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방법 논문

미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송

10K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60993

⸱

2020년 5월 5일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Sagol School of Neuroscience, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

축색 수송은 운동 신경 건강을 위한 중요한 기계장치입니다. 이 프로토콜에서 우리는 미세 유체 챔버를 사용하여 운동 뉴런 축축에서 산성 구획및 미토콘드리아의 축산 수송을 추적하기위한 상세한 방법을 제공합니다.

초록

운동 뉴런 (MN)은 매우 긴 축축을 가진 고도로 편광된 세포입니다. 축 색 수송은 MN 건강에 대 한 중요 한 메커니즘, 신경 성장에 기여, 개발, 그리고 생존. 우리는 MN 축색에 형광 표지된 소기관의 축색 수송을 추적하기 위한 미세 유체 챔버 (MFC)의 사용을 위한 상세한 방법을 기술합니다. 이 방법은 빠르고 비교적 저렴하며 공간과 시간에서 세포내 큐를 모니터링할 수 있습니다. 우리는 단계별 프로토콜을 설명한다: 1) 폴리디메틸실록산(PDMS) MFC의 제조; 2) MFC에서 복부 척수 이식 및 MN 해리 배양의 도금; 3) 미토콘드리아 및 산성 구획의 라벨링 과 라이브 공초점 상상력; 4) 수동 및 반자동 축색 수송 분석. 마지막으로, 우리는 HB9::GFP 복부 척수 의 미토콘드리아 및 산성 구획의 수송에 있는 다름을 시스템 타당성의 증거로 축삭을 심출한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다양한 축색 부품의 축색 수송을 연구하기 위한 효율적인 도구와 공간 실험 가능성을 발견하는 데 도움이 되는 MFC 사용에 대한 단순화된 설명서를 제공합니다.

서론

MN은 성인 인간에서 1 미터 까지 도달하는 긴 축색을 가진 높게 편광한 세포입니다. 이러한 현상은 MN 연결 및 기능 유지 관리에 중요한 과제를 만듭니다. 따라서, MN은 세포체에서 시냅스및 뒤로 축세포를 따라 정보, 세포기관 및 물질의 적절한 수송에 의존합니다. 단백질 RNA 및 세포기관과 같은 다양한 세포 성분은 축색을 통해 정기적으로 셔틀됩니다. 미토콘드리아는 MN에서 일상적으로 수송되는 중요한 세포기관입니다.1,2 미토콘드리아의 축색 수송은 잘 연구 된 과정3,,4. 흥미롭게도, 미토콘드리아 수송에 있는 결점은 몇몇 신경 퇴행성 질병 및 특히 MN질병5에서관련시키기 위하여 보고되었다. 산성 구획은 MN 축색을 따라 움직이는 본질적인 세포기관에 대한 또 다른 예가 됩니다. 산성 구획에는 리소좀, 내인성, 트랜스 골지 장치 및 특정 분비 소포6이포함된다. 산성 구획의 축축한 수송에 있는 결점은 몇몇 신경 퇴행성 질병 에서 뿐만 아니라7에서찾아냈고, 최근 논문은 MN 질병8에서그 중요성을 강조합니다.

축축산 수송을 효율적으로 연구하기 위해, 체세포와 축색 구획을 분리하는 미세 유체 챔버는 자주9,,10을사용한다. 미세 유체 시스템의 두 가지 중요한 장점, 및 구획화 및 축슨의 분리는, 아세포 과정(11)의연구에 이상적 렌더링. 신경 세포 체와 축세포 사이의 공간 분리는 다른 뉴런 구획의 세포 외 환경을 조작하는 데 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 축사 대 소마). 생화학적, 신경 성장/변성 및 면역 형광 분석실험은 모두 이 플랫폼에서 유익합니다. MFC는 또한 골격 근12,,13,,14와같은 다른 세포 유형과 뉴런을 coculturing으로써 세포 간 통신을 연구하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

여기에서는 운동 뉴런에서 미토콘드리아 및 산성 구획 수송을 모니터링하기 위한 간단하면서도 정확한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 역행 및 전위 이동 소기관의 상대적 비율뿐만 아니라 수송 속도의 분포를 비교하여이 방법의 사용을 보여줍니다.

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프로토콜

이 프로토콜에서 동물의 관리 및 치료는 동물 윤리에 대한 텔 아비브 대학위원회의 감독과 승인하에 수행되었다.

