방법 논문

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

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DOI:

10.3791/61002

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2020년 5월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Department of Kinesiology and Physical Education, Faculty of Education, McGill University, 3IONOptix BV

이 논문에서

요약

여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.

초록

줄무늬 근육 세포는 인간과 동물의 활동에 필수적입니다. 단일 근육 섬유는 근육에서 가장 작은 수축 단위인 직렬로 연결된 사마페로 구성된 myofibrils로 구성됩니다. 육종 장애는 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 있는 돌연변이를 가진 환자에 있는 근육 약점에 기여합니다. myofibril 역학의 연구는 단일 근육 섬유의 수축도 측정 할 때 손상, 인접한 myofibrils의 잠재적 인 혼란 효과없이 액틴 - myosin 상호 작용의 평가를 할 수 있습니다. 근비릴의 초구조적 손상과 정렬 불량은 손상된 수축에 기여할 수 있습니다. 구조적 손상이 myofibrils에 존재하는 경우, 격리 절차 중 또는 실험 중에 파손 될 가능성이 있습니다. 또한, 근시릴의 연구는 사메메레스의 기하학적 제약이 있는 액틴-미오신 상호작용의 평가를 제공한다. 예를 들면, myofibrils에 있는 측정은 근시릴라 기능 장애가 육종 단백질에 있는 돌연변이의 1 차적인 효력인지 를 해명할 수 있습니다. 또한, 칼슘 솔루션 또는 화합물이 있는 관류는 근시릴의 작은 직경으로 인해 거의 즉각적이다. 이것은 myofibrils가 힘 생산 도중 활성화 그리고 이완의 비율을 측정하기 위하여 탁월하게 적합하게 만듭니다. 이 논문에 설명된 프로토콜은 압전 길이 모터와 빠른 단계 의 관류 시스템에 결합된 나노 뉴턴 범위에서 힘을 측정할 수 있는 Fabry-Pérot 간섭계의 원리에 기초하여 광학 력 프로브를 사용합니다. 이 설정을 통해 고해상도 힘 측정을 통해 myofibril 역학을 연구할 수 있습니다.

서론

줄무늬 근육 세포는 일상 생활 활동에 필수적입니다. 사지 운동, 호흡 기능 및 심장의 펌핑 운동은 근육 세포에 의해 생성 된 힘에 의존한다. 골격 근은 단일 근육 섬유의 번들을 포함하는 근육 매심으로 구성됩니다(그림 1A). 이러한 근육 섬유는 직렬로 연결된 사코머(그림1B,D)에의해 형성되는 근시브릴로 구성됩니다. 사혜성에는 얇고 두꺼운 필라멘트가 들어 있습니다. 이들은 주로 액틴과 미오신 분자의 사슬로 구성되며, 각각(도 1B). 액틴-미신 상호 작용은 근육의 힘 생성 능력에 대한 책임이 있습니다. 성운, 액틴 및 트로포닌 T와 같은 육종 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이가있는 환자는 수축 기능 장애1로인한 근육 약화로 고통받고 있습니다.

근육 수축의 품질 조직의 다양 한 수준에서 공부할 수 있습니다., 생체 전체 근육에서 체 외 운동 성 애사에서 actin-myosin 상호 작용에 이르기까지. 지난 수십 년 동안, 몇몇,연구 단은 개별 myofibrils,,2,3,4,45,,5,6,7,8,9,10의수축을 결정하기 위하여 설치를개발했습니다. 이러한 설정은 근시릴의 수축에 의해 유발된 캔틸레버(즉, 광학 빔 편향)로부터 레이저 편향의 변화를 검출하는 데 기초한다(자세한 내용은 라부다 외11참조). 근시 의 수축 기능을 결정하는 데는 몇 가지 한계가 있지만 (예를 들어, 근시 의 상류인 흥분 수축 커플링 프로세스의 역학이 부족함), 이 접근법에는 여러 가지 장점이 있습니다. 여기에는 사메메레스의 기하학적 제약이 있는 경우 액틴-미오신 상호작용을 평가하는 능력; 2) 손상된, 인접한 근막의 잠재적 인 혼동 효과없이 액틴 - 미오신 상호 작용을 평가 할 수있는 능력 (단일 근육 섬유의 수축을 측정 할 때 초구조적 손상과 myofibrils의 정렬 불량에 기여할 수 있음)(그림 1D); 3) 근시 (~1 μm, 도 2A)의작은 직경과 멤브레인의 부족은 사마페에 거의 즉각적인 칼슘 확산을 허용한다. 더욱이, 구조적 손상이 myofibrils에 존재하는 경우에, 그(것)들은 확률이 그들의 격리 도중 또는 실험 도중 끊어질 것입니다. 따라서, myofibril 수축을 평가하는 것은 근육 수축의 기본 기계장치를 공부하고 방해된 액틴-미신 상호 작용이 육종 단백질에 있는 돌연변이에 기인한 근육 질병의 주요 원인인지 이해하는 우아한 방법입니다.

