환경 DNA(eDNA)는 일반적으로 알코올 침전, 여과 또는 응집을 사용하여 물 샘플에서 캡처합니다. 여기에 제시된 것은 진핵 세포, 원핵 세포 및 바이러스를 포함하는 물 샘플에서 용존 및 미립자 결합 핵산을 수집할 수 있도록 염화란타늄을 사용하는 선택적 프로토콜입니다.
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이 논문에서
요약
초록
환경 DNA(eDNA) 분석은 종 관리의 문제 해결을 위해 널리 사용되는 접근 방식이 되었습니다. 침입종 및(또는) 위험에 처한 종을 포함한 수수께끼 같은 종을 탐지하는 것이 목표이며, 일반적으로 물과 퇴적물을 검사하여 특징적인 DNA 서명이 있는지 확인합니다. eDNA 포획을 위해서는 신뢰할 수 있고 효율적인 절차가 필요하며, 특히 교육을 받지 않은 인력과 시민 과학자가 현장에서 쉽게 수행할 수 있는 절차가 필요합니다. 멤브레인 여과를 사용한 eDNA 포획은 현재 널리 사용됩니다. 이 접근 방식에는 필터 재료 및 다공성 선택, 필터 오염, 공정 수행에 필요한 현장 시간 등의 고유한 문제가 있습니다. 응집은 제한된 시간 내에 광범위한 영역을 포괄하기 위해 노력하는 샘플링 체제에 쉽게 구현하고 적용할 수 있는 대안을 제공합니다.
서론
2000년대 중반 이전에는 "환경 DNA"라는 용어가 일반적으로 물과 토양 미생물에서 얻은 DNA를 지칭하는 데 사용되었지만, 배설물 출처 추적 또는 외래종 탐지를 위해 인간과 동물의 DNA를 검출하는 데 일부 사용이 시작되었습니다 1,2,3. 현재 환경 DNA는 일반적으로 진핵 생물에서 벗겨진 세포의 DNA를 설명하는 데 사용되며, 이 DNA의 분석은 널리 사용되는 관리 도구가 되었습니다. 침입종이나 위험에 처한 종을 포함하여 수수께끼 같은 종을 탐지하는 것이 목표이며, 일반적으로 대상 종의 특징적인 DNA 서명이 있는지 물이나 퇴적물을 테스트하여 수행됩니다. 연구는 특정 PCR 분석(활성 샘플링)을 사용하여 단일 관심 종에 초점을 맞추거나 메타바코드 및 대규모 병렬 염기서열분석을 사용하여 많은 종을 동시에 검출할 수 있습니다.
지난 20년 동안 eDNA 연구와 관련된 샘플 수집, 샘플 처리 및 데이터 분석에서 많은 개선이 이루어졌습니다. 초기 연구에서는 물 샘플에서 DNA를 캡처하기 위해 알코올 침전을 사용했습니다3. 시도되고 사실이기는 하지만, 분석 감도를 높이기 위해 많은 양의 물을 분석해야 하는 필요성으로 인해 각 부피의 물 샘플에 대해 두 가지 부피의 에탄올이 필요하기 때문에 이 방법은 매력적이지 않습니다.
이후의 연구에서는 일반적으로 막 여과를 사용하여 eDNA가 세포 결합에서 자유 용해 상태까지 연속체에 존재하지만 용해된 DNA는 급격한 분해의 영향을 받기 때문에 세포 결합 DNA가 가장 중요한 부분을 나타낸다고 합리화했습니다. 필터 재료 및 공극 크기 최적화는 필터 4,5,6에서 포획된 eDNA를 추출하기 위한 최적의 방법과 마찬가지로 널리 논의되고 논의되고 있습니다.
eDNA 캡처에 대한 세 번째 접근 방식은 응집(flocculation)으로, 이는 물, 맥주, 와인을 포함한 액체를 정화하는 데 수 세기 동안 사용되어 온 프로세스입니다. 여러 연구에서 응집을 사용하여 자연 또는 음용수에서 바이러스를 포획했습니다 7,8,9,10,11. 이러한 연구는 일반적으로 사전 응집된 탈지유 또는 염화철을 포획제로 사용했습니다. 염화철 방법은 일반적으로 PCR 반응 억제로 인해 다운스트림 분석 분자 문제를 일으킵니다12,13. 사전 응집된 탈지유를 사용하는 방법은 응집제의 사전 준비, pH 조절이 필요하며 지금까지는 바이러스 7,8,9의 포획에만 적용되었습니다.