1. MFC 준비

  1. 1차 금형의 PDMS 주조(그림 1)
    1. 자세한 프로토콜9에따라 기본 금형(웨이퍼)을 구입하거나 생성합니다.
    2. 코팅 단계로 진행하기 전에 가압 공기를 사용하여 웨이퍼 플랫폼에서 모든 유형의 먼지를 제거하십시오. 웨이퍼의 표면은 부드럽고 선명하게 보입니다.
    3. 액체 질소 50 mL로 용기를 채웁니다. 10 mL 주사기와 23G 바늘을 준비합니다.
      참고 : 이 단계의 모든 절차는 화학 후드에서 수행해야합니다.
    4. 화학 후드에서 주사기와 바늘을 사용하여 액체 질소 2 mL를 풀링하십시오. 공기가 그려진 것처럼 보일 지 모르지만 주사기는 질소로 채워져 있습니다(그림 1A). 웨이퍼 함유 플레이트를 밀봉 가능한 용기에 놓습니다.
    5. 스크류는 클로로트리메틸실란 병을 열고 질소로 채워진 주사기를 사용하여 고무 캡을 관통하고 주사기의 전체 내용물 전체를 병에 주입합니다. 바늘을 당기지 않고 병을 거꾸로 뒤집고 클로로트리메틸셀란 2mL를 다시 그립니다.
      참고 : 주사기 압력으로 인해 소량의 클로로 트리메틸스틸란이 바늘에서 분사됩니다. 위험을 방지하려면 바늘을 후드의 내벽을 향하게합니다(그림 1B).
    6. 클로로트리메틸스틸란을 용기(1.1.4단계로부터)에 균일하게 펴지만, 웨이퍼 또는 웨이퍼 함유 플레이트에 직접 확산되지는 않는다. 용기를 닫고 웨이퍼 당 5 분 동안 배양하십시오.
      참고: 웨이퍼가 클로로트리메틸실란으로 코팅된 것은 이번이 처음인 경우, 각 웨이퍼에 대해 1시간 배양이 허용되어야 합니다.
    7. 30 분 동안 화학 후드에서 웨이퍼와 용기를 꺼내지 마십시오.
      주의: 클로로트리메틸란은 휘발성이 높습니다.
    8. PDMS 염기(재료 표참조)를 50mL 튜브에 무게를 두고 PDMS 경화제를 각각 16:1 의 비율로 추가합니다(예: 염기 47.05 g 및 경화제 2.95g). 저속 회전터를 사용하여 10분 동안 섞으세요.
    9. PDMS를 각 웨이퍼 함유 플레이트에 원하는 높이로 붓습니다(도1C).
      참고 : 얇은 미세 유체 챔버 (최대 3-4mm)를 사용하면 배양 접시의 순도가 향상되고 누출을 방지 할 수 있습니다.
    10. 모든 플레이트를 진공 건조기 내부에 2시간 동안 함께 놓습니다(그림1E). 이 공정은 PDMS 내에 갇힌 공기를 제거하여 기포를 제거하고 명확하고 균일한 금형을 형성합니다.
    11. 접시를 오븐 내부에 70°C(그림1E)에서3시간(또는 하룻밤)에 놓습니다.
      참고 : 오븐에 배치 할 때 접시는 수평이어야합니다.
  2. 에폭시 금형의 PDMS 주조
    참고: 웨이퍼 준비는 비용이 많이 들고 특수 장비가 필요하며 깨지기 쉬운 웨이퍼가 손상될 수 있으므로 웨이퍼의 에폭시 복제본을 생성할 수 있습니다. 복제본은 저렴하고 내구성이 뛰어나며 미세 유체 챔버의 대량 생산에 사용할 수 있습니다.
    1. PDMS(1.1.8-1.1.11에 기재된 대로)를 원래 웨이퍼내로 캐스팅 및 경화한다.
    2. PDMS의 과잉 부분을 제거하고 잘라내어 미세 유체 요소와 미세 유체 챔버로 처리하는 데 필요한 기능 영역만 남깁니다.
    3. 즉시 먼지가 축적되지 않도록 두껍고 끈적끈적한 테이프로 PDMS를 감쌉니다.
    4. 내부의 전체 PDMS에 맞는 조직 배양 등급 플라스틱 접시를 선택하고 주위에 에폭시를위한 공간을 남겨주세요. PDMS에서 플라스틱 접시까지의 거리는 5mm 미만이어야 합니다.
    5. 소량의 PDMS를 10:1의 비율로 혼합하여 준비한다(염기:경화제). 신선한 액체 PDMS는 플라스틱 판의 바닥에 고체 PDMS를 붙이기 위해 사용됩니다.
    6. 플라스틱 플레이트의 중앙 바닥에 최소한의 액체 PDMS를 적용한 다음 PDMS에서 끈적끈적한 테이프를 제거하고 플라스틱 접시 바닥에 부착합니다. 미세 유체 요소가 위쪽을 향하고 있는지 확인합니다.
    7. PDMS를 70°C 오븐에서 30분 동안 경화시키십시오.
    8. 시험관에서 각각 100:45의 비율로 염기 및 경화제를 혼합하여 에폭시 수지를 준비한다. 상이한 에폭시 수지에는 상이한 혼합 비가 있을 수 있다. 일반 100mm 플레이트의 필요한 부피는 약 40mL입니다.
    9. 혼합물이 눈에 띄게 균일해질 때까지 에폭시를 로터에서 10분 동안 잘 섞어 주세요(즉, 액체에 섬유와 같은 유물이 보이지 않음).
    10. 에폭시 혼합물을 400 x g에서 5분 간 원심분리하여 내부에 잡힌 기포를 제거합니다.
