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방법 논문

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

14.4K 조회수

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DOI:

10.3791/61001

⸱

2020년 5월 21일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

초록

유기체는 종종 변동 환경과 세포 내 항상성에 변화에 노출, 이는 자신의 단백질과 생리학에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 유기체는 손상을 복구하고 항상성을 유지하기 위해 최선을 다하고 대상 및 특정 스트레스 응답을 진화했다. 이러한 메커니즘은 내구 성 망막(UPRER),미토콘드리아의 전개된 단백질 반응(UPRMT),열 충격 반응(HSR) 및 산화 스트레스 반응(OxSR)의 전개된 단백질 반응을 포함한다. 여기에 제시 된 프로토콜은 선충, C. elegans에서이러한 경로및 생리적 결과의 활성화를 감지하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 먼저, 경로 특이적 형광 전사 기의 사용은 신속한 세포 특성화, 약물 스크리닝, 또는 대규모 유전자 스크리닝(예를 들어, RNAi 또는 돌연변이 라이브러리)에 대해 기술된다. 또한, 상보적이고 견고한 생리학적 측정이 설명되며, 이는 특정 스트레스에 대한 동물의 민감도를 직접 평가하는 데 사용될 수 있으며, 전사 기의 기능적 검증역할을 한다. 함께, 이러한 방법은 내부 및 외부 proteotoxic 섭동의 세포 및 생리적 효과의 신속한 특성화를 허용합니다.

서론

세포 내 및 세포 외 환경의 변화에 반응하는 유기체의 능력은 생존과 적응에 매우 중요합니다. 이것은 세포의 무결성을 보장하는 수많은 보호 경로를 통해 세포 수준에서 수행됩니다. 수많은 세포 구성 요소는 스트레스 관련 손상의 대상이 되는 동안, 세포 스트레스 응답의 한 가지 주요 참여는 복구 하 고 세포 proteome의 항상성을 보호 하는. 그러나, 세포기관에게 불린 특별한 구조물로 단백질의 구획화는, 세포 내의 모든 단백질이 제대로 접혀 있고 기능적이다는 것을 확인하기 위하여 단백질 품질 관리의 1개의 중앙 집중식 양식에 의지할 수 없기 때문에, 세포를 위한 도전을 제기합니다. 따라서, 그들의 단백질에 교란을 다루기 위하여는, 세포기관은 잘못 접힌 단백질을 감지하고 그 구획 내의 응력을 경감하기 위하여 시도에서 긴장 반응을 활성화할 수 있는 전용적인 품질 관리 기계장치를 발전시켰습니다. 예를 들어, 시토솔은 열 충격 반응(HSR)에 의존하는 반면, 내포성 망상체(ER)와 미토콘드리아는 구획특이적 전개단백질 반응(UPR)에 의존한다. OxSR 반응성 산소 종의 독성 효과 완화 하는 역 (ROS). 각 스트레스 반응은 세포 도전과 환경 모욕의 존재에서 트리거되고 맞춤형 전사 반응을 유도한다. 이 반응의 특징은 적당한 세포기관을 표적으로 한 잘못 접힌 단백질 (샤페론과 같은) 또는 대안으로, 단백질 분해에 의해 손상된 단백질을 제거하는 분자를 합성하는 것을 포함합니다. 이러한 스트레스 반응을 활성화 하지 못하면 손상된 단백질의 축적, 조직의 전신 장애로 전파 되는 세포 기능 장애, 그리고 결국 유기체의 죽음. 다른 스트레스 응답의 기능과 조절은다른곳에서 검토1 .

세포 스트레스 반응의 조절 및 활동에 관한 많은 통찰력은 선충, 예쁜꼬마선충,유전 연구에서 다세포 모델 유기체에 기인했습니다. 선충은 세포 수준에서 스트레스 반응의 활성화를 연구 할뿐만 아니라 유기체 수준에서도 연구 할 수 있습니다. 선충은 그들의 성장과 생존에 있는 약 및 오염물질에 유전 섭동 또는 노출의 효력을 공부하기 위하여 이용되었습니다. 그들의 빠른 생성 시간, 등소, 투명성, 유전 적 견인성 및 실험 중 사용 편의성은 그러한 연구에 이상적입니다. 또한, 스트레스에 상대적으로 빠른 생리 적 반응 (시간과 몇 일 사이) 그리고 세포 경로의 진화 보존 선충 스트레스 저항을 공부에 눈에 띄는 도구.

C. elegans를성장 하기 위해 식품 소스로 사용 되는 두 개의 일반적으로 사용 되는 대장균 균주가 있다: 표준 OP50, 대부분의 실험역사적으로 수행 된 B 변형2 그리고 HT115, 거의 모든 RNAi실험에사용 되는 K-12 균주3,4. OP50과 HT115 세균성 규정식 사이 중요한 다름이 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 이 상이한 세균 성 근원에 성장은 신진 대사 단면도에 있는 중요한 다름을 일으키는 원인이 되기 위하여 보였습니다, 미토콘드리아 DNA 사본 수, 및 수명을 포함하여 몇몇 중요한 표현형, 일생5. 이러한 차이 중 일부는 OP50 박테리아에 성장과 관련 된 비타민 B12 결핍에 기인, 미토 콘 드리 아 항상성 및 병원 체와 스트레스에 증가 감도 발생할 수 있습니다. 이러한 표현형의 모든 HT115 박테리아에 성장에 의해 완화 될 것으로 나타났습니다., 비타민 B12의 상부는6. 따라서 RNAi 조건의 필요성에 관계없이 HT115 박테리아에 대한 생리적 스트레스 반응에 대한 모든 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 그러나, OP50상에서 동물을 유지하기 가용하기 때문에, 모든 표준 성장(즉, 동물의 유지 보수 및 증폭)은 OP50에서 수행될 수 있으며, 여기에 설명된 실험 패러다임의 현저한 차이는 OP50에서 유지되는 웜에서 검출되지 않았으며, HT115 포스트 동기화(즉, 부화 후 표백으로부터 또는 L검치없이)

여기서, 두 가지 기능적 방법을 이용한 세포 스트레스 반응의 활성의 특성화가 설명된다. 제시된 프로토콜은 주로 세포 스트레스 반응과 단백질 항상성에 미치는 영향에 초점을 맞추고 있다는 점에 유의해야합니다. 첫째, 형광 전사 기자는 다른 세포 스트레스에 응하여 특별히 활성화되는 내인성 유전자 프로모터에 의해 조절되는 활용된다. 이러한 형광 전사 기자는 기본적으로 스트레스 반응의 일부인 특정 유전자의 전사 유도에 기초한다. 예를 들어, HSP-4는 인간 보호자 HSPA5/BiP에 대한 열 충격 단백질 정형고체로, ER 스트레스시 활성화되고 스트레스를 완화하기 위해 ER에 국소화됩니다. ER 스트레스(예를 들어, tunicamycin에 대한 노출)의 조건에서, hsp-4 프로모터의 조절하에 놓인 녹색 형광 단백질(GFP)은,선충7의대입자 유동 세포학을 사용하여 형광 현미경 또는 정량적으로 측정될 수 있는 바와 같이 높은 수준으로 합성된다. 유사하게, 미토콘드리아 샤페론의 프로모터, hsp-6(포유류 HSPA9에 직교), UPRMT8의활성화를 모니터링하는 데 이용되고, 세포질 샤페론 hsp-16.2의 프로모터는 HSR9의활성을 평가하는데 사용된다. 이 리포터는 다양한 섭동에 대한 응답으로 활성화 된 경로의 신속한 특성화를 허용합니다.