최근에는 란타늄 (III) 염화물의 사용을 기반으로 한 박테리아 및 바이러스의 응집 포획이 연구되었습니다 12,13,14,15. 저자는 염화란탄의 결합이 저농도(0.2mM)에서 효과적이기 때문에 이 방법으로 생존 가능한 병원체를 수집할 수 있음을 입증했습니다. 또한, 란타늄 응집은 염화철과 달리 온화한 조건에서 킬레이트화를 통해 되돌릴 수 있습니다.
따라서, 생물학적 미립자를 포집하기 위해 염화란타늄을 사용한 응집은 소량의 첨가된 농축 응집제만 필요하고, 엄격한 pH 제어가 필요하지 않으며, 시료 부피가 밀리리터에서 갤런으로 확장될 수 있다는 점을 감안할 때 매력적입니다. eDNA의 포획에 적용하면 세포, 세포 이하(미토콘드리아 및 엽록체) 및 용해된 DNA가 쉽게 회수됩니다. 박테리아와 바이러스를 동시에 수집하여 단일 물 샘플에서 병원체 테스트 및(또는) 추가 생태학적 연구를 수행할 수 있습니다. 물 샘플에서 용존 및 미립자 결합 핵산을 수집할 수 있는 염화란타늄을 사용하는 응집 프로토콜이 제시됩니다.
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프로토콜
1. 장비 및 응집 시약 준비의 오염 제거
- 모든 병, 튜브 및 기타 이전에 사용한 장비를 식기 세척 세제와 뜨거운 물로 철저히 세척하십시오.
- 모든 병, 튜브 및 기타 이전에 사용한 장비에 6% 구연산 용액을 뿌려 미네랄 침전물을 제거하고 20분 동안 그대로 둔 다음 수돗물로 헹굽니다.
- 모든 병(용기 부피의 약 10%)에 10배 희석된 가정용 표백제(차아염소산나트륨의 최종 농도 0.5-0.6%)를 넣고 흔들어 최소 1시간 동안 그대로 둔 다음 표백제의 흔적이 남지 않을 때까지 배수하고 수돗물로 헹굽니다. 그런 다음 탈 이온수로 한 번 헹굽니다.
- 모든 병을 말리십시오.
- 모든 수집 병과 뚜껑을 생물 안전 캐비닛에 넣고 자외선 살균 램프를 사용하여 각 병을 2시간 동안 회전시키고 30분마다 1/4바퀴씩 뚜껑을 닫습니다.
- 병에 뚜껑을 놓고 느슨하게 조입니다. 각 병의 무게를 측정하고 병에 빈 무게를 기록합니다.
- 100mL 탈이온수에 3.71g을 용해하여 란타늄(III) 염화물 헵타하이드레이트 100mM 용액을 준비합니다. 화학 물질이 공기에 노출되는 것을 최소화하려면 염화란탄이 흡습성이므로 사용 사이에 테이프로 병을 밀봉하십시오.
주의: 염화란탄에는 경고 위험 문구라는 신호어가 있습니다. H315는 피부 자극을 일으킵니다. H319는 눈에 심한 자극을 일으킵니다. H335은(는) 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 사용하십시오. 자세한 내용은 재료의 SDS를 참조하십시오. - 84.01g의 중탄산나트륨을 1L 탈이온수에 용해시켜 1M 용량의 중탄산나트륨 용액을 준비합니다. 필터는 살균하여 실온에서 보관하십시오.
2. 시료 채취 및 응집
- 적절한 크기의 병을 채워 각 현장과 하나의 필드 블랭크(오염을 통제하기 위해 현장에서 채워진 음용수가 포함된 샘플)에서 샘플을 수집합니다. 실험 설계 및 의도된 목적에 따라 채취한 샘플의 수를 조정합니다. 다음과 같은 경우 팽창을 허용하기 위해 병 어깨 너머로 병을 과도하게 채우지 마십시오.amples를 얼려야 합니다.