    11. 원심 분리 하는 동안, 벽 주위 실리콘 그리스의 얇은 층과 문화 접시의 다른 모든 노출 된 플라스틱 부분을 확산. 이것은 접시 플라스틱으로 중합에서 에폭시를 방지하고 프로토콜의 끝에서 쉽게 경화 에폭시의 제거를 가능하게 할 것이다.
    12. 에폭시를 PDMS를 완전히 덮고 적어도 5mm 이상 넘어갈 때까지 접시에 천천히 붓습니다. 다음 48시간 동안 접시를 이동하지 않도록 안전한 장소에 놓습니다.
    13. 48 시간 후에 에폭시는 완전히 경화되어야합니다. 최종 경화를 위해 80 °C에서 예열 된 오븐에 3 시간 동안 접시를 삽입하십시오.
    14. 플레이트에서 경화 된 에폭시와 원래 PDMS 금형을 제거하여 플레이트의 플라스틱 벽을 부드럽게 깨뜨릴 때까지 양념합니다. 그런 다음 에폭시에서 쉽게 분리하고 벗겨야합니다.
    15. 일단 추출, 새로운 에폭시 복제에서 나머지 그리스를 닦아 거꾸로 삽입 (즉, 복제 된 미세 유체 요소가 위로 직면) 새로운 문화 접시에. 이제 PDMS 캐스팅을 위해 에폭시 복제본이 준비되었습니다.
    16. 가압 공기 또는 N2를 사용하여 에폭시 몰드에서 PDMS 또는 먼지의 잔해를 날려 버리고 이소프로판올로 2배 헹구십시오. 세 번째 로 채우고 궤도 셰이커 플레이트에 10 분 동안 배양하십시오. 이소프로판올로 금형을 다시 3배 헹구고 남은 액체를 버립니다. 공기 또는N2로 건조하거나 건조될 때까지 70°C 오븐에 놓습니다.
      참고: 이소프로판올을 작업하고 폐기할 때 안전 절차를 따르십시오.
    17. 주조 될 때까지 금형 플레이트를 닫아 두십시오. 1.1.8.-1.1.11 단계를 따릅니다.
  3. PDMS를 MFC로 펀칭 하고 조각(그림 2)
    1. 메스를 사용하여 웨이퍼에 (+) 자국을 따라 플레이트에서 PDMS 몰드를 자르고 제거합니다. 금형이 깨지기 쉽기 때문에 힘을 사용하지 마십시오(그림 2A).
    2. 실험 설정에 따라 챔버를 펀치하고 절단하기 위해 스케치에 그려진 지침을 따르십시오(그림 2B-F).
      1. 척수 배양(그림 2C,E)의경우 대형 MFC의 말단 측에 2 개의 7mm 웰을 펀치합니다. 웰이 채널 가장자리와 겹치는 방식으로 웰을 찾습니다. 근접 측에, 충분한 공간이 이식에 대한 남아있을 수 있도록 최소한의 오버랩으로, 채널의 중간에 잘 하나의 7mm펀치. 근접 채널의 두 가장자리에 두 개의 추가 1mm 구멍을 펀치합니다. MFC를 위쪽을 향하고 20G 바늘을 사용하여 MFC를 돌리면 3 개의 작은 이식 동굴을 7mm의 구멍을 잘 뚫습니다.
      2. 해리된 MN 배양물(그림2D,F)의경우, 작은 MFC의 두 채널 의 가장자리에 4개의 6mm 웰을 펀치합니다.
  4. 조직 배양 용 MFC 살균
    1. 벤치에 50cm 길이의 끈적끈적한 테이프 밴드를 펼. 챔버를 누르고 뒤로 당겨 끈적끈적한 테이프(상면과 아래면 모두)를 마주보고 조잡한 먼지를 제거합니다. 깨끗한 챔버를 새로운 15cm 접시에 놓습니다.
      참고: 미세 유체 요소들이 위쪽을 향할 때 직접 누르지 마십시오.
    2. 궤도 셰이커에서 10 분 동안 분석 등급 70 % 에탄올로 챔버를 배양하십시오.
    3. 에탄올을 폐기하고 챔버를 조직 배양 후드 또는 70°C의 오븐에서 건조시다.
  5. MFC를 유리 바닥 접시에 놓습니다.
    1. 챔버를 조직 배양 등급 35mm/50mm 유리 바닥 접시의 중앙에 놓고 가장자리에 약간의 힘을 가하여 PDMS와 접시 바닥을 바인드합니다. 유리 바닥이 파손되지 않도록 하려면 항상 단단한 표면 위에 힘을 가하십시오.
    2. 70 °C에서 10 분 배양하십시오. 챔버를 눌러 플레이트에 대한 순도를 강화합니다.
    3. 자외선 아래에서 10분 동안 배양합니다.
  6. 코팅 및 배양
    1. 두 구획에 1.5 ng/mL 폴리-L-오르니틴(PLO)을 추가합니다. 채널 입구에서 직접 코팅 매체를 몇 번 파이펫팅하여 PLO가 채널을 통해 실행되고 있는지 확인합니다.
    2. 기포의 존재를 확인하기 위해 10 배율로 가벼운 현미경으로 미세 유체 챔버를 검사하십시오. 기포가 마이크로홈을 차단하는 경우 MFC를 진공 건조기에서 2분 동안 놓습니다. 나중에, 그들을 통해 코팅 매체를 피펫팅하여 채널에 잡힌 여분의 공기를 제거합니다. 하룻밤 동안 배양하십시오.
    3. 동일한 방식으로 하룻밤 배양을 위해 PLO를 라미닌(DDW에서 3 μg/mL)으로 교체하십시오.
    4. 도금전에, 뉴런 배양 배지로 라미닌을 세척한다.