종종 여기에 제시 된 기자는 스트레스 반응의 활성화의 질적 인 출력을 제공하는 현미경 검사를 사용하여 이미지화됩니다. 그러나 이미징 기술은 위에서 설명한 기자의 강도와 조직 위치에 대한 정보를 모두 제공하지만 정량화가 항상 정확하거나 견고한 것은 아닙니다. 이미징 분석 도구를 사용하여 형광 활성화를 정량화할 수 있지만, 이러한 방법은 상대적으로 처리량이 낮고 샘플 크기가 작으며, 이는 상대적으로 적은 수의 동물이 이미지화되기 때문이다. 다량의 동물을 쉽게 얻을 수있는 능력은 C. elegans가 큰 입자 유동 세포계를 사용하여 형광 응력 리포터의 활성화를 분석하는 이상적인 모델 시스템입니다. 큰 입자 유동 세포계는 많은 살아있는 동물의 크기와 형광에 따라 기록, 분석 및 분류 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 수천 개의 웜에 대한 형광 강도, 크기 및 공간(2D) 정보를 얻을 수 있습니다. 이 시스템은 FlowPilot을 사용하여 제어되며, 이를 통해 측정된 파라미터를 실시간으로 데이터 수집 및 분석할 수 있습니다. 여기서, 대입자 유동 세포계를 이용한 현미경 이미징 및 정량분석 방법 모두 응력 반응의 활성화를 측정하는 방법으로 제안된다.

리포터 분석 외에도 동물의 스트레스에 대한 민감도 또는 저항성을 생리적 스트레스 분석법으로 측정할 수 있습니다. 이것은 특정 세포 스트레스 경로를 활성화 스트레스 환경에 동물을 노출하여 달성된다. 여기서, 특정 유형의 스트레스에 대한 전체 동물의 민감도를 측정하기 위한 몇 가지 방법이 제공된다.

ER 응력은 N-연결된 글리코실화를 차단하는 화학 약제인 튜니카마이신을 사용하여 C. elegans에 가해져 ER10에서잘못 접힌 단백질이 축적됩니다. C. 예쁜꼬마선충에서튜니카마이신에 노출되면 성장하면 ER 기능의 주요 섭동이 발생하며 수명이 현저히 감소하여수명이 11로크게 감소합니다. 튜니카마이신 함유 플레이트에서 동물의 생존을 측정함으로써, 동물의 ER 응력 민감도를 정량화할 수 있다. 예를 들어, 이후성 UPRER 유도를 가진 동물은 ER에서 단백질 오폴딩 스트레스에 대한 내성을 증가시켜 야생형동물(12)에비해 튜니카마이신 노출 시 생존율이 증가한다.

산화 및 미토콘드리아 스트레스는 동물을 화학 약제인 파라쿼트에 노출시킴으로써 C. 예쁜꼬마선충에 가된다. 파라쿼트(Paraquat)는 일반적으로 사용되는 제초제로서, 특히 미토콘드리아13에서과산화물 형성을 일으킨다. 미토콘드리아 유래 반응성 산소 종(ROS)의 특이적 국소화로 인해 파라쿼트 분석제는 종종 "미토콘드리아" 스트레스 분석법으로 사용됩니다. 그러나, 과산화물은 미토콘드리아 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SODs)14에의해 과산화수소로 급속히 전환된다. 과산화수소는 이후에 미토콘드리아에서 확산되어 세포의 다른 구획에서 산화 스트레스를 유발할 수 있습니다. 따라서, 우리는 미토콘드리아 및 산화 스트레스 둘 다에 대한 감수성을 측정하는 것으로 파라쿼트 생존 분석을 설명한다(다른 산화 스트레스측정제는 15).

열내성 검사들은 동물을 높은 온도에 두어 C. 예쁜꼬마선충에서 수행됩니다. 선충에 대한 주변 온도는 ~ 15-20 °C이며 열 응력은 25 °C16,,17이상의 온도에서 유도됩니다. 열내성 측정은 일반적으로 동물이 이 온도에서 중요한 세포 결함을 나타내기 때문에 30-37 °C에 이르는 온도에서 수행되며, 생존 측정은 24 시간16,,18이내에 완료됩니다. 여기서, 열내성 검사를 수행하기 위한 두 가지 대체 방법이 제공된다: 34°C에서의 성장 및 37°C에서의 성장. 함께, 여기에 제시된 프로토콜은 RNA 간섭 또는 화학 약물 라이브러리를 사용하여 표준 유전자 노크다운과 결합될 때 대규모 스크린을 수행하기 위해 이용될 수 있다.

프로토콜은 4 개의 넓은 절차로 나눌 수 있습니다- C. elegans의 성장 및 화상 진찰을 위한 준비 (단면도 1 및 2), 형광 현미경 검사법을 사용하여 전사 기자의 화상 진찰 (섹션 3-5), 큰 입자 유량 세포측계를 사용하여 기자의 정량적인 측정 (섹션 6), 및 C. elegans에 있는 긴장 감도를 측정하기 위하여 생리학적 분석 (단면도 7).

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프로토콜

1. 온도 및 OP50 대 HT115의 표준 성장 조건

  1. 표준 성장 및 확장
    1. LB(표 1)에서OP50의 배양물을 성장시키고 주변 온도(~22-25°C)에서 24-48시간 동안 이에 상응하는 매체를 선택한다. OP50은 우라실 보조트로프로서 실온에서 박테리아를 성장시키고 37°C에서 재배할 때 역류제(예를 들어, 억제기 돌연변이체)의 발생률이 더 높다. OP50 배양물의 장기 보관은 권장되지 않습니다(최대 1주~4°C).
    2. 포화 OP50 배양액의 ~100-200 μL을 60 mm NGM 플레이트 상에 종자(표1)에하여 웜의 유지및 포화 OP50 배양물의 1 mL을 실험을 위해 동물을 팽창시키기 위한 100 mm 플레이트 상에.
    3. 접시를 벤치탑에서 밤새 말리게 합니다.
      참고: 100mm 플레이트는 특히 통풍이 되지 않는 플레이트를 사용하는 경우 건조하는 데 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 모든 C. 예쁜꼬마선충 플레이트를 4°C에 보관된 밀폐 용기에 보관하십시오. 플레이트의 건조가 발생하기 때문에 6 개월 이상 된 판을 사용하지 마십시오, 이는 다른 삼투압과 플레이트의 강성으로 인해 플레이트에 동물 생리학을 변경합니다.
    4. 표준 유지 보수를 위해, 10-15 어린 동물 (계란, L1, 또는 L2 단계)을 60mm 판상에 옮기지만, 돌연변이 또는 형질전환 동물을 처리하는 경우 더 많이 움직일 수 있습니다. 발달 또는 배분 결함이있는 동물의 경우, 주식의 손실을 방지하기 위해 동물의 더 가변 풀을 청크. 15 °C에서 보관하는 경우, 매주 동물을 이동; 20 °C의 경우 3-4 일마다 동물을 움직이게하십시오.
    5. 25-30개의 구절마다 동물의 신선한 해동을 수행합니다(동물이 일주일에 한 번 이동하고 15°C에서 보관하는 경우~ 6개월).
    6. 확장을 위해 확장을 위해 100mm 플레이트에 전체 60mm 플레이트를 청크하십시오. 참조의 프레임으로서, 야생형 배변을 가진 동물은 4ths-6ths로 완전히 60 mm 플레이트를 절단하고 2일 동안 20°C 또는 15°C에서 큰 판상에 청크하여 3일 동안 기아에 도달하지 않고 전체 100 mm 플레이트를 생성할 수 있다.