- 날짜, 시간 및 GPS 위치를 포함한 관련 메타데이터를 기록합니다. 샘플 용기에 레이블을 지정합니다.
- 1M 중탄산나트륨 용액을 각 샘플에 추가하고 블랭크 필드를 입력합니다. 500mL 샘플당 10mL를 추가합니다.
- 병의 뚜껑을 닫고 섞습니다.
- 각 샘플에 100mM 염화란탄을 추가하고 블랭크 필드를 입력합니다. 500mL 샘플당 1mL를 추가합니다.
- 뚜껑을 닫고 철저히 섞습니다. 전기 테이프를 사용하여 캡을 고정합니다.
- 실지 실험실에 돌려보낼 때까지 얼음에 저장하십시오, 그 후에 표본은 flocs가 콘테이너의 바닥에 침전하는 것을 허용하거나 -20 °C에 얼어 추가 처리를 위한 두번째 실험실에 선적하는 것을 허용하기 위하여 밤새도록 저장하고, 냉장하고 서 있을지도 모릅니다. 샘플은 액체 팽창을 허용하고 용기 파열을 방지하기 위해 똑바로 세워서 냉동해야 합니다.
3. 플록의 처리
- 냉각기에서 실온의 냉동 샘플을 해동하거나 동결되지 않은 샘플을 샘플 상층액 흡인을 위한 peristatic 펌프 및 튜빙 설정이 포함된 적절한 작업대 영역으로 이동합니다. 연동 펌프를 통과하는 튜브가 바닥의 큰 양동이로 배출되는지 확인하십시오. 흡입구에는 섭취량을 조절할 수 있는 깨끗한 플라스틱 빨대가 장착되어 있어야 합니다.
- 연동 펌프를 사용하여 마시는 빨대를 사용하여 액체 표면 바로 아래에서 먼저 직접 흡입하고 빨대 흡입구를 액체 레벨에 따라 아래로 이동시켜 상층액을 제거합니다. 흡입구를 폰틸(병 바닥에 융기된 딤플)에 놓도록 조심스럽게 움직여 마지막 상층액을 제거합니다. 이렇게 하면 플록이 주변부에 모이는 동안 액체를 최대한 제거할 수 있습니다( 그림 1 참조).
그림 1: 단위 중력에서 침전된 플록의 수집. 세포 물질과 eDNA를 포함하는 플록은 샘플 병의 바닥에 침전되며 상층액이 제거된 후 회수할 준비가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 깨끗한 빨대를 부착하고 각 샘플에 대해 상층액 제거를 반복합니다.
- 깨끗한 20 mL 피펫 및 피펫 컨트롤러를 사용하여 플록 현탁액을 50 mL 원심분리 튜브로 완전히 옮깁니다. 소량의 탈이온수 헹굼(약 5mL)을 사용하여 시료 병에서 잔류 플록이 회수되도록 합니다.
- 모든 50mL 튜브를 탈이온수와 동일한 부피로 조정하고 2,500 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 플록을 수집합니다.
- 상층액을 붓고 깨끗한 종이 타월 위에 튜브를 거꾸로 세워 배수합니다.
- 와류 혼합에 의해 0.5M EDTA, pH 8.0 1mL에 플록을 재현탁시킨 다음 4mL 1x TE 용액, pH 8.0을 첨가하고 다시 혼합합니다. 재현탁된 플록을 15mL 코니컬 원심분리 튜브로 옮기고 50μL의 10% 선형 폴리아크릴아미드와 와류를 첨가합니다. 100% 이소프로판올 5mL를 넣고 섞은 후 얼음 위에 20분 동안 그대로 둡니다.
- 6,000 x g에서 20분 동안 원심분리기를 사용하여 DNA와 세포 미립자를 수집합니다. 상층액을 붓고 깨끗한 종이 타월에 거꾸로 놓아 배수합니다. 약간 건조시키되 과도하게 건조하지 마십시오.
- 25μg 용량의 비드 박동 및 스핀 컬럼 결합을 사용하는 상용 키트를 사용하여 플록 DNA 추출 프로세스를 시작합니다.
