여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.
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방법 논문
C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
유기체는 종종 변동 환경과 세포 내 항상성에 변화에 노출, 이는 자신의 단백질과 생리학에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 유기체는 손상을 복구하고 항상성을 유지하기 위해 최선을 다하고 대상 및 특정 스트레스 응답을 진화했다. 이러한 메커니즘은 내구 성 망막(UPRER),미토콘드리아의 전개된 단백질 반응(UPRMT),열 충격 반응(HSR) 및 산화 스트레스 반응(OxSR)의 전개된 단백질 반응을 포함한다. 여기에 제시 된 프로토콜은 선충, C. elegans에서이러한 경로및 생리적 결과의 활성화를 감지하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 먼저, 경로 특이적 형광 전사 기의 사용은 신속한 세포 특성화, 약물 스크리닝, 또는 대규모 유전자 스크리닝(예를 들어, RNAi 또는 돌연변이 라이브러리)에 대해 기술된다. 또한, 상보적이고 견고한 생리학적 측정이 설명되며, 이는 특정 스트레스에 대한 동물의 민감도를 직접 평가하는 데 사용될 수 있으며, 전사 기의 기능적 검증역할을 한다. 함께, 이러한 방법은 내부 및 외부 proteotoxic 섭동의 세포 및 생리적 효과의 신속한 특성화를 허용합니다.
서론
세포 내 및 세포 외 환경의 변화에 반응하는 유기체의 능력은 생존과 적응에 매우 중요합니다. 이것은 세포의 무결성을 보장하는 수많은 보호 경로를 통해 세포 수준에서 수행됩니다. 수많은 세포 구성 요소는 스트레스 관련 손상의 대상이 되는 동안, 세포 스트레스 응답의 한 가지 주요 참여는 복구 하 고 세포 proteome의 항상성을 보호 하는. 그러나, 세포기관에게 불린 특별한 구조물로 단백질의 구획화는, 세포 내의 모든 단백질이 제대로 접혀 있고 기능적이다는 것을 확인하기 위하여 단백질 품질 관리의 1개의 중앙 집중식 양식에 의지할 수 없기 때문에, 세포를 위한 도전을 제기합니다. 따라서, 그들의 단백질에 교란을 다루기 위하여는, 세포기관은 잘못 접힌 단백질을 감지하고 그 구획 내의 응력을 경감하기 위하여 시도에서 긴장 반응을 활성화할 수 있는 전용적인 품질 관리 기계장치를 발전시켰습니다. 예를 들어, 시토솔은 열 충격 반응(HSR)에 의존하는 반면, 내포성 망상체(ER)와 미토콘드리아는 구획특이적 전개단백질 반응(UPR)에 의존한다. OxSR 반응성 산소 종의 독성 효과 완화 하는 역 (ROS). 각 스트레스 반응은 세포 도전과 환경 모욕의 존재에서 트리거되고 맞춤형 전사 반응을 유도한다. 이 반응의 특징은 적당한 세포기관을 표적으로 한 잘못 접힌 단백질 (샤페론과 같은) 또는 대안으로, 단....
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프로토콜
1. 온도 및 OP50 대 HT115의 표준 성장 조건
- 표준 성장 및 확장
- LB(표 1)에서OP50의 배양물을 성장시키고 주변 온도(~22-25°C)에서 24-48시간 동안 이에 상응하는 매체를 선택한다. OP50은 우라실 보조트로프로서 실온에서 박테리아를 성장시키고 37°C에서 재배할 때 역류제(예를 들어, 억제기 돌연변이체)의 발생률이 더 높다. OP50 배양물의 장기 보관은 권장되지 않습니다(최대 1주~4°C).
- 포화 OP50 배양액의 ~100-200 μL을 60 mm NGM 플레이트 상에 종자(표1)에하여 웜의 유지및 포화 OP50 배양물의 1 mL을 실험을 위해 동물을 팽창시키기 위한 100 mm 플레이트 상에.
- 접시를 벤치탑에서 밤새 말리게 합니다.
참고: 100mm 플레이트는 특히 통풍이 되지 않는 플레이트를 사용하는 경우 건조하는 데 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 모든 C. 예쁜꼬마선충 플레이트를 4°C에 보관된 밀폐 용기에 보관하십시오. 플레이트의 건조가 발생하기 때문에 6 개월 이상 된 판을 사용하지 마십시오, 이는 다른 삼투압과 플레이트의 강성으로 인해 플레이트에 동물 생리학을 변경합니다. - 표준....
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결과
전사 리포터를 사용하여 스트레스 반응 의 활성화를 측정
여기에서, 형광 전사 기자는 C. elegans에있는 대부분의 긴장 반응의 활성화를 측정하는 강력한 공구로 봉사하는 이용됩니다. GFP 발현은 구획별 응력에 반응하는 데 관여하는 마스터 전사 조절제의 정식 표적의 프로모터에 의해 구동된다. 일반적으로 사용되는 전사 기자의 포괄적인 목록은 표 3에서확인할 수 있습니다.
