골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

요약

여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.

초록

줄무늬 근육 세포는 인간과 동물의 활동에 필수적입니다. 단일 근육 섬유는 근육에서 가장 작은 수축 단위인 직렬로 연결된 사마페로 구성된 myofibrils로 구성됩니다. 육종 장애는 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 있는 돌연변이를 가진 환자에 있는 근육 약점에 기여합니다. myofibril 역학의 연구는 단일 근육 섬유의 수축도 측정 할 때 손상, 인접한 myofibrils의 잠재적 인 혼란 효과없이 액틴 - myosin 상호 작용의 평가를 할 수 있습니다. 근비릴의 초구조적 손상과 정렬 불량은 손상된 수축에 기여할 수 있습니다. 구조적 손상이 myofibrils에 존재하는 경우, 격리 절차 중 또는 실험 중에 파손 될 가능성이 있습니다. 또한, 근시릴의 연구는 사메메레스의 기하학적 제약이 있는 액틴-미오신 상호작용의 평가를 제공한다. 예를 들면, myofibrils에 있는 측정은 근시릴라 기능 장애가 육종 단백질에 있는 돌연변이의 1 차적인 효력인지 를 해명할 수 있습니다. 또한, 칼슘 솔루션 또는 화합물이 있는 관류는 근시릴의 작은 직경으로 인해 거의 즉각적이다. 이것은 myofibrils가 힘 생산 도중 활성화 그리고 이완의 비율을 측정하기 위하여 탁월하게 적합하게 만듭니다. 이 논문에 설명된 프로토콜은 압전 길이 모터와 빠른 단계 의 관류 시스템에 결합된 나노 뉴턴 범위에서 힘을 측정할 수 있는 Fabry-Pérot 간섭계의 원리에 기초하여 광학 력 프로브를 사용합니다. 이 설정을 통해 고해상도 힘 측정을 통해 myofibril 역학을 연구할 수 있습니다.

서론

줄무늬 근육 세포는 일상 생활 활동에 필수적입니다. 사지 운동, 호흡 기능 및 심장의 펌핑 운동은 근육 세포에 의해 생성 된 힘에 의존한다. 골격 근은 단일 근육 섬유의 번들을 포함하는 근육 매심으로 구성됩니다(그림 1A). 이러한 근육 섬유는 직렬로 연결된 사코머(그림1B,D)에의해 형성되는 근시브릴로 구성됩니다. 사혜성에는 얇고 두꺼운 필라멘트가 들어 있습니다. 이들은 주로 액틴과 미오신 분자의 사슬로 구성되며, 각각(도 1B). 액틴-미신 상호 작용은 근육의 힘 생성 능력에 대한 책임이 있습니다. 성운, 액틴 및 트로포닌 T와 같은 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이가있는 환자는 수축 기능 장애^1로인한 근육 약화로 고통받고 있습니다.

근육 수축의 품질 조직의 다양 한 수준에서 공부할 수 있습니다., 생체 전체 근육에서 체 외 운동 성 애사에서 actin-myosin 상호 작용에 이르기까지. 지난 수십 년 동안, 몇몇^,연구 단은 개별 myofibrils^,,....

프로토콜

인간 생검을 얻기 위한 프로토콜은 VU 대학 의료 센터 (#2014/396)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며, 서면 통보 된 동의는 과목에서 얻어졌다. 동물 근육 생검을 얻기위한 프로토콜은 VU 대학의 지역 동물 윤리위원회 (AVD11400202016501)에 의해 승인되었습니다.

1. 준비 및 마이오비브릴 격리

참고: 이전에 설명된 방법을 사용하여 생검을 글리세리네이트하고, 다른 칼슘 농도(pCa) 용액^77,16,17을준비하고, 근시^{2,18을분리한다.,}

1. -80°C에 저장되는 릴렉스(pCa 9.0, Rx) 및 활성화(pCa 4.5, Act) 용액뿐만 아니라 억제제(1M E64, 1M DTT, 1M leupeptin, 1 M PMSF)를 해동한다.
2. 약 1mm^3의 글리세라이트 근육 생검을 가져 와서 1:1 Rx /글리세롤 (v /v) 용액으로 작은 페트리 접시에 놓고....