2. 표백을 사용하여 벌레의 준비 / 동기화

  1. 웜을 동기화하는 표백 프로토콜
    1. M9(표 1)을사용하여 한천 접시에서 gravid 벌레 (계란이 가득한 성인)를 씻으하십시오. 유의미한 유전 적 드리프트가 표백을 통해 동기화의 연속적인 라운드에 발생할 수 있기 때문에, 실험표백제에 벌레 (즉, 1.1.6 단계에서 청크 웜)의 비 동기화 인구에서 시작합니다.
    2. 유리 파이펫을 사용하여 웜/M9 혼합물을 15 mL 원점 튜브로 옮기십시오. 여러 개의 웜 플레이트를 단일 15 mL 원엽 튜브로 수집할 수 있습니다.
    3. 1,000 x g에서30 s에 대 한 아래로 동물을 스핀. 흡인 M9 상급. 오염의 엄청난 양 또는 박테리아의 큰 덩어리가 없는 한 잔여 박테리아를 씻어 필요가. 이 경우 M9로 여러 번 세서를 수행합니다.
    4. 표백 용액의 신선한 주식을 준비합니다(표 1). 표백 용액은 4 °C에서 며칠 동안 보관 할 수 있지만 비효율적인 표백으로 갓 만든 표백 용액을 사용하면 표백이 고르지 않게 되어 모든 웜 시체를 제거하기 전에 계란에 손상을 입힐 수 있습니다.
    5. 동물에게 표백 용액 2-10 mL을 추가하십시오 (동물 펠릿의 ~ 0.1 mL마다 표백액 1 mL). ~ 5 분 동안 표백제와 웜 혼합물을 반전하십시오 (10 분을 초과하지 마십시오. 표백 시간은 다를 수 있으며 각 실험실에 대해 특별히 적정해야합니다). 웜 시체를 더 빨리 녹이고 계란을 최적으로 보존하기 위해 힘차게 흔들어 줍니다. 주기적으로 해부 현미경의 밑에 보거나 성숙한 벌레 시체가 완전히 용해되고 계란만 관에 남아 있을 때 관찰하기 위하여 빛에 원엽 관을 두십시오.
    6. 30 s에 대 한 1,000 x g에서 회전 하 여 계란을 펠 트 다음 상한을 흡인. 계란은 무결성을 방해하지 않고 벌레보다 빠르게 원심 분리할 수 있으므로 원심 분리 속도를 확신할 수 없는 경우 생리학에 영향을 주지 않고 최대 2,500 x g에서 계란을 분사할 수 있습니다.
    7. M9을 최대 15 mL까지 추가하고 튜브를 뒤집어 알을 치웁히 치웁습니다.
    8. 2.1.6-2.1.7(세척/펠릿 공정) 2-3번 반복하여 표백제를 제거합니다.
    9. 파이펫 계란 /M9 플레이트에 혼합하고 실험을 위해 15-20 °C에서 성장. 사용할 벌레 수를 측정하려면 한천 접시 또는 슬라이드에 5 μL의 달걀 혼합물을 파이펫팅하고 달걀 수를 5로 나누어 부피 1 μL당 계란 수를 결정하여 대략적인 계란 수를 수행합니다. 3개의 독립적인 카운트를 평균화할 경우 정확도가 향상될 수 있습니다. 기아를 피하기 위해 접시당 권장 계란 수표를 표 2에서확인할 수 있습니다.
    10. 필요한 경우, L1은 최대 24시간 동안 20°C의 회전자에 달걀/M9 혼합물을 배치하여 보다 엄격한 시간 동기화를 위해 동물을 체포합니다. 야생형 동물의 경우, L1이 최대 48시간 동안 체포될 때 동물 생리학의 결함이 발견되지 않았습니다. 그러나, 기아에 민감한 돌연변이(예를 들어, 리소좀 또는 자가포식 돌연변이체)는 L1 검거와 매우 저조한 일을 하며, 따라서 기아에 민감한 것으로 알려진 돌연변이에 대해 이 동기화 방법을 수행하지 않는 것이 좋습니다. L1을 체포할 수 없는 동물에 대해 더 엄격한 동기화가 필요한 경우 섹션 2.2에 설명된 계란 낳는 방법을 사용합니다.
  2. 웜 동기화를 위한 계란 누워 프로토콜
    참고 : 표백에 대한 대체 방법으로 계란 누워 분석법을 수행 할 수 있습니다. 계란 누워 는 동물의 표백이 성인 동물의 계란 주머니 내의 계란이 8-12 시간 간격으로 다를 수 있기 때문에 충분히 충분한 동기화를 제공하지 않을 때 사용됩니다. 동물이 가능한 한 밀접하게 준비하는 것이 중요하지만 L1 체포가 불가능한 실험 패러다임의 경우 (예 : 기아 돌연변이체에서) 계란 누워 실험이 권장됩니다. 그러나, 계란 누워 프로토콜에 관련 된 노동으로 인해, 그것은 높은 규모의 실험을 수행 하는 것이 덜 가능 하다는 점에 유의 해야 한다.
    1. 4-12그라비드 성인(2.2.2단계 후 참고 참조)을 표준 OP50 또는 HT115 시드 NGM 플레이트에 놓습니다(세균 균주에 대한 권장 사항은 위의 섹션 1 참조). 실험 의 규모에 따라 여러 플레이트를 사용할 수 있습니다. 2.2단계에 대해 각 접시에 얼마나 많은 동물이 있는지 주의 깊게 문서화하십시오.
    2. 동물을 실험용(15-20°C)에서 4-8시간 동안 원하는 온도로 놓습니다.
      참고 : 동물이 접시에 남아있는 시간의 수는 첫 번째 계란이 놓여 있고 마지막 계란이 얼마나 밀접하게 동기화되는지 결정하므로 필요에 따라 타이밍을 조정할 수 있습니다. 배양 시간이 짧기 때문에 각 동물은 알을 낳을 시간이 적기 때문에 충분한 알을 낳을 수 있도록 접시에 더 많은 동물을 배치해야합니다. 실제 계란 누워 속도 는 계란 누워의 정상화 속도 보다는 계란 누워의 짧은 버스트를 통해 이동 하는 동물의 경향으로 인해 완전히 정상화 되지 않습니다 하는 동안, 동물 당 누워 계란의 평균 속도 ~5 계란/시간 야생 형 fecundity를 전시 하는 동물에 대 한 추정될 수 있다19. 1일째 성인 단계로 동물을 키우려고 할 때, 기아를 피하기 위해 접시당 100개의 달걀을 가지고 있는 달걀을 낳는 시간(플레이트당 권장 동물에 대한 자세한 내용은 표 2 참조).
    3. 접시에서 성인용 동물을 제거합니다. 동물이 계속해서 알을 낳고 비동기화 된 인구 및 / 또는 접시의 기아를 초래하기 때문에 모든 성인 동물이 접시에서 제거되었는지 확인하십시오.

3. 전사 기자의 이미징을위한 웜의 성장 조건

  1. 벌레의 성장
    1. HT115 의 박테리아 배양을 접종 pL4440 RNAi 플라스미드 (EV) 및 / 또는 LB 미디어에 원하는 대상 유전자에 대해 RNAi 카세트를 운반 100 μg / mL 카베니실린 과 20 μg / mL 테트라 사이클린.
    2. 밤새 배양을 성장 (~16 시간) 흔들어 37°C 인큐베이터에서 포화.
    3. 포화 세균 배양 200 μL과 포화 세균 배양 1,000 μL의 100 mm NGM RNAi 플레이트를 가진 자리 60 mm NGM RNAi 접시. 주변 온도 (~ 22 °C)에서 밤새 건조시키십시오 (알루미늄 호일로 느슨하게 덮여 있음).
    4. 형광 리포터를 운반하는 형질전환 벌레의 동기화된 집단을 NGM RNAi 플레이트에 배치하여 박테리아를 선택했습니다. Table 3
    5. 아래에 설명된 대로 특정 리포터에 필요한 단계로 15-20°C에서 성장합니다.
  2. 실험에 대한 웜 준비에 대한 고려 사항
    1. L4 동물을 필요로 하는 실험을 제외하고 성인의 첫날에 전사 기자에 대한 실험을 수행합니다. WormAtlas에 따르면, L4 동물은 계란 단계(www.wormatlas.org)에서20 °C에서 성장의 약 2.5 일 (~ 56 시간)를 수득된다.
    2. "성인 1일째"의 경우, 계란도금 후 20°C에서 약 3-4일(~65-96시간)에 동물을 사용하십시오.
      참고 :이 넓은 범위는 다음과 같이 설명된다 : 20 ° C에서 ~ 65 h는 동물이 진정한 "성년"상태인 "계란 누워"에 도달 할 때입니다. 96 h는 동물이 WormAtlas가 "계란 누워 최대"로 묘사하는 것을 입력 할 때이며, 성인이 중력 성인이고 전체 계란 낭이있는 경우입니다. 이것은 동물이 1 일 보다 더 오래 된 것으로 설명 될 것 이다 하 고 차이 표시 하기 시작할 수 있습니다., 따라서 여기에 설명 된 프로토콜은 모두 이 "1 일" 단계에서 시작 하는 것이 좋습니다 65 h와 늦게 96 시간. 여기에 기술된 실험의 경우, 이 ~65-96h 윈도우에서 동물을 사용할 때 주요 차이점은 관찰되지 않았다.
    3. 단일 실험의 복제의 경우, 보다 강력한 재현성을 위해 유사한 시간 포인트를 사용합니다(예: 계란 도금 후 ~65h 또는 ~96h에서 모든 실험을 수행).
      참고: 일부 형질전환 동물과 돌연변이는 성장 속도가 느려진 것을 나타냅니다. 이를 위해 두 가지 권장 사항이 있습니다. 1) 실험이 동시에 수행되기 위해 동물을 다른 시간에 표백 할 수있는 엇갈린 동기화를 사용합니다. 이는 분석의 기술적 변동성이 동기화 분석에서 발생할 수 있는 기술적 변동성보다 클 수 있는 경우에 권장됩니다(예를 들어, 생존 분석, 이는 장기간 실행되는 동시에 수행되지 않으면 고통받을 수 있음). 2) 동물이 동시에 표백 될 수 있지만 분석 자체는 다른 시간에 수행되는 비틀거리는 분석을 사용합니다. 이것은 내재된 가변성이 없는 매우 간단한 분석은 (예를 들면, 응력 반응의 RNAi 유도)를 위해 추천됩니다.