2. 신경 배양 도금

  1. 해리 된 모터 신경 문화
    1. 직선 가위와 미세 집게를 사용하여 E12.5 ICR-HB9::GFP 마우스 배아에서 척수를 해부합니다. 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 사용하여 1X HBSS 용액에서 작동합니다(그림3A-C).
    2. 미세 해부 가위를 사용하여 수막과 등쪽 뿔을 제거합니다(그림 3D).
    3. 척수 조각을 수집하고 튜브(#1)로1 mL HBSS + 1 % P / S로 옮김을 옮니다.
    4. 곡면 가위를 사용하여 척수를 작은 조각으로 자르고 조각이 가라앉을 때까지 기다립니다.
    5. 트립신 10 μL을 2.5% 추가하고 37°C 수조에 10분 동안 넣습니다. 5분 후, 튜브를 두드려 섞으세요. 조각은 나선 같은 덩어리를 형성한다.
    6. 덩어리를 미리 데온된 L-15 800 μL, BSA 4%, 100 μL의 100 μL을 함유한 새로운튜브(#2)로옮니다. 2x를 갈은 다음 2 분 동안 기다렸다가 불순한 조각이 정착할 때까지 기다립니다. 상급체를 새튜브(#3)로옮김을 옮니다.
    7. BSA 4%, 20 μL 의 10 mg/mL DNase, 그리고 완전한 신경 기저 배지의 900 μL을 추가합니다 (CNB, 재료 표 및 표 1참조). 8x를 갈고 2 분 기다립니다. 튜브 #3상급을 수집합니다.
    8. 2.1.7 단계를 반복하고 10x를 분쇄하십시오. 튜브 #3상급을 수집합니다. 소량의 조직은 튜브의 바닥에 남아 있어야합니다.
      참고 : 큰 덩어리가 여전히 튜브 #2바닥에 남아있는 경우, 반복 단계 2.1.8.
    9. 튜브 #3바닥에 BSA 4 % 쿠션 1 mL을 추가하십시오.
    10. 원심분리기는 400 x g에서 5분 간.
    11. 튜브를 부드럽게 두드려 세포 펠릿을 다시 일시 중단한 다음 CNB 배지 1 mL을 추가합니다. 파이펫 6x및 10 mg/mL DNase의 20 μL을 추가합니다.
    12. CNB 배지 의 추가 5 mL로 보충하고 새로운 튜브(#4)에3 mL을 옮니다.
    13. 각 튜브의 바닥에 1mL 10.4% 밀도 그라데이션 매체(표 2참조)를 추가합니다(#3 및 #4).#3 두 인터페이스 간의 급격한 위상 분리가 나타납니다.
    14. 실온(RT)에서 20분 동안 775 x g의 원심분리기. 원심분리감식은 상 분리의 고장을 피하기 위해 낮은 수준으로 설정되어야 한다.
    15. 셀은 부동해야 하며 미디어 간에 흐린 상호 단계로 나타납니다. 이미 미리 온화 한 1 mL CNB 배지를 함유 한 새로운 튜브(#5)로두 튜브에서 세포를 수집합니다.
    16. CNB 배지의 4-6 mL를 추가합니다.
    17. 튜브 바닥에 BSA 4% 쿠션 1mL를 추가합니다.
    18. RT에서 5 분 동안 400 x g의 원심 분리기를 폐기하고 CNB 배지 1 mL로 펠릿을 부드럽게 다시 놓습니다.
    19. 셀을 계산합니다. 척수 당 0.75-1 x 106 MN의 수율이 예상됩니다.
      참고: 복부 척수는 또한 운동 신경 세포 (예를 들어, 인터뉴런) 외에 다른 신경 아류형을 포함합니다. MN 순도는 해부 도중 등지 영역의 제거 및 MN 농축 된 로스트랄 영역에 도달하는 능력에 주로 의존합니다. 이미지된 뉴런이 MN인지 확인하려면 HB9::GFP 마우스와 같은 내인성 MN 마커를 가진 마우스 균주를 사용하는 것이 좋습니다. 순수한 MN 배양을 달성하기 위해 (그러나 감소된 세포 수율), FACS정제(15)의 사용이 가능하다.