결과

데이터 추적은 시스템 컨트롤러 소프트웨어로 기록되고 열렸습니다(재료 표참조). 전체 추적 또는 선택한 세그먼트는 원하는 소프트웨어로 추가 분석을 위해 클립보드 또는 텍스트 파일로 내보냈습니다. 다양한 솔루션의 흐름을 제어하는 밸브는 사용자 지정 소프트웨어 또는 수동으로 전환되었습니다. 사용자 지정 MATLAB 스크립트는 활성화 속도 분석하는 데 사용되었습니다, 긴장 재개발, 및 휴식. 수동력 실험의 최대 활성력과 피크 및 고원력은 시스템 컨트롤러 소프트웨어 힘 추적으로부터 직접 촬영하였다. 마이오피브릴(도2)을장착한 후 원하는 프로토콜을 선택했습니다.

최대 활성 력과 칼슘-마우스와 인간의 골격 근육 생검에서 분리 된 근안의 힘의 감도
도 4A에서 활성 힘 실험에 사용되는 실험 용.......

토론

설명된 것은 인간 또는 동물 골격 근 조직으로부터 분리된 myofibrils의 수축 기능을 평가하는 프로토콜입니다. 이 설정의 힘 해상도는 Chavan 외^12에의해 이전에 설명되었습니다. 요컨대, 검출 섬유와 캔틸레버 사이에 형성된 파브리-페로 캐비티의 길이의 임의변동에 의해 결정되며, 이는 판독값(V로 발현됨)의 출력에서 소음의 지배적인 부분을 생성하며, 편향 감도(m/V로 표현)와 캔틸레버의 스프링 상수(N/m로 표현됨)에 의해 배합하여 배분하게하여 잡음(N/m으로 표현됨)을 제공한다. 우리의 설정의 경우, 판독값의 출력시 공기 중의 루트 평균 정사각형(rms) 노이즈는 1,000개의 데이터 포인트/s(샘플/s)로 샘플링되어 약 2mV입니다. 일반적인 myofibril 측정의 경우, ferrule-top 프로브는 ~0.7 N/m의 스프링 상수(편향 감도 300 nm/V)와 함께 사용됩니다. 이 rms 값은 0.6nm의 캔틸레버 편향 해상도에 해당하며, 이는 ~0.37 nN의 힘 감도.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
바이오 사양 제품, Inc.	985370-XL	근섬유
사용자 정의 코딩		Matlab
사용자 정의 제작		직렬 연결을 제어하는 Labview 프로그램이 포함되어 있습니다. 밸브
맞춤형 제작		펠티에 모듈을
맞춤형 제작
		맞춤형 알루미늄 조직 챔버
맞춤형 제작		밸브를 제어하기 위해; USB
IonOptix		: 피에조 및 패스트 스텝
IonOptix	MCS100	IonOptix
		포함합니다: Optiforce(간섭계), Micromanipulators, 신호 인터페이스, Piezo 모터 및 컨트롤러. MyoStretcher
IonOptix		Force 프로브
Koolance	ADT-EX004S
Koolance	EX2-755	기반 펠티에 모듈
Microsoft		데이터 등록
올림푸스	IX71
올림푸스	TH4-200
시그마-알드리치	529265	폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트); 조직의 고착을 방지하기 위한 현미경 슬라이드 코팅
	TE-63-1.0-1.3	조직 유동 챔버
TE Technology, Inc.	TC-720	에는 USB
Tecan Trading AG	20736652
Tecan Trading AG	20739263	주사기 펌프를 제어하여 빠른 단계 관류 시스템과 함께 배경 흐름을 유도하는 PC 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 조직 유동 챔버
Thermo scientific	2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)	단종된	대안: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)	TG150-4	조직을
		IonWizard용 PC 1대, 기타 소프트웨어

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