- 먼저, 키트와 함께 제공된 800μL의 용해 완충액에 플록을 재현탁하고 현탁액을 비드 박동 튜브로 완전히 옮깁니다. Bead는 그 사이에 냉각과 함께 짧은 시간 동안 floc 서스펜션을 이겼습니다. 균질액은 이 시점에서 냉동 보관하거나 키트 프로토콜을 계속할 수 있습니다.
- 먼저 스핀 컬럼에서 DNA를 100μL로 용리한 다음 스핀 튜브를 통해 용출액을 재활용합니다.
- 마지막으로, 추가로 100μL의 용리 완충액 분취량으로 컬럼의 잔류 DNA를 용리하여 총 부피를 200μL로 만듭니다. 이렇게 하면 회수가 극대화됩니다.
- eDNA를 수집, 준비 및 분석하여 이 프로토콜의 성능과 널리 사용되는 여과 방법과 관련된 성능을 입증합니다.
- qPCR 마스터 믹스 1개, 소 트롬빈 25μg/mL14,16, 0.4μM 정방향 및 역방향 프라이머, 템플릿 2μL(회수된 샘플 DNA의 1%)를 포함하는 반응을 준비합니다. 바우처 DNA를 사용하여 생성된 정제 및 정량화된 PCR 앰플리콘의 연속 희석을 사용하여 표준 곡선을 구성합니다. 대안적으로, 타겟은 상업적으로 합성될 수 있다.
- 사용 가능한 표준물질이 없는 경우 비교 정량화 방법을 사용합니다. 이 예에서는 95°C에서 10분 동안 반응 조건을 사용하여 열순환을 수행한 다음 10초 동안 95°C, 30초 동안 57°C, 30초 동안 72°C의 40회 사이클을 수행하지만 이러한 조건은 다른 분석을 위해 조정해야 합니다. 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
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결과
두 마리의 동부 채색거북(Chrysemys picta picta)이 있는 수족관에서 채취한 8개의 500mL 물 샘플(각 450mL)을 사용하여 설명된 프로토콜을 사용하여 eDNA를 준비했습니다. 또 다른 8개의 500mL 물 샘플을 바인더가 없는 1.5μm 다공성의 47mm 유리 섬유 필터를 통해 여과하고 응집 프로토콜에 사용된 것과 동일한 추출 방법을 사용하여 eDNA를 추출했습니다. 두 가지 방법을 사용하여 제조된 DNA는 타겟 종의 미토콘드리아 제어 영역을 표적으로 하고 타겟 생물에 특이적인 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 정량적 PCR을 사용하여 분석했습니다. 이 시연을 위한 표적 유기체는 Chrysemys picta picta 였고, 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열 (5'-CGTCCATGTAACAGATGGCGT-3') 및 (5'-AAACCACCGTATGCCAGGTT-3')을 가졌다.
표준 곡선이 필요하지 않기 때문에 프로토콜...
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토론
이 기술은 간단하지만 몇 가지 단계는 성공에 매우 중요합니다. 플록의 수집 및 이동은 DNA를 잃지 않도록 완전히 수행되어야 합니다. 잔류 물질은 전략적인 헹굼을 사용하여 수집해야 합니다. 설명된 프로토콜은 응집된 물질의 최종 처리를 위해 상용 DNA 추출 키트를 사용합니다. 다른 추출 방법도 유사하게 수행하거나 성능이 우수할 수 있지만, 프로토콜의 이 부분에 대한 수정은 철저하게 테스트되지 않았습니다.
설명된 프로토콜은 시료 간의 시간 차이를 최소화하면서 널리 분산된 현장에서 시료를 채취해야 하거나 높은 수준의 부유 침전물로 인해 필터가 쉽게 막힐 수 있는 시료 채취 전략에 유용합니다. 이 프로토콜의 단점은 현장에서 처리하기 위해 현장에서 현장 스테이션으로 물 샘플을 운송하거나 처리를 위해 다른 실험실로 배송해야 한다는 것입니다. 여과 방법은 쉽게 운반 및 배송할 수 있는 결합된 대상 물질을 운반하는 가볍고 컴팩트한 ...