    20. MFC에서 해리된 MN 배양도
      1. 5 분 동안 400 x g에서 원심 분리하여 챔버 당 150,000 MNs를 집중하십시오.
      2. 상월체를 흡인하고 MFC 당 4 μL에서 풍부한 신경 기저 배지 (RNB)에서 세포를 부드럽게 재중단시. RNB는 추가2% B27 및 25 ng/mL BDNF로 보충된 CNB이다.
      3. 두 구획에서 매질을 제거하고 말단 구획의 우물에서 ~ 10 μL에 해당하는 낮은 부피를 남깁니다. 그것은 잘 둘레에 매체의 얇은 고리로 나타납니다.
      4. 셀 4 μL을 채널에 천천히 로드합니다. 채널의 다른 쪽에 있는 웰의 4 μL을 꺼내서 천천히 다시 채널로 다시 로드하여 전류 흐름을 역전시키고 채널의 셀 밀도를 최대화합니다.
      5. 세포가 10x 광 현미경을 사용하여 채널에 들어갔는지 확인하고 더 많은 매체를 추가하지 않고 30 분 동안 인큐베이터에 챔버를 놓습니다.
      6. RNB의 ~10-15 μL을 근위 및 원위 우물에 천천히 넣고 챔버를 인큐베이터에 15 분 동안 놓습니다.
      7. 이 배양 후, 천천히 각 우물에 RNB의 ~ 75-80 μL을 추가합니다.
    21. 해리된 MN 문화 유지 관리
      1. 도금 후 하루 (DIV1), RNB와 함께 매체를 대체 1 μM 시토신 아라비노 시드 (Ara-C) 신경교 성장을 억제.
      2. Ara-C 적용 후 2일 후(DIV3) 배지를 근위 구획내의 신선한 CNB 배지로 대체합니다(Ara-C 제외).
      3. 마이크로홈을 통해 축삭의 교차를 향상시키기 위해, RNB를 신경교세포 유래 신경영양인자(GDNF)의 25ng/mL과 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)의 25ng/mL로 보충하여 원위구에만 적용합니다. 축방향 원위 웰(더 높은 부피)과 근위 웰 사이에 웰당 최소 10 μL의 부피 구배를 유지합니다.
      4. 2일마다 매번 매체를 새로 고칩니다. 축새를 4-6일까지 교차하는 데 걸릴 수 있습니다.
  2. 척수 이식 배양
    1. 직선 가위와 미세 집게를 사용하여 E12.5 ICR-HB9::GFP 마우스 배아에서 척수를 해부합니다. 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 사용하여 1X HBSS 용액에서 작동합니다(그림3A-C).
    2. 미세 해부 가위를 사용하여 수막과 등쪽 뿔을 제거합니다(그림 3D).
    3. 척수를 1mm 두께의 가로 부분으로 자른다(그림3E). MFC의 근위 구획에서 모든 배지를 폐기합니다.
    4. 총 부피 4 μL의 파이펫으로 단일 척수 배양을 집어 들고 동굴에 가능한 한 가깝게 이식을 주입하고 측면 출구 (1mm 펀치)를 통해 근시에서 과도한 액체를 잘 꺼내십시오. 이식은 근접 채널로 빨려 들어가야 합니다.
    5. 척수 이식 배지 150 μL을 천천히 추가하십시오 (SCEX, 재료 표 및 표 3참조)를 근위 쪽에 잘 넣습니다.
    6. 척수 배양 배양 유지 보수
      1. 근접 구획에 SCEX 배지를 추가하고, 풍부한 SCEX 매체(BDNF 및 GDNF의 50ng/mL가 있는 SCEX)를 원위 칸막이에 추가합니다. 원위 웰 (높은 볼륨)과 근위 웰 사이의 웰 당 적어도 15 μL의 부피 구배를 유지합니다.
      2. 2일마다 매번 매체를 새로 고칩니다. 축새를 3-5일까지 교차하는 데 걸릴 수 있습니다.