전개 되거나 잘못 접힌 단백질 또는 지질 이중층 스트레스를 통해 ER 항상성을 교란하면 ER(UPRER)의전개된 단백질 반응의 활성화를 일으켜 ER 의 품질 및 기능을 회복시킨다. UPRER은 막간 센서에 의해 정의된 3개의 별개의 가지로 구성되어 있습니다: 이노시톨 요구 단백.......
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토론
여기서, C. elegans에서세포 스트레스 반응을 심문하는 방법, 형광 전사 리포터 및 생리적 스트레스 생존 측정법을 사용하여 설명된다. 기자들은 모두 세포 스트레스 반응 장착에 관여하는 전사 인자의 다운스트림 전사 표적의 프로모터 하에 구동되는 GFP 발현을 이용한다. hsp-4p의 사용 ::GFP는 XBP-1s 매개 UPRER에의해 변조, hsp-6p ::GFP ATFS-1 중재 UPRMT에의해 제어, GST-4p::GFP SKN-1 중재 OxSR에서, hsp16.2p::GFP 및 hsp-70p::HSF-1 매개 열 충격 응답에서 GFP설명. 다른 표준화된 전사 기자는 표 3에서찾을 수 있습니다. 여기에 제시된 모든 전사 기자는 넓은 동적 범위를 가지고 있으며 유전 적 교란 또는 스트레스 유발 화학 물질에 대한 노출을 통해 스트레스를 적용하여 강력하게 활성화 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
R.BZ. EMBO 장기 펠로우십과 래리 L. 힐블롬 재단의 지원을 받고 있습니다. R.H.S는 국립 노화 연구소 (NIA)와 의학 연구 박사 후 펠로우십을위한 글렌 재단을 통해 보조금 5F32AG032023-02에 의해 지원됩니다. A.F.는 NIA를 통해 F32AG051355를 지원합니다. 에이치케이지는 국립과학재단 대학원 연구동호회 프로그램을 통해 DGE1752814를 지원하고 있습니다. M.G.M.은 NIA를 통해 1F31AG060660-01에 의해 지원됩니다. A.D.는 토마스와 스테이시 시벨 재단, 하워드 휴즈 의학 연구소, 4R01AG042679-04 및 NIA의 5R01AG055891-02, 그리고 NIEHS의 5R01ES021667-09에 의해 지원됩니다. 래리 조, 멜리사 산체스, 나메 켈렛, 아넬 에스퀴벨에게 상당한 기술적 지원을 부탁드립니다. 우리는 모리모토 연구소와 CGC (연구 인프라 프로그램 P40 OD010440의 NIH 사무실에 의해 투자) 균주에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 안티마이신 A | 미토콘드리아 스트레스에 대한 | 시그마-알드리치 | A8674 |
| NGM 플레이트에 대한 | Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 |
| NGM 플레이트에 대한 | BD Difco 과립 한천 | VWR | 90000-782 |
| 플레이트에 대한 | 칼슘 이수화물 | VWR | 97061-904 |
| Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | RNAi용 |
| 레스테롤 | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM 플레이트용 |
| COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | 488nm 광원 장착. |
| COPAS 세척 용액 | Union Biometrica | 300-5072-000 | COPAS |
| 칼집 솔루션 | Union Biometrica | 300-5070-100 | COPAS |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | 약물용 용매 |
| IPTG 다이옥산 무함유 | Denville Scientific | CI8280-4 | RNAi |
| LB 육수, Miller | Fisher Scientific | LB | |
| M205FA 스테레오스코프 | Leica | 10450040 Leica DFC3000G 단색 CCD 카메라, 표준 Leica GFP 필터(예: 395-455, EM 480 LP) 및 NGM | |
| 플레이트용 | 황산마그네슘 헵타하이드레이트 | VWR | EM-MX0070-3 |
| 산화/미토콘드리아 스트레스용 | 파라콰트 | Sigma-Aldrich | 36541 |
| 칼 | Fisher | P217-500 | 표백제용 soluton |
| 인산칼륨 이염기 | 성 VWR | EM-PX1570-2 | NGM 플레이트용 |
| 인산칼륨 일염기 | 성 VWR | EM-PX1565-5 | Olympus |
| 4x Plan Fluorite NA 0.13 대물 렌즈, 표준 Olympus FITC 필터(ex 470/40; em 525/50; DM 560), 카메라 및 ECHO 소프트웨어 | |||
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | 이미징용 |
| NGM 플레이트용 | Millipore | SX0420-5 | |
| 인산나트륨 이염기성 | VWR | 71003-472 | |
| 산화 스트레스 | |||
| 용 Sigma-Aldrich 458139 | RNAi | 시그마-알드리치 | T7660-5G |
| 응급실 스트레스용 | 시그마-알드리치 | T7765-50MG |
참고문헌
- Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
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재인쇄 및 허가
