생쥐의 등쪽 raphe 핵에서 5,7-디하이드록시트립타민의 입체주사에 의한 세로토닌성 뉴런의 제거

요약

이 프로토콜은 상시상동(superior sagittal sinus)의 손상을 방지하기 위해 각진 접근법을 사용하여 DRN에 5,7-디하이드록시트립타민을 입체택시 주입하여 배쪽 강피핵(DRN)-병변 마우스 모델(실험 마우스에서 생존율 >90%)을 설명합니다.

초록

입체주사는 설치류의 표적 뇌 영역에 화합물 또는 바이러스를 직접 전달하는 데 널리 사용되었습니다. 등쪽 강간 핵(dorsal raphe nucleus, DRN)에 있는 세로토닌 뉴런을 직접 표적으로 삼는 것은 상시상동(superior sagittal sinus, SSS) 아래에 위치하기 때문에 과도한 출혈과 동물의 죽음을 유발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 DRN에서 >70% 5-HT 양성 세포의 안정적인 손실과 함께 DRN 세로토닌성 뉴런 병변 마우스 모델(>90% 생존율)의 생성을 설명합니다. 병변은 SSS의 손상을 방지하기 위해 각진 접근 방식(전방/후방 방향 30°)을 사용하여 선택적 세로토닌성 신경독 5,7-디하이드록시트립타민(5,7-DHT)을 DRN에 입체 주입하여 유도됩니다. DRN 세로토닌성 뉴런 병변 마우스는 불안 관련 행동 변화를 나타내며, 이는 DRN 병변 수술의 성공을 확인하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 DRN 병변에 사용되지만, 정중선 구조를 피하기 위해 각도 주입이 필요한 다른 입체 주사에도 사용할 수 있습니다. 이 DRN 세로토닌성 뉴런 병변 마우스 모델은 범불안 장애 및 주요 우울 장애와 같은 정신 장애의 발병기전에서 세로토닌 뉴런의 역할을 이해하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서론

세로토닌 또는 5-하이드록시트립타민(5-HT)은 주로 장과 뇌에서 생성되는 중요한 신경 전달 물질이며 다양한 심리적 기능에 영향을 미칩니다. 중추신경계(CNS)에서 세로토닌계는 기분과 사회적 행동, 수면과 각성, 식욕, 기억력, 성적 욕구를 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. 중추신경계에서 세로토닌은 세로토닌 뉴런에 의해 합성되며, 이는 다음 두 그룹으로 분리될 수 있습니다. 로스트랄 그룹(rostral group)은 사실상 전체 뇌에 신경 분포하는 상승 돌기를 가지고 있습니다. 그리고 주로 척수에 돌출된 꼬리 그룹¹. 뇌에 있는 세로토닌성 뉴런의 약 85%를 포함하는 상부군은 꼬리 선형 핵(caudal linear nucleus), 정중유핵(median raphe nucleus), 그리고 뇌에서 세로토닌성 뉴런이 가장 많이 모여 있는 DRN으로 구성되어 있습니다.

세로토닌 시스템의 조절 장애는 일반적으로 주요 우울 장애(MDD) 및 범불안 장애(GAD)의 발병기전과 관련이 있는 것으로 여겨집니다². 이는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(SSRI)가 이러한 정신 질환에 효과적인 약리학적 치료법이라는....

프로토콜

모든 외과적 개입 및 동물 관리 절차는 중국 상하이 퉁지대학교 생명과학기술대학 동물위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동물의 사육

1. 수컷 C57BL/6NCrl 마우스(10주령, 25g, n = 21)를 12시간/12시간 라이트/다크 주기에서 표준 조건(24°C 온도, 55% 습도)으로 유지합니다.
2. 음식과 물을 자유자재로 제공하십시오.
   참고: 여기에서 3개의 마우스가 바늘 트랙을 확인하는 데 사용됩니다.