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공개 사항
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감사의 글
이 작업은 미국 지질 조사국의 자금 지원으로 완료되었습니다.
상표명, 회사 이름 또는 제품 이름의 사용은 설명 목적으로만 사용되며 미국 정부의 보증을 의미하지 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | 여러 상용 소스에서 | ||
| 1 x TE 버퍼, pH 8.0 | 여러 상업용 소스에서 | ||
| 15ml 원추형 원심분리기 튜브 | 일회용 | ||
| 16온스 PET 투명 사각형 병 | 세척 및 오염 | ||
| 38/400 폴리프로필렌 캡(압력 감지 포함) 라이너: | 사용할 때까지 캡을 느슨하게 부착한 상태로 두십시오. 압력 감지 라이너를 밀봉하기 위해 단단히 캡을 씌웁니다. | ||
| 50mL 원추형 원심분리기 튜브 | 일회용 | ||
| 6% 구연산 용액 | 재사용 가능한 샘플 병에서 미네랄 침전물을 제거하는 데 사용합니다. | ||
| 분변/토양 미생물 키트 | 억제제 제거 수지 또는 컬럼 | ||
| 란타늄(III) 염화물 헵타하이드레이트 | 100mM 스톡 용액 | ||
| 연동 DC 펌프 | 모든 연동 펌프가 수행되거나 사이폰 | ||
| 폴리아크릴릴 캐리어 | 10% 선형 폴리아크릴아미드 | ||
| 중탄산 | 나트륨1M, 필터 살균 및 실온 |
참고문헌
- Mathes, M. V., et al. Presumptive Sources of Fecal Contamination in Four Tributaries to the New River Gorge National River, West Virginia, 2004. , Report No. 2007-1107 (2007).
- Caldwell, J. M., Raley, M. E., Levine, J. F. Mitochondrial Multiplex Real-Time PCR as a Source Tracking Method in Fecal-Contaminated Effluents. Environmental Science & Technology. 41 (9), 3277-3283 (2007).
- Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology Letters. 4 (4), 423-425 (2008).
- Djurhuus, A., et al. Evaluation of Filtration and DNA Extraction Methods for Environmental DNA Biodiversity Assessments across Multiple Trophic Levels. Frontiers in Marine Science. 4 (314), (2017).
- Hinlo, R., Gleeson, D., Lintermans, M., Furlan, E. Methods to maximise recovery of environmental DNA from water samples. PLOS One. 12 (6), 0179251(2017).
- Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Scientific reports. 8 (1), 4682(2018).
- Aguado, D., et al. A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples. Journal of Visualized Experiments. (147), e58463(2019).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Payment, P., Fortin, S., Trudel, M. Ferric chloride flocculation for nonflocculating beef extract preparations. Applied Environmental Microbiology. 47 (3), 591-592 (1984).
- Poulos, B. T., John, S. G., Sullivan, M. B. Iron Chloride Flocculation of Bacteriophages from Seawater. Methods Molecular Biology. 1681, 49-57 (2018).
- Zhang, Y., Riley, L. K., Lin, M., Hu, Z. Lanthanum-based concentration and microrespirometric detection of microbes in water. Water Research. 44 (11), 3385-3392 (2010).
- Zhang, Y., Riley, L. K., Lin, M., Hu, Z. Determination of low-density Escherichia coli and Helicobacter pylori suspensions in water. Water Research. 46 (7), 2140-2148 (2012).
- Schill, W. B., Galbraith, H. S. Detecting the undetectable: Characterization, optimization, and validation of an eDNA detection assay for the federally endangered dwarf wedgemussel, Alasmidonta heterodon (Bivalvia: Unionoida). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 29 (4), 603-611 (2019).
- Zhang, Y., Riley, L. K., Lin, M., Purdy, G. A., Hu, Z. Development of a virus concentration method using lanthanum-based chemical flocculation coupled with modified membrane filtration procedures. Journal of Virology Methods. 190 (1-2), 41-48 (2013).
- Zhang, Y., et al. Bovine thrombin enhances the efficiency and specificity of polymerase chain reaction. BioTechniques. 57 (6), 289-294 (2014).
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