4. 스트레스 반응 유도

  1. HSP-4p 사용::GFP를 UPRER 활성화를 위한 판독으로 사용
    1. RNAi를 사용하여 ER 스트레스 유도
      1. NGM RNAi 플레이트에 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 RNAi 박테리아로 발견된 플레이트를 준비(표 1)섹션 3에서와 같이. 기저 UPRER 수준 및 태그-335의 RNAi 녹다운에 대한 대조군으로 EV를 사용하십시오 (ER 상주 단백질의 N 연동 글리코실화를위한 효소; RNAi 녹다운은 TUNICamycin 처리에 유사한 효력이 있습니다) ER 스트레스하에서 UPRER의 활성화를 위한 긍정적인 통제로.
      2. hsp-4p::GFP 리포터 동물은 섹션 2에 설명된 방법을 사용하여 동물을 동기화합니다.
      3. 접시 계란을 RNAi 접시에 표 2에서권장 하는 기준을 사용 하 여.
      4. 20°C에서 약 3-4일 동안 계란을 배양(~65-96시간)하여 성인기 1일째에 실험을 수행하였다. UPRER 실험의 경우, hsp-4:GFP 리포터의 기저 형광에 차이가 있다. 따라서, 20°C에서 모든 실험을 수행한다.
    2. 화학 약제를 사용하여 ER 응력 유도
      1. hsp-4p::GFP 리포터 동물은 섹션 2에 기재된 방법을 사용하여 동물이 L4 단계에 도달할 때까지 20°C에서 자랍니다. 동물을 M9 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김. 벌레가 정착할 수 있도록(중력에 의해 ~ 2-3분 또는 1,000 x g에서30초 회전) M9을 제거합니다.
      2. M9에서 튜니카마이신을 25 ng/mL로 희석합니다(1 mg/mL 스톡에서 1:40 희석). 컨트롤로서 M9의 DMSO와 동등한 부피를 희석합니다.
      3. 웜에 25 ng/mL 튜니카마이신/M9 또는 제어 DMSO/M9 용액을 추가합니다(1.5mL 튜브의 경우 400-500 mL, 15mL 원추형 튜브의 경우 2mL 사용). 3-4 시간 동안 회전 플랫폼에서 20 °C에서 배양하십시오.
        참고 : 튜니 카마이신은 웜 / M9 믹스로 직접 희석 할 수 있습니다.
      4. 웜이 정착하고, M9/TM 용액을 제거하고, M9 1mL로 세척할 수 있도록 합니다.
      5. 동물을 NGM 플레이트 또는 NGM RNAi 플레이트로 옮기고 형광 현미경 검사법을 수행하기 전에 밤새 (또는 ~ 15-20 h) 성인의 1일째에 도달할 수 있도록 합니다(섹션 5). GFP의 검출 가능한 수준이 누적될 수 있도록 하룻밤 복구가 수행됩니다.
      6. 또는, hsp-4p::GFPL4 동물을 16-24시간 동안 25 ng/μL 튜니카마이신을 함유하는 한천 플레이트로 이동시킴으로써 유도한다. 이것은 hsp-4p::GFP의 훨씬 더 강력한 유도를 가지고 있기 때문에 스트레스의 긴 기간, 따라서 동적 범위는 위에서 설명한 분석보다 훨씬 낮습니다.
  2. HSP-6p 사용::GFP를 UPRMT 활성화를 위한 판독으로 사용
    1. RNAi를 사용하여 미토콘드리아 스트레스를 유도
      1. COX-5b/cco-1과 같은 미토콘드리아 유전자의 RNAi 녹다운을 사용하는 것을 제외하고 섹션 4.1.1과 동일한 프로토콜에 따라 UPRMT를 활성화하십시오 (시토크롬 c 옥시다아제 소단위 5B; 녹다운은 전자 수송 사슬 활동을 억제합니다). 전자 수송 사슬 기능의 교란을 통한 UPRMT 활성화를 위해 RNAi 녹다운은 초기 개발20동안 수행되어야 합니다. 따라서 이러한 실험에 대해 해치로부터 RNAi를 수행합니다.
    2. 화학 약제를 사용하여 미토콘드리아 스트레스를 유도
      1. 섹션 3에서와 같이 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 RNAi 박테리아로 발견된 플레이트를 준비합니다. RNAi 녹다운을 포함하지 않는 실험에서도 HT115 박테리아를 사용하십시오 (섹션 1 참조). NGM RNAi 플레이트(또는 NGM RNAi + DMSO0.2) 및 NGM RNAi + 항마이신 A플레이트(표 1)가모두 4.2.2.5 단계에 대해 제조되었는지 확인합니다.
      2. hsp-6p 동기화::GFP 또는 hsp-60p::GFP 리포터 동물 섹션 2에 설명된 방법을 사용 하 여.
      3. 접시 계란을 종자 접시에 따라 선택한 기준을 사용하여 표 2에서권장합니다. 항마이신 A가 DMSO에 용해되기 때문에, NGM RNAi + DMSO0.2 플레이트에서 동물을 해치로부터 성장시다.
      4. 20°C에서 2일(~56시간)에 계란을 L4 단계로 배양한다. 또는, 동물을 15°C에서 3일 동안(~75시간) 대신 성장시다.
      5. NGM RNAi + DMSO0.2 플레이트에서 NGM RNAi + 안티마이신 A 플레이트 또는 NGM RNAi + DMSO0.2 플레이트를 대조군으로 이동시다. 웜은 소규모 실험을 위해 선택으로 수동으로 이동할 수 있지만 대규모 실험의 경우 동물을 M9로 세척하고 원심 분리로 정착한 다음 NGM RNAi + 항마이신 A 플레이트에 도금을 하는 것이 좋습니다.
      6. 추가 ~20 시간 동안 벌레를 배양하고 1 일째 성인 (섹션 5)에서 이미지를 배양하십시오.
  3. gst-4p를 사용 하 여::GFP 산화 스트레스 응답에 대 한 판독으로.
    1. RNAi를 사용하여 OxSR 유도
      1. 대안적으로, gst-4p::GFP를 사용하여 wdr-23의 RNAi-knockdown (skn-1의음성 조절자를 인코딩한다. 따라서, 그 녹다운은 섹션 4.1.1에 기술된 프로토콜을 사용하여 OxSR을 유도한다).
    2. 화학 산화제 테르트 부틸 하이드로 과산화물에 노출을 사용하여 OxSR을 유도 (TBHP)
      1. 섹션 3에서와 같이 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 RNAi 박테리아로 발견된 플레이트를 준비합니다. RNAi 녹다운을 포함하지 않는 실험에서도 HT115 박테리아를 사용하십시오 (섹션 1 참조).
      2. gst-4p::GFP 리포터 동물 섹션 2에 설명된 방법을 사용 하 여 동기화 합니다.
      3. 접시 계란을 종자 접시에 따라 선택한 기준을 사용하여 표 2에서권장합니다. 약물 치료 프로토콜로 인해 동물의 >10-20%가 손실되기 때문에 필요 이상으로 많은 플레이트를 준비해야 합니다. 이미징을 위해 >100 동물로 시작하고 분류하기 위해 >1,000 동물로 시작하십시오.
      4. 20°C에서 2일(~56시간)에 계란을 L4 단계로 배양한다. 또는, 동물을 15°C에서 3일 동안(~75시간) 대신 성장시다.
      5. L4 동물을 접시에서 씻어 내고 조건당 2 개의 15 mL 원엽 튜브로 나눕습니다. 적어도 1 mL까지 흡인 볼륨과 갓 만든 2mM TBHP의 동일한 볼륨을 추가합니다. 낮은 부피가 회전 할 때 웜의 중요한 죽음을 일으킬 수 있으므로, 적어도 2 mL에 총 액체 볼륨을 사용합니다. 약물 치료 전에 세척하지 마십시오, 접시에서 잔류 박테리아는 배양 하는 동안 과잉 하지 웜을 보장 하는 데 도움이 될 것입니다.
      6. 20°C에서 4시간 동안 회전자 상에 벌레를 배양한다.
      7. 1,000 x g에서회전하여 웜을 세척하고 M9 + TBHP 믹스를 흡입하고 M9의 15 mL로 교체하십시오. 두 번째 세척을 위해 반복합니다.
      8. EV RNAi에 플레이트 웜은 20°C에서 하룻밤(~16-24시간)을 회복한다. 웜은 선택의 RNAi 일치에 복구 할 수 있지만, EV RNAi에서 복구 할 때 중요한 차이가 보이지 않았다, 그래서이 실험 설정의 용이성을 위해 수행 할 수 있습니다. 회복 후 성인 1일째의 이미지를 찍습니다.
        참고: 감지 가능한 수준의 GFP가 누적될 수 있도록 야간 복구가 수행됩니다. 이 복구가 없으면 감지 가능한 GFP 신호가 없습니다. 단기 회복이 필요한 경우, 4.3.3항에 기재된 분석기를 사용할 수 있다.
    3. 화학 산화 파라쿼트 (PQ)에 노출을 사용하여 OxSR을 유도
      1. 섹션 4.2.2의 모든 단계를 반복하여 조건당 15 mL 원엽 튜브에서 L4 gst-4p::GFP 동물을 2회 배치합니다.
      2. 적어도 1 mL까지 흡인 부피를 추가하고 갓 만든 100 μM PQ의 동일한 볼륨을 추가합니다. 4.3.2.5와 유사하게 최소 2mL의 부피를 권장합니다.
      3. 20°C에서 2시간 동안 회전자 상에 벌레를 배양한다.
      4. 1,000 x g에서회전하여 웜을 세척하고 M9 + PQ 믹스를 흡인하고 M9의 15 mL로 교체하십시오. 두 번째 세척을 위해 반복합니다.
      5. EV RNAi의 플레이트 웜은 20°C에서 2시간 동안 회복한 다음, 회복 직후 이미지를 촬영한다.
        참고 : 2 시간의 회복은 GFP 유도를 시각화하는 데 필요한 최소한의 회복이었습니다.
  4. HSP-16.2p:::GFP 및 hsp-70p::GFP를 HSR 활성화를 위한 판독으로 사용.
    1. 높은 온도에 노출을 사용하여 HSR 유도
      1. 섹션 3에서와 같이 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 RNAi 박테리아로 발견된 플레이트를 준비합니다. RNAi 녹다운을 포함하지 않는 실험에서도 HT115 박테리아를 사용하십시오 (소개 참조).
      2. hsp-16.2p::GFP 또는 hsp-70p::GFP 리포터 동물 섹션 2에 설명된 방법을 사용 하 여.
      3. 접시 계란을 종자 접시에 따라 선택한 기준을 사용하여 표 2에서권장합니다. 샘플의 절반이 열 충격 유도를 위해 높은 온도에 노출될 때 필요한 플레이트 수를 2배 준비해야 하며, 나머지 절반은 비열 충격 제어역할을 합니다.
      4. 20°C에서 약 3-4일 동안 계란을 배양(~65-96시간)하여 성인기 1일째에 실험을 수행하였다. 열 충격 실험을 위해 15 °C에서 벌레를 성장시키지 마십시오.
      5. 동물의 실험 그룹을 34°C 인큐베이터로 이동하여 2 시간 동안 플레이트를 단일 층(즉, 플레이트 스태킹 없음)으로 인큐베이터에 배치하여 플레이트 전반에 걸쳐 가장 빠르고 가장 균등한 열 분포를 보장합니다.
      6. 열 충격을 받은 동물을 20°C 인큐베이터로 옮겨 2시간 동안 회복한 다음 즉시 이미지화합니다(섹션 5 참조). 더 높은 GFP 유도를 위해 필요한 경우 동물을 더 오래 회복할 수 있습니다.
        참고 : 2 시간의 회복은 GFP 유도를 시각화하는 데 필요한 최소한의 회복이었습니다.