3. 축축한 수송(그림 4A)

  1. 미토콘드리아 및 산성 구획 라벨링
    1. 100 nM 미토 트래커 딥 레드 FM과 100 nM 리소 트래커 레드를 포함하는 신선한 SCEX 매체 (또는 해리 MN에 대한 CNB)를 준비합니다. 37 °C에서 30-60 분 동안 배양하십시오. 형광단이 겹치지 않는 한 다른 색상을 사용할 수 있습니다.
    2. 따뜻한 CNB/SCEX 매체로 3x 세척하십시오. 플레이트는 이미징할 준비가 되었습니다.
  2. 라이브 이미징
    1. 3초 간격으로 100개의 타임랩스 이미지 시리즈를 촬영할 수 있으며, 영화당 총 5분이 면 치수입니다.
      참고: 이 연구에 사용된 이미징 시스템에는 방적 디스크 공초점 기능이 장착된 반전 현미경이 포함되었으며, 예절된 세포 이미징 소프트웨어, 60x 오일 렌즈, NA = 1.4 및 EMCCD 카메라를 통해 제어됩니다. 영화는 37°C 및 5%CO2에서통제된 환경에서 획득되었다.
      참고: 실험에 따라 더 길거나 짧은 시간 경과 동영상을 이미지화할 수 있습니다. 필요한 경우 야간 영화도 녹화할 수 있습니다. 그러나 영화 촬영 시 광독성과 표백을 줄이기 위해 노출 시간과 레이저 파워뿐만 아니라 총 이미지 수를 줄이는 것이 중요합니다.

4. 이미지 분석 (그림 4-5)

