측면을 크롤링 시작할 때까지 25 °C 인큐베이터에서 바이알에 표준 플라이 푸드에 십자가를 유지 (4-5 일). 일찍 흰 새끼가 하루 후에 형성되기 시작합니다.
- 미세 한 팁 으로 직선 집게 두 쌍을 가져옵니다. 팁이 날카로운지, 심지어 길이가 길고, 곧게 펴야합니다(그림 1A). 이러한 포셉은 해부용으로만 사용하며 사용하지 않을 때는 10 μL 파이펫 팁이 있는 캡을 사용하십시오.
-
메스 도구를 준비합니다.
- 검은 색 양극 산화 강철 곤충 핀의 무딘 끝을 핀 홀더에 넣고 홀더의 나사를 비틀어 핀을 제자리에 고정시다. 한 쌍의 집게와 해부 현미경 으로, 중간에 곤충 핀을 잡고 135 °(그림 ....
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결과
이 프로토콜이 성공적으로 실행되면, 고환은 공초점 현미경 검사법 또는 그밖 형광 현미경 방법에 의하여 화상 진찰을 위해 완전히 손상되지 않을 것입니다. 그림 3A에서볼 수 있듯이, 고환의 세포 조직이 보존되고, 정자 세포, 및 haploid 정자를 포함하여 다른 고환의 한쪽 끝에서 다른 세포 분화의 진행이 볼 수 있습니다. GFP-tubulin는 분할 정자 세포를 확인하고 만피증을 통해 세포의 진행의 살아있는 화상 진찰을 위한 유용한 마커입니다. 도 3B에도시된 바와 같이, 시작 된 만막증에 대한 정자 세포는 그들의 두 개의 눈에 띄는 미세 소관 아스터에 의해 식별 될 수있다. 메타페이즈에 의해 큰 meiotic 스핀들은 GFP-tubulin에 의해 아름답게 표지됩니다(그림 3C).
초파리 정자의 큰 크기.......
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토론
우리는 정액 세포 분열의 장기, 살아있는 화상 진찰을 위해 최적화된 애벌레 또는 초기 pupal Drosophila 고환의 준비를 위한 프로토콜을 기술했습니다. 이것은 손상되지 않은 조직의 생리적 맥락에서 세포 분열을 분석하기위한 강력한 방법입니다. 이 방법의 힘은 특정 유전자 돌연변이, 조직 특이적 RNAi 매개 억제 및 형광 표지된 단백질 및 세포기관 마커와 같은 Drosophila 유전 도구와 결합될 때 더욱 확장됩니다. 또한, 애벌레와 pupal 고환의 작은 크기, 유리 커버 슬립에 매우 가까운 분할 세포를 이미지 할 수있는 능력, 초고해상도 접근을 포함한 고해상도 이미징에 이상적인 방법을 합니다. 이 실험 시스템의 다양성은 세포 분열 동안 ER의 동적 재구성을 설명하는 대표적인 결과에 의해 입증된다. 초파리 정자 세포는 이러한 세포의 큰 크기와 상대적으로 느린 전달으로 인해 세포 분열 동안 세포 역학의 이러한 분석에 특히 유용합니다. 추가적으로, 동일 세포는 세포역학 역학.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 J.T.S에 국방부 창업 자금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5" 해부 프로브 | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" 유리 파스퇴르 Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 펜치 | 파인 사이언스 도구 | 11252-20 | 세밀한 팁이 있는 직선 포셉트 |
| 서리 낀 현미경 슬라이드 | Fisher | 12-544-2 | 고정 조직 장착용 슬라이드, 반투명 필기 표면 |
| 포함 할로카본 오일 700 | 시그마 | H8898-100 mL | |
| 루목스 접시 50 | Sarstedt | SAR946077410 | 가스 투과성 조직 배양 접시 |
| 현미경 커버 유리 | Fisher | 12-541-B | 22 mm x 22 mm, #1.5 유리 커버슬립 |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | 만드는 데 사용되는 곤충 핀 메스 도구 |
| 니켈 도금 핀 홀더 | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| 파라포름알데히드 32% 용액, EM 등급 | 전자 현미경 과학 | 15714 | |
| 계획 경사진 모서리 현미경 슬라이드 | Fisher | 12-549-5 | 해부에 사용되는 슬라이드 |
| PYREX Spot Plate | Fisher | 13-748B | 9-well glass 해부 접시 |
| Schneider의 Drosophila 매체 | Fisher | 21720-024 | |
| 주사기 필터, 0.22 &마이크로; m | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | 현미경 장착 매체 |
참고문헌
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (....
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재인쇄 및 허가