5. 스테레오 현미경 또는 저배율 광시야 /화합물 현미경을 사용하여 이미징

  1. 형광 현미경 검사법에 대한 벌레의 준비
    1. 표준 NGM 플레이트 위에 100 mM 나트륨 아지드의 피펫 5-10 μL (즉, 박테리아 없음).
      참고: 아지드 나트륨 농도는 10 mMM까지 낮아질 수 있지만, 가장 강력한 고정화는 형광 신호에 대한 검출 가능한 영향없이 100 mM 나트륨 아지드에서 관찰되었습니다.
    2. 해부 현미경으로 실험 판에서 10-20 마리의 동물을 선택하고 아지드 나트륨 자리로 옮김을 옮김하십시오. 동물은 아지드 나트륨에 착륙 한 직후 이동을 중단해야하며, 아지드 나트륨 자체는 몇 초 이내에 증발합니다.
    3. 나트륨 아지드가 증발하면, 원하는 이미징 설정에 동물을 줄. 모든 동물에 대해 동일한 방향으로 전방 및 후방 측면으로 동물을 나란히 이동합니다. 이미지 동물즉시.
      참고: 나트륨 아지드에서 마비된 후 최대 15분 동안 표 3의 전사 리포터에 대해 리포터 신호의 변화가 관찰되지 않았다.
  2. 입체 현미경을 사용한 이미지 수집
    참고: 이 프로토콜의 경우 라이카 DFC3000G 단색 CCD 카메라, 표준 라이카 GFP 필터(예: 395-455, EM 480 LP) 및 LAS X 소프트웨어가 장착된 라이카 M205FA 현미경이 사용되었습니다. 노출 시간에 대한 권장 설정은 표 4에서찾을 수 있습니다.
    1. LAS X 프로그램을 시작합니다.
    2. 새 프로젝트 시작: 획득 탭을 열고 프로젝트 열기를 클릭하고 폴더를 클릭하여 새 프로젝트를 엽니다. 이 프로젝트의 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 아래로 스크롤하여 이름을 바꾸거나 F2를클릭하여 이름을 바꿀 수 있습니다. 수집 탭에는 노출 시간을 조정하고 원하는 설정으로 확대할 수 있는 옵션도 있습니다.
    3. 현미경 목표 아래에 웜 샘플을 배치하고 형광 표백을 최소화하기 위해 밝은 필드 설정을 사용하여 웜의 올바른 초점을 찾습니다. 샘플의 중심은 계란의 라인이 명확하게 볼 수 있고 흐릿하지 않은 곳입니다. 노출 시간, 확대/축소, 초점 및 밝은 필드 응축기를 원하는 설정으로 설정합니다.
    4. 이미지 캡처 단추를 사용하여 이미지를 수집합니다.
    5. 모든 원시 이미지와 메타데이터를 저장하기 때문에 .lif(라이카 이미지 파일) 형식으로 이미지를 저장합니다. 이미지(또는 프로젝트)를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 TIFF를 내보낼 수도 있고 옵션으로 저장 에서 TIFF를클릭합니다. 이렇게 하면 모든 채널(예: 밝은 필드 및 GFP)이 모든 수정 사항(예: 대비가 조정된 경우 TIFF에 저장됨)을 저장합니다.
  3. 형광 이미지의 정량적 분석
    1. 정량적 분석이 수행될 경우 3D 이미지를 가져가 십시오. 이 옵션은 오른쪽 상단에 "z"로 레이블이 지정된 z-섹션 옵션을 클릭하여 수행됩니다. 이 상자가 빨간색이면 Z 섹션이 활성화됩니다.
    2. 조정 가능한 옵션의 왼쪽 하단에 있는 범위와 슬라이스 두께를 선택하여 z 단면을 최적화합니다. 가능하면 최적의 설정을 위해 시스템 최적화 버튼을 사용하십시오.
    3. 5.2절에 설명된 대로 이미지를 캡처하고 저장합니다. 웜을 둘 사이에 공백을 두어 측정을 쉽게 할 수 있습니다.
    4. TIFF 이미지를 선택한 이미징 소프트웨어(예: ImageJ)로 가져옵니다.
    5. ImageJ의 경우 분석 메뉴에서 측정 설정 을 선택합니다. 다음을 확인합니다: 면적, 평균 회색 값, 통합 밀도, 디스플레이 레이블.
    6. ROI(관심 지역) 도구를 사용하여 ROI를 그립니다. 각 웜을 개별적으로 측정합니다. 분석 메뉴에서 측정값을 선택하거나 M을누릅니다. 웜이 없는 백그라운드에서 ROI를 그린 다음 동일한 방식으로 배경을 측정합니다. 결과 창에 나타나는 측정값을 복사하거나 저장합니다.
    7. 측정된 각 ROI의 통합 밀도에서 배경 통합 밀도를 뺍니다. ROI의 배경 강도는 배경의 곱이 회색 값과 그려진 ROI 영역으로 정의됩니다.
  4. 화합물/광시야 현미경을 사용한 이미지 수집
    참고 : 화합물 / 광시야 현미경을 사용하여 전사 기자의 이미징을 위해,이 프로토콜은 올림푸스 4x 계획 불소 NA 0.13 대물 렌즈, 표준 올림푸스 FITC 필터 (예 : 470 / 40; em 525 / 50)가 장착 된 회전 ECHO R4 현미경을 사용합니다. DM 560) 및 카메라및 ECHO 소프트웨어를 구동하기위한 iPad 프로. 노출 시간에 대한 권장 설정은 표 4에서찾을 수 있습니다.
    1. 터치 패드를 사용하여 제어 프로그램을 시작합니다. 새 앨범 및 파일 이름을 만듭니다.
    2. 대물 렌즈 아래에 플레이트를 배치합니다. 기준선(EV/제어 처리) 및 포지티브 컨트롤을 사용하여 노출 시간 및 형광 강도를 설정하여 신호가 표시되지만 포화되지 않도록 합니다.
    3. 밝은 필드 이미지와 GFP/FITC 이미지를 저장합니다.