  1. kymograph 분석을 이용한 입자 수송 분포 및 밀도 분석
    1. 피지에서 파일을 엽니다. 이미지를 누르는 별도의 채널 | 스택 | 도구 | 탈퇴.
    2. 이미지 | 를 눌러 이미지 속성 설정 속성.
    3. 선 아이콘을마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 분할된 선 도구를 선택합니다. 선 아이콘을두 번 클릭하여 너비를 8-10으로 설정합니다. 전체 해석에서 동일한 선 너비와 일치합니다.
    4. 말단에서 근위까지 축색 경로를 따라 분할된 선을 표시합니다. 두 번 클릭하여 선 표시를 중지합니다.
    5. t를 클릭하여 ROI 관리자에새로운 ROI(관심 영역)를 추가합니다. 스프레드시트 분석 테이블에 추가합니다.
    6. m을 클릭하여 축축의 면적과 길이를 측정합니다. 분석 테이블에 추가합니다.
    7. 플러그인을 클릭하여 kymograph 생성 | 키모툴박스 | 키모를 그립니다. 또는, 사용할 수 있는 다른 kymograph 생성 플러그인을 사용할 수 있습니다.
    8. 수동으로 이동(역행 또는 선행) 및 움직이지 않는 파티클을 계산하고 올바른 열의 테이블에 추가합니다.
      참고: 입자는 변위가 특정 방향으로 10 μm 보다 높은 경우 전진(즉, kymograph에서 왼쪽으로 이동) 또는 역행(즉, 오른쪽으로 이동)으로 분류됩니다. 선 아이콘으로 수평선을 표시하고 m을누르면 변위를 측정할 수 있습니다. 움직이지 않는 입자 또는 변위 기준을 충족하지 않는 입자는 비이동으로 정의된다(도4B).
  2. 단일 파티클 추적: 수동 추적
    1. http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html FIJI 소프트웨어 (파브리스 P. 코르델리에르에 의해 개발)에 대한 수동 추적 플러그인을 다운로드
    2. 피지 / ImageJ에서파일을 엽니 다 . 회전 옵션을 사용하여 MFC 홈을 수평으로 정렬합니다.
    3. 필요한 경우 신호 대 잡음 비율을 개선하려면 프로세스 | 배경을 뺍니다.
    4. 수동 추적 플러그인을 엽니다. 이미징에 사용되는 특정 현미경에 따라 파라미터(예: 픽셀 크기, 시간 간격 등)를 설정합니다. 여기에 표시된 결과의 경우, 현미경 및 렌즈 비율은 0.239 μm/픽셀이고 프레임 간격은 3초였다.
    5. 트랙 X 및 Y 좌표를 가져오고 텍스트를 스프레드시트에 복사하여 결과를 저장합니다.
    6. 이미지 | 을 클릭하여 다중 채널 동영상 분석 색상 | 채널을 병합하여 채널을 병합한 다음 동지역화된 puncta만 추적합니다.
  3. 단일 파티클 추적: 반자동 추적 (그림 5)
    1. 분석 소프트웨어를 엽니다. 이 연구는 비트 플레인 이마리스 소프트웨어 버전 8.4.1을 사용했다.
    2. 상단 메뉴에서 능가로 전환합니다.
    3. 이미지 처리를 클릭합니다 | 스왑 타임 및 Z | 좋아.
    4. 편집을 클릭합니다 | 이미지 속성(Ctrl+I) | 지오메트리 | 복셀 크기 행. 사용된 현미경 설정에 따라 이미지 속성을 설정합니다.
      참고: 여기에 표시된 데이터의 경우 현미경 및 렌즈 비율은 0.239 μm/픽셀이었습니다.
    5. 모든 등거리 를 클릭하고 시간 간격을변경합니다. 예를 들어 3s를 간격으로 사용합니다. 오른쪽 하단의 리셋 버튼을 클릭하거나 Ctrl+B를클릭합니다.
    6. 작은 노란색 반점 아이콘을 클릭하여 Icon of Small Yellow Spots왼쪽 상단에 스팟 레이어를 추가합니다. 왼쪽 하단에 스팟 편집을 위한 새 메뉴가 열립니다.
    7. 스팟 감지가 시작될 때까지 오른쪽 파란색 화살표를 누릅니다.
      참고: 창 왼쪽 하단에 있는 필터를 사용하여 일부 점을 필터링하는 것이 중요합니다. 영화를 몇 번 확인하여 충분한 수의 점이 선택되어 있는지 확인합니다.
    8. 실험 요구 사항에 맞게 매개 변수를 확인하거나 구성합니다. 예를 들어 최대 거리 = 12 μm(두 개의 별개의 스팟 사이의 최대 허용 거리는 여전히 동일한 단일 트랙에 포함됩니다); 최대 간격 크기 = 1(트랙이 놓칠 수 있고 여전히 하나의 트랙으로 간주되는 프레임 수)입니다.
    9. 설정을 클릭한 다음 스타일 추적 = 끄기, 점 = 구.
    10. 필터 막대를사용하여 조정을 위해 다른 필터를 선택합니다. 예를 들어 여기에 제공된 데이터에서 추적 지속 시간 = 9는 3프레임 미만의 모든 트랙을 제거했습니다. 모든 매개 변수가 설정되면 오른쪽 녹색 화살표를클릭합니다. 이 단계 이후에는 추가 편집이 불가능합니다.
    11. 점으로 된 작은 연필을 클릭하여 모든 트랙을 수동으로 편집합니다.
    12. 동영상보기(그림 5B). 오류가 발생하면 다음과 같은 몇 가지 옵션이 있습니다.
      1. 트랙 연결을 끊려면 개체 옵션을 클릭하고 Ctrl을들고 연결을 끊어야 하는 두 지점을 선택하고 연결을 선택합니다.
      2. 트랙을 연결하려면 개체 옵션을 클릭하고 Ctrl을 들고 연결해야 하는 두 지점을 선택하고 연결을선택합니다.
      3. 올바른옵션(트랙/오브젝트)을사용하여 트랙 또는 스팟을 삭제하려면 일반 연필 아이콘이있는 화면으로 전환하고 삭제를선택합니다.
      4. 수동으로 스팟을 추가하려면 일반 연필 아이콘 화면으로전환합니다. 화면 하단에는 수동 추적 표시가있습니다. 자동 연결 확인란이 V인지확인합니다. 동영상 자체에서 스팟을 추가하려면 Shift 단추를 길게 누르고 왼쪽 을 클릭합니다.
    13. 기존 트랙에 스팟을 추가하려면 원하는 트랙(노란색)과 프레임을 선택하고 일반 연필 아이콘 화면으로 전환하고 수동으로 스팟을 추가합니다. 전체 동영상이 완료되면 빨간색 그래프(통계)처럼 보이는 아이콘으로전환합니다. 나중에 분석된 매개 변수를 편집할 수 있습니다. 편집하려면 화면 왼쪽 하단에 스웨덴 키 아이콘을누릅니다. 예: 위치 X, 위치 Y.
    14. 여러 플로피 디스크처럼 보이는 아이콘을 누르면 모든 통계를 내보냅니다.
      참고: 스프레드시트 출력은 이 분석에 사용된 게시된 코드9를 사용하여 직접 처리하거나 추가로 분석할 수 있으며, 이 코드는 필요에 따라 공유됩니다. 다음 매개변수는 속도, 트랙 변위, 실행 길이, 속도(방향성 포함), 정지 횟수, 평균 정지 지속 시간, 알파, 방향 변경 및 순간 속도의 분석에서 추출됩니다. 각 매개 변수에 대한 자세한 설명은 Gluska 등9에설명되어 있습니다.