2. 시약의 준비

알림: 모든 약물 준비 단계는 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 수행해야 합니다. 준비된 모든 용액은 -80°C 냉동고에 보관됩니다. 한 번에 하나의 부분 표본을 사용하고, 완전히 해동하고, 사용하기 전에 잘 섞고, 튜브에 남은 음식은 버리고, 냉동 및 해동을 반복하지 않는 것이 좋습니다.

1. 0.9% 식염수 100mL에 0.25g의 데시프라민 염산염을 용해시켜 2.5mg/mL 용액을 생성합니다. 0.22μm 공극 크기의 친수성 PES 멤브레인이 있는 주사기 필터를 사용하여 용액을....

결과

코로나 단면에서 DRN의 위치는 SSS와 수로 바로 아래에 있습니다(그림 1B, C). 따라서 표준 절차를 사용하여 DRN을 표적으로 삼으면 마우스¹⁶에서 대량 출혈과 높은 폐사율을 유발할 수 있습니다. 따라서 SSS의 손상을 방지하기 위해 표준 수직 접근 방식 대신 각진 접근 방식을 사용하여 입체 주입을 수행했습니다(그림 1A, B). 뇌로 들어가는 바늘의 위치를 확인하기 위해 입체 주사를 맞은 쥐를 수술 직후 희생하고, 관류된 뇌를 분리하여 조직학적 검사를 실시했습니다. 그림 1C에서 볼 수 있듯이, 병변(바늘 자국)은 수로 아래의 DRN에만 국한되어 있었습니다.

ETM의 억제 회피는 불안을 평가하는 데 적합한 행동.......

토론

이 프로토콜은 높은 병변 재현성과 낮은 폐사율을 가진 신뢰할 수 있는 DRN 세로토닌 뉴런 병변 마우스 모델의 생산을 성공적으로 설명합니다. DRN을 표적으로 삼는 것은 DRN¹⁶ 바로 위에 위치한 SSS를 손상시키고 과도한 출혈과^{심지어 사망14}을 초래할 수 있기 때문에 복잡한 작업입니다. 따라서 SSS의 손상을 방지하기 위해 조작 암을 AP 방향으로 30°로 설정하여 입체성 주입을 수행했습니다(그림 1A,B). 수로 아래에 표시된 바늘 트랙(그림 1C)은 DRN의 정확한 표적을 확인합니다. 수술 1개월 후, DRN 세로토닌성 뉴런 병변 마우스는 ETM 테스트에서 현저히 낮은 잠복기를 보였으며, 이는 불안 완화 행동을 나타내며(

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22미크론 주사기 필터	Millipore	SLGPRB
3% 과산화수소	Caoshanhu Co., Ltd, Jiangxi, China
5,7-Dihydroxytryptamine	Sigma-Aldrich	SML2058	3ug/ul, 2ul
소형 소동물 마취기	RWD Life Science Co., Ltd	R500 시리즈
저온 유지 장치	Leica Biosystems, Wetzlar, 독일	CM1950
Cy 3 AffiniPure 당나귀 안티 염소 IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	1 : 2,000
dapi	Sigma-Aldrich	D8417
desipramine hydrochloride	Sigma-Aldrich	PHR1723	25mg / kg
Eppendorf tube	Quality Scientific Plastics	509-GRD-Q
goat anti-5-HT 항체	Abcam	ab66047	1:800
GraphPad Prism	Graphpad Software Inc, CA, US
Hamilton Microliter 주사기	Hamilton	87943
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	5mg/kg
L-아스코르브산	BBI Life Sciences	A610021-0500	0.10%
lidocaine 연고	Tsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. Ltd	H20063466
ofloxacin 눈 연고	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, 중국	H10940177
연동 펌프	Huxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, China	HL-1D
입체 택시 장치	RWD Life Science Co., Ltd	68018
초저온 냉동고	Haier	DW-86L388
소용돌이	Kylin-bell	VORTEX-5