6. 대입자 유동 세포계를 사용하여 기자의 정량적 측정

참고: 큰 입자 유동 세포계 분석을 위한 벌레의 성장 및 준비는 형광 화상 진찰을 위한 벌레의 준비를 위한 단면도 1-5와 같은 패러다임을 따를 수 있습니다, 동물의 더 많은 수가 요구되는 것을 제외하고는. 사용 >500 조건 당 동물, 일부 동물은 조작 하는 동안 손실, 모든 동물 정량화 하는 동안 필터링 기준을 통과 하 고 일부 동물 은 유세포계에 의해 제대로 판독 되지 않습니다. 5-10 mL의 M9 용액으로 플레이트를 15 mL 원엽 튜브로 분류하여 유동 세포계에서 후속 선별할 준비가 된 동물을 세척합니다.

  1. 큰 입자 유량 세포계를 사용하여 설정 정렬
    1. 유량 세포계를 켜기 전에
      1. 칼집 액체 병이 비어 있지 않은지 확인하십시오. 선별기를 사용하기 전에 적어도 몇 시간 전에 250x 스톡에서 시스 액체를 준비하십시오.
      2. 모든 폐기물 용기가 가득 차 있지 않은지 확인합니다.
    2. 유량 세포계 켜기
      1. 공기 압축기를 켭니다. 자동으로설정합니다. 압력 게이지를 확인 - 그것은 약 30 psi이어야한다.
      2. 악기를 켭니다. 기기 왼쪽의 전원 코드 옆에 있는 전원 스위치를 사용합니다.
      3. 레이저를 켭니다. 488 nm 광원은 일반적으로 대부분의 실험에 충분하지만 적색 형광에 대해 더 높은 여기가 필요한 경우 561 nm 광원을 사용해야 합니다.
      4. 플로우파일럿 소프트웨어 열기; 계측기는 여러 밸브에서 일련의 클릭스위칭을 해야 합니다.
      5. 시작을클릭하여 소프트웨어 창에서 레이저를 켭니다. 실행을클릭하여 아르곤 레이저 제어 팝업 창에서 레이저를 시작합니다. 이렇게 하면 레이저가 켜지고 약 12mW에 도달합니다. 488 광원 수준은 약 12까지 올라갈 것입니다.
      6. 완료를 클릭하여 창을 닫습니다.
    3. 진행하기 전에 소프트웨어 확인
      1. 압력 게이지 확인 -창 하단에 표시된 4개의 압력 값을 확인합니다. 값은 원래 설정(Sheath 5.5-5.7) 주위에 있어야 합니다. 샘플 5.7-6.0; 선별기 3.1-3.3; 청소 8.5-8.7). 비슷해 보이는 경우 압력 확인옆의 확인란을 선택합니다.
      2. 유체 검사 - 유동 셀을 통해 칼집 / 샘플의 흐름을 차단하는 기포와 파편이 없는지 확인하려면 여러 번 청소를 클릭하십시오.
      3. 칼집 유량 확인 -이를 위해 60초 동안 Off Sort덮개를 수집한 다음 수동 컨트롤에서 Sheath를 켜서 칼집의 흐름을 시작합니다. 60 s에 대 한 15 mL 튜브에 수집; 유량은 ~9-10 mL /min이어야합니다.
    4. 유량 세포계 사용 전 세척
      1. 컬렉션 '컵'에 10 % 표백제 용액의 ~ 3-5 mL을 넣고 취득을클릭합니다. ~ 30 s를 실행하자, 중단을클릭하고, 진공으로 초과를 제거합니다.
      2. 탈이온수로 컬렉션 '컵'을 헹구고 진공청소기로 제거합니다. 2x를 반복합니다.
      3. 컬렉션 '컵'에 COPAS 청소 용액의 ~ 3-5 mL을 넣고 취득을클릭합니다. ~ 30 s를 실행하자, 중단을클릭하고, 진공 과잉 청소 솔루션을 제거합니다.
      4. 탈이온수로 컬렉션 '컵'을 헹구고 진공청소기로 제거합니다. 2x를 반복합니다.
      5. 컬렉션 '컵'에 M9 용액의 ~ 3-5 mL을 넣고 취득을클릭합니다. ~ 30 s를 실행하자, 중지를클릭하고 진공 과잉 M9 용액을 제거합니다.
  2. 선별기에서 샘플 실행
    1. 관심 있는 전사 리포터의 가장 밝은 활성화를 유발하는 조건에 따라 레이저 PMT 전력 및 크기 게이팅을 조정합니다. 권장 설정은 표 4에서찾을 수 있습니다.
    2. 준비된 벌레를 '컵'에 넣습니다. 획득을 클릭합니다. 모든 액체가 기계에 들어가지 않았는지 확인하십시오. 이로 인해 유세포계가 공기에 유입되어 검출기의 기포가 생성됩니다.
    3. 샘플이 낮거나 충분한 동물이 수집되었을 때 중단을 클릭합니다.
    4. 설치를 클릭합니다 | 데이터 스토리지 | 게이트 전용. 이렇게 하면 크기 제약 조건에 따라 데이터만 저장됩니다. 게이트 저장을 클릭하고 게이트 데이터를 저장합니다. 지우기를 클릭하여 데이터를 지웁습니다.
    5. 탈이온수로 컬렉션 '컵'을 헹구고 진공청소기로 제거합니다. 2x를 반복합니다.
    6. 나머지 샘플과 함께 6.2.1-6.2.5 단계를 반복합니다.
  3. 교정/ 품질 관리 - 필요한 경우
    참고: 이를 위해서는 488 레이저를 교정하기 위해 제공된 42 μM GYR 형광 입자를 실행해야 합니다.
    1. 샘플 컵 상단의 금속 립을 눌러 공기 튜브를 제거합니다. 캡을 풀고 주사기를 사용하여 샘플 컵에서 액체를 제거합니다.
    2. 사용하기 전에 제어 입자의 병을 잘 혼합하고 샘플 컵에 몇 밀리리터를 추가합니다. 캡을 닫고 제자리에 딸깍 소리가 나을 때까지 눌러 공기를 다시 닫습니다.
    3. 소프트웨어에서 도구 옵션으로 이동하여 파티클 제어 실행을클릭합니다.
    4. 제어 파티클의 경우 PMT 값을 녹색 - 325로 재설정합니다. 노란색 - 365; 레드 - 575.
    5. 획득을 클릭합니다. 칼집은 샘플 다음에 켜야합니다. 구슬이 유동 셀을 통과하기 시작하면 화면 하단에 유량이 표시됩니다. 최적으로 유량은 5/s에서 15/s 사이여야 합니다. 유량이 너무 낮거나 0이면 샘플 밸브를 시계 방향으로 물리적으로 돌려 유량을 늘립니다. 유량이 너무 높으면 샘플 밸브를 시계 반대 방향으로 물리적으로 돌려 유량을 줄입니다.
      참고: 일반적으로 비드 세이버 모드에서는 500개의 비드가 꺼지기 전에 읽습니다. 데이터를 지우고 구슬을 다시 읽을 수 있습니다.
    6. 판독이 완료되면 CV 값뿐만 아니라 5개의 매개 변수에 대한 깨끗한 단일 피크를 확인합니다. 분산 계수(CV)는 <15%여야 합니다. 또한 세 가지 다른 형광 채널에 대한 CV 값이 서로 가까이 있는지 확인합니다.
    7. QC 검사 기록 만들기: 파일 탭 아래에서 화면 이미지로 저장을클릭합니다.
  4. 청소 및 종료
    1. 진공을 사용하여 샘플 컵에서 샘플을 제거하고 섹션 4.1.4을 반복합니다.
    2. 수집 '컵'에 탈이온 물의 ~ 3-5 mL을 넣고 획득을클릭 , ~ 30 s를 실행하자, 다음 중단을클릭합니다 . 샘플 컵에 증류수를 남겨 둡니다.
    3. 샘플 회수 컵과 폐병을 비웁습니다.
    4. 소프트웨어를 끕니다. 파일 탭에서 종료를 클릭합니다. 팝업 메뉴에서 제거 하지 않고 끄기클릭 합니다.
    5. 레이저를 끄고 기기를 끄고 공기 압축기를 끕니다. 해치를 닫아 악기를 덮습니다.