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결과

기재된 프로토콜에 따라, 마우스 배아 HB9::GFP 척수 이식은 MFC에서 배양하였다(도4A). 축삭이 완전히 말단 구획으로 교차 할 때 이식은 7 일 동안 재배되었다. 미토콘드리아 및 산성 구획에 라벨을 붙이기 위해 미토트래커 딥 레드 및 리소트래커 레드 염료를 말단 및 근위 구획에 첨가하였다(도4C). 말단 홈내의 축삭을 이미지화하고, 영상을 분석하였다: 먼저, 규극물 분석을 이용한 일반적인 이동 분포를 비교하였다(도4B,D). 이 분석은 산성 구획에서만 역행 방향으로 편향을 나타냈다(무이동 = 77.1±9.5%, 역행 = 16.9±8.3%, 전단등급 = 6±5%; ; 도 4

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토론

이 프로토콜에서는 운동 뉴런에서 미토콘드리아 및 산성 구획의 축색 수송을 추적하는 시스템을 설명합니다. 이 단순화된 체외 플랫폼은 세포외 뉴런 구획을 정밀하게 제어, 모니터링 및 조작할 수 있게 해주며, 모터 뉴런 국소 기능을 실험분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 ALS와 같은 MN 질환을 연구하는 데 유용할 수 있으며, 질병10,,16에서축색 수송 기능 장애의 기본 메커니즘을 이해하는 데 초점을 맞출 수 있다. 더욱이, 이 시스템은 또한 영양 인자9,,16,microRNA10,mRNA8,및 건강하고 병에 걸린 MN 또는 감각9 또는 교감 축삭14와같...

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공개 사항

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF, 561/11)과 유럽 연구 위원회 (ERC, 309377)의 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
35mm 플루오디쉬 – 유리 바닥 접시World Precision InstrumentsWPI FD35-100
50mm 플루오디쉬 & 유리 바닥 접시World Precision InstrumentsWPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD 카메라Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)Sigma-AldrichC17682mM 재고 필터링 DDW
B-27 보충제 (50X)Thermo Fisher17504044
BDNFAlomone LabsB-25010 µ로 희석; 0.01% BSA로 필터링된 ddw의 g/mL)
생검 펀치 1.25mmWorld Precision Instruments WPI504530대형 MFC
생검 펀치 6mmWorld Precision Instruments WPI504533소형 MFC
생검 펀치 7mmWorld Precision Instruments WPI504534대형 MFC
Bitplane Imaris 소프트웨어 사전 준비 - 버전 8.4.1Imaris
소 혈청 알부민 (BSA)시그마 알드리치#A3311-100G5 % w / v ddw
클로로 트리 메틸 실란시그마 - 알드리치# 386529-100ML
CNTF알로몬 연구소C-24010 µ로 희석; 0.01% BSA로 필터링된 ddw의 g/mL)
밀도 구배 매체 - OptiprepSigma-AldrichD1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) 소 췌장에서 추출한Sigma-AldrichDN-25재고 10mg/mL neurobasal
Dow Corning 고진공 실리콘 그리스Sigma-AldrichZ273554-1EA에폭시 몰드 준비용
DPBS 10XThermo Fisher#14200-067DDW에서 1:10을 희석합니다.
Dumont 세밀한 집게 #55 0.05 × 0.02 mmF.S.T
에폭시 경화제Trias Chem S.R.LIPE 743에폭시 금형 준비용
에폭시 수지Trias Chem S.R.LRP 026UV에폭시 금형 준비용
FIJI 소프트웨어ImageJ
GDNFAlomone LabsG-24010 µ로 희석; 0.01% BSA로 필터링된 ddw의 g/mL)
Glutamax 100XThermo Fisher#35050-038
HB9:GFP 마우스 균주Jackson Laboratories005029
HBSS 10XThermo Fisher#14185-0451% P/S 및 필터
iQ 소프트웨어Andor
곡선, 10cmAS Medizintechnik11-441-10
홍채 가위, 스트레이트, 9cmAS Medizintechnik11-440-09
LamininSigma-Aldrich#L-2020
Leibovitz의 L-15 MediumThermo Fisher11415064
LysoTracker RedThermo FisherL7528
Mitotracker Deep-Red FMThermo FisherM22426
Neurobasal 매체Thermo Fisher21103049
Nikon Eclipse Ti micorscopeNikon
Penicillin-Streptomycin (P / S) 솔루션Biological Industries03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)Sigma-Aldrich#P8638에 1:1000 희석
#3097358-1004
소 췌장에서 추출한 트립신Sigma-AldrichT1426재고 25mg/mL 1XPBS
Vannas 스프링 현저가위, 3mm 블레이드FST15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa
1125520 Iris 가위를 추가하여 ddw에서 1:10 희석, 1X PBS Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트

참고문헌

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373(2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311(2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210(2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

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