7. C. 예쁜꼬마선충의 스트레스 민감도를 측정하는 생리학적 측정

  1. 튜니카마이신 노출을 이용한 ER 응력 민감도 측정
    1. 섹션 3에서와 같이 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 RNAi 박테리아로 발견된 NGM RNAi DMSO 플레이트를 준비합니다. RNAi 녹다운을 포함하지 않는 실험에서도 HT115 박테리아를 사용하십시오 (섹션 1 참조). 또한 NGM RNAi TM 플레이트를 시드하는 것을 기억하십시오 (표 1참조). 접시의 충분한 양을 씨앗 : NGM RNAi DMSO 플레이트 ~ 5-7 세트와 NGM RNAi TM 플레이트 ~ 2-3 세트에 대한 계획.
    2. 섹션 2에 설명된 방법을 사용하여 선택한 동물을 동기화합니다.
    3. 접시 계란을 NGM RNAi DMSO 종자 접시에 표 2에서권장하는 기준을 사용하여 선택합니다. 샘플의 절반이 NGM RNAi TM 플레이트로 이송될 때 필요한 플레이트 수를 2배 로 준비해야 합니다.
    4. 20°C에서 약 3-4일(~65-96시간)에 계란을 인큐베이션하여 성인기 1일째에 배양한다.
    5. 첫날에는 동물을 별도의 접시에 옮겨 수명을 준비하십시오. 플레이트를 보존하려면(TM 비용이 높기 때문에) 조건당 15마리의 8개의 접시를 사용하십시오. 이를 통해 점수 매기기 위해 플레이트당 관리 가능한 수의 동물을 허용하고 일부 검열을 통해도 통계 분석을 위해 충분한 양의 동물을 허용합니다.
    6. 처음 5-7 일 동안, 자손을 더 이상 볼 수 없을 때까지 새로운 접시에 매일 자손에서 멀리 성인 동물을 이동합니다. 이 단계에서, 검거된 동물을 검열하거나, 외음부 돌출부/폭발을 나타내거나, 판의 측면을 기어 오르는 것은 ER 응력 민감도와 관련된 사망이 아니기 때문에. TM 처리는 동물에서 체포를 일으키는 원인이 되고, 따라서 이 동물의 단지 1-2 이동은 TM 함유 격판덮개 생성과 관련되었던 비용을 최소화하기위하여 충분합니다 2-3 일마다. 야생형 동물은 DMSO에서 ~15-17일, 투니캄시인에서 12-14일의 평균 생존시간을 가진다.
    7. 동물이 자손 생산을 중단 한 후, 모든 동물이 죽은 또는 검열로 득점 될 때까지 매 1-2 일마다 수명을 점수. TM-치료 동물 매일 하루 동안 6-14 더 높은 해상도 대 한 성인의.
  2. 파라쿼트에 노출을 사용하여 미토콘드리아 및 산화 스트레스 민감도 측정
    1. 섹션 3에서와 같이 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 RNAi 박테리아로 발견된 플레이트를 준비합니다. RNAi 녹다운을 포함하지 않는 실험에서도 HT115 박테리아를 사용하십시오 (소개 참조).
    2. 섹션 2에 설명된 방법을 사용하여 선택한 동물을 동기화합니다.
    3. 접시 계란을 NGM RNAi 종자 접시에 표 1에서권장하는 기준을 사용하여 선택합니다. 이 분석에서는 조건당 ~60-100마리의 동물을 요구하므로 그에 따라 준비하십시오.
    4. 20°C에서 약 3-4일(~65-96시간)에 계란을 인큐베이션하여 성인기 1일째에 배양한다.
    5. M9 용액에서 100mMMM 파라쿼트의 신선한 바이알을 준비합니다.
    6. M9+파라쿼트의 피펫 50-75 μL을 원하는 대로 평평한 바닥 96-well 플레이트의 많은 우물로 넣습니다. 일반적으로 웰당 ~8-10 마리의 동물을 포함하는 조건당 ~8-10 개의 우물을 가지는 것이 좋습니다. 이것은 균주 당 ~ 80 동물과 잘 당 동물의 쉽게 눈에 띄는 수를 허용한다.
    7. 조건당 8-10마리의 동물을 골라 M9+파라쿼트(paraquat)를 함유한 각 우물로 옮김을 옮김을 넣습니다. 피펫팅 대신 우물로 동물을 옮기기 위해 픽을 사용하여 부피의 차이와 파라쿼트 농도의 의도하지 않은 변화를 방지합니다.
    8. 모든 2 시간, 각 우물에서 동물의 죽음에 대한 점수. 접시를 부드럽게 누르면 살아있는 동물이 쓰러지거나 구부러집니다. 살아있는 동물이 죽은 것으로 득점 될 만큼 오랫동안 마비 될 수 있습니다. 따라서 살아있는 동물의 수가 이전 시점의 살아있는 동물의 수를 초과하는 경우 동물이 살아 있고 점수를 매기지 않아야 할 가능성이 높습니다 (예 : 시간 4, 2/10 동물이 죽은 것으로 점수가 매겨진 경우, 6 시에는 1/10 동물만 죽었으며 시간 4는 죽은 동물1/10마리로 다시 점수를 매겨야 합니다).
  3. 높은 온도에 노출을 사용하여 열 감도 측정
    1. 섹션 3에서와 같이 관심 있는 유전자를 표적으로 하는 RNAi 박테리아로 발견된 플레이트를 준비합니다. RNAi 녹다운을 포함하지 않는 실험에서도 HT115 박테리아를 사용하십시오 (섹션 1 참조).
    2. 섹션 2에 설명된 방법을 사용하여 선택한 동물을 동기화합니다.
    3. 접시 계란을 종자 접시에 따라 선택한 기준을 사용하여 표 1에서권장합니다. 열내성 검사에 대한 조건 당 60-100 마리의 동물을 가지고 있습니다. 열내성 분석의 경우, 분석법에서 동물의 나이에 따라 주요 가변성이 있기 때문에 L1 체포 또는 계란 누워 분석법으로 최상의 동기화를 사용하십시오.
    4. 20°C에서 동물을 약 3-4일 동안 배양(~65-96시간)하여 성인기 1일째에 실험을 수행하였다. 열 충격 실험을 위해 15 °C에서 벌레를 성장시키지 마십시오.
    5. 1일째에는 동물을 별도의 접시에 옮겨 준비합니다. 일반적으로 총 60 마리의 동물을 위해 4-6 접시가있는 접시 당 ~ 10-15 마리의 동물을 두는 것이 좋습니다. 이를 통해 점수를 매기기 위해 플레이트당 동물 수를 관리할 수 있으며, 동물이 높은 온도에서 끌어낼 수 있는 최소한의 시간을 허용합니다.
    6. 동물을 37°C 인큐베이터에 넣고 2시간마다 점수를 매기고, 5시간 전에 거의 또는 전혀 사망하지 않는 경우 37°C에서 열내성에 대한 점수를 매기기 시작합니다. 중간 열내성은 ~ 9 시간에서 수행되므로 시간 7, 9 및 11은 중요한 시간지점이지만 인큐베이터 및 실험실 간 변동성으로 인해 실험실당 적정해야 할 수도 있습니다. 더욱이, 가변성을 감소시키는 모든 방법은 도움이 될 것입니다 (예를 들어, 플레이트를 스태킹하지 않고, 단일 인큐베이터 내에서 동일한 영역에 플레이트를 배치하고, 인큐베이터가 열리거나 닫혀있는 시간을 최소화하고, 동물이 37 °C 밖에서 보내는 시간을 최소화하기 위해 한 번에 인큐베이터에서 적은 플레이트를 복용하는 등) 도움이 될 것입니다. 전체 가이드는21)을참조하십시오.
    7. 7.3.6단계에 대한 대안으로, 동물을 37°C 대신 34°C에 놓는다. 34°C에서의 평균 열내성은 14시간 이상이므로 시간점 12, 14 및 16은 34°C 열내성 검정검에 매우 중요합니다.

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결과

전사 리포터를 사용하여 스트레스 반응 의 활성화를 측정
여기에서, 형광 전사 기자는 C. elegans에있는 대부분의 긴장 반응의 활성화를 측정하는 강력한 공구로 봉사하는 이용됩니다. GFP 발현은 구획별 응력에 반응하는 데 관여하는 마스터 전사 조절제의 정식 표적의 프로모터에 의해 구동된다. 일반적으로 사용되는 전사 기자의 포괄적인 목록은 표 3에서확인할 수 있습니다.

전개 되거나 잘못 접힌 단백질 또는 지질 이중층 스트레스를 통해 ER 항상성을 교란하면 ER(UPRER)의전개된 단백질 반응의 활성화를 일으켜 ER 의 품질 및 기능을 회복시킨다. UPRER은 막간 센서에 의해 정의된 3개의 별개의 가지로 구성되어 있습니다: 이노시톨 요구 단백...

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토론

여기서, C. elegans에서세포 스트레스 반응을 심문하는 방법, 형광 전사 리포터 및 생리적 스트레스 생존 측정법을 사용하여 설명된다. 기자들은 모두 세포 스트레스 반응 장착에 관여하는 전사 인자의 다운스트림 전사 표적의 프로모터 하에 구동되는 GFP 발현을 이용한다. hsp-4p의 사용 ::GFP는 XBP-1s 매개 UPRER에의해 변조, hsp-6p ::GFP ATFS-1 중재 UPRMT에의해 제어, GST-4p::GFP SKN-1 중재 OxSR에서, hsp16.2p::GFP 및 hsp-70p::HSF-1 매개 열 충격 응답에서 GFP설명. 다른 표준화된 전사 기자는 표 3에서찾을 수 있습니다. 여기에 제시된 모든 전사 기자는 넓은 동적 범위를 가지고 있으며 유전 적 교란 또는 스트레스 유발 화학 물질에 대한 노출을 통해 스트레스를 적용하여 강력하게 활성화 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

R.BZ. EMBO 장기 펠로우십과 래리 L. 힐블롬 재단의 지원을 받고 있습니다. R.H.S는 국립 노화 연구소 (NIA)와 의학 연구 박사 후 펠로우십을위한 글렌 재단을 통해 보조금 5F32AG032023-02에 의해 지원됩니다. A.F.는 NIA를 통해 F32AG051355를 지원합니다. 에이치케이지는 국립과학재단 대학원 연구동호회 프로그램을 통해 DGE1752814를 지원하고 있습니다. M.G.M.은 NIA를 통해 1F31AG060660-01에 의해 지원됩니다. A.D.는 토마스와 스테이시 시벨 재단, 하워드 휴즈 의학 연구소, 4R01AG042679-04 및 NIA의 5R01AG055891-02, 그리고 NIEHS의 5R01ES021667-09에 의해 지원됩니다. 래리 조, 멜리사 산체스, 나메 켈렛, 아넬 에스퀴벨에게 상당한 기술적 지원을 부탁드립니다. 우리는 모리모토 연구소와 CGC (연구 인프라 프로그램 P40 OD010440의 NIH 사무실에 의해 투자) 균주에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티마이신 A미토콘드리아 스트레스에 대한시그마-알드리치A8674
NGM 플레이트에 대한Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118072
NGM 플레이트에 대한BD Difco 과립 한천VWR90000-782
플레이트에 대한칼슘 이수화물VWR97061-904
CarbenicillinBioPioneerC0051-25RNAi용
레스테롤Sigma-Aldrich57-88-5NGM 플레이트용
COPAS BiosorterUnion Biometrica350-5000-000488nm 광원 장착.
COPAS 세척 용액Union Biometrica300-5072-000COPAS
칼집 솔루션Union Biometrica300-5070-100COPAS
DMSOSigma-Aldrich472301약물용 용매
IPTG 다이옥산 무함유Denville ScientificCI8280-4RNAi
LB 육수, MillerFisher ScientificLB
M205FA 스테레오스코프Leica10450040 Leica DFC3000G 단색 CCD 카메라, 표준 Leica GFP 필터(예: 395-455, EM 480 LP) 및 NGM
플레이트용황산마그네슘 헵타하이드레이트VWREM-MX0070-3
산화/미토콘드리아 스트레스용파라콰트Sigma-Aldrich36541
칼FisherP217-500표백제용 soluton
인산칼륨 이염기성 VWREM-PX1570-2NGM 플레이트용
인산칼륨 일염기성 VWREM-PX1565-5Olympus
4x Plan Fluorite NA 0.13 대물 렌즈, 표준 Olympus FITC 필터(ex 470/40; em 525/50; DM 560), 카메라 및 ECHO 소프트웨어
Sodium AzideSigma-Aldrich71289-50G이미징용
NGM 플레이트용MilliporeSX0420-5
인산나트륨 이염기성VWR71003-472
산화 스트레스
용 Sigma-Aldrich 458139RNAi시그마-알드리치T7660-5G
응급실 스트레스용시그마-알드리치T7765-50MG
: , , , NGM염화, 콜, , , 와 함께 사용 용 BP1426500 ,M9 염화륨Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G, M9 Tert-butyl hydroperoxide용 M9 투니카마이신용 테트라사이클린 하이드로클로라이드

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