이 프로토콜은 나노 뉴턴 해상도 (즉, Optiforce)와 캔틸레버 힘 프로브를 통합 근시 릴의 수축을 결정하기 위해 새로 개발 된 설정을 제공합니다. 이 힘 프로브는 간섭법의 원리를 기반으로 합니다. 간섭측정을 통해 비교적 딱딱한 캔틸레버를 사용할 수 있습니다. 이를 통해 칸틸레버의 편향이 거의 없는 힘을 측정하여 근시 브릴리브릴의 이소메트릭 수축에 접근할 수 있습니다. 프로브는 높은 신호 대 잡음 비율로, 인간 과목에서 그 를 포함하여 다른 근육 생검에서 격리 된 단일 근시릴에 의해 생성 되는 낮은 수동 및 활성 힘의 평가에 대 한 수 있습니다. 이 설정에 통합된 광학 캔틸레버 힘 프로브는 Fabry-Pérot 간섭계12를기반으로 합니다. 간섭계는 발효에 장착된 광섬유와 금코팅 캔틸레버 사이의 작은 변위를 감지합니다(그림3). 광섬유와 캔틸레버 사이의 간격을 파브리 페로 캐비티라고 합니다. Myofibrils는 두 개의 접착제 코팅 유리 장착 섬유를 사용하여 프로브와 압착 모터 사이에 장착됩니다. 근시브릴에 의해 생성된 힘은 간섭계 데이터로부터 수학적으로 도출될 수 있다. 간섭측정은 두 개 이상의 파도의 중첩 또는 간섭을 기반으로 합니다(이 설정에서 세 개의 광파). 1,528.77-1,563.85 nm 사이의 파장을 가진 레이저 광은 간섭계에서 방출되고 광섬유를 통해 전송됩니다. 프로브에서 광섬유와 배지 사이의 인터페이스에서 빛이 1) 반사된다(도3A); 2) 매체와 캔틸레버의 인터페이스에서(도 3B); 및 3) 캔틸레버의 금속과 금 코팅 사이의 인터페이스에서(도 3C). 인터페이스 A 및 B의 반사는 프로브가 침수되는 매체의 굴절률(n)에 의존한다.n 세 개의 중첩 된 반사로 구성된 빛은 간섭계의 포토다이오드로 돌아갑니다. 포토다이오드는 빛의 강도를 측정하며, 이는 세 개의 중첩된 반사의 간섭 패턴의 결과입니다. 근시릴을 활성화하거나 스트레칭하여 수축력이 생성되면 근시릴이 캔틸레버를 끌어당깁니다. 이 움직임은 캐비티크기(d)를 변경하고 결과적으로 캐비티에 맞는 파장의 수를 변경합니다. 캔틸레버에 반사되는 빛은 다른 위상을 가지며, 그 결과 다른 간섭 패턴이 생성됩니다. 포토디오드는 볼트의 변화로 간섭 패턴 강도의 변화를 기록합니다. 그 후, myofibril 힘 생성은 이 변경에서 계산됩니다, 고려 캔틸레버 강성을 고려. 포스 프로브는 제조업체에 의해 보정되며, 캔틸레버의 자유 전달 끝에 부착된 마운팅 바늘의 끝을 밀어내고, 계량 스케일에 대해, 캔틸레버의 굽힘은 레아웃레이저(13)의파장의 배수와 동일하게 유지한다. 따라서 간섭법은 거리의 작은 변화를 감지하여 나노 뉴턴 분해능으로 힘을 측정할 수 있는 매우 민감한 방법입니다. 이 해상도를 통해 높은 신호 대 잡음 비율로 myofibrillar 힘 생산을 평가할 수 있습니다. 기존의 간섭 측정은 간섭 곡선의 선형 부분으로 측정 범위를 제한하지만, 레이저 파장의 잠금 증폭기 및 변조를 사용하여 이한계(14)를극복한다. 이 내용은 토론 섹션에서 보다 자세히 설명되어 있습니다.

myofibril 활성 장력을 측정하기 위해, 빠른 단계 관혈 시스템이 통합되어 myofibril을 칼슘 용액(그림4A)에노출시켰다. 빠른 단계 관류 시스템을 통해 10ms 이내에 솔루션 변경이 가능합니다. 직경이 작기 때문에 근비릴로 칼슘 확산이 거의 즉각적입니다. 따라서, 이 시스템은 활성화 및 휴식 중에 방출하는 동안 액틴-미오신 결합의 비율을 측정하는 데 특히 적합하다. 활성화(kACT)및 이완(kREL)의속도는 활성화-이완 곡선으로부터 결정될 수 있다. 또한, 농도가 증가하는 칼슘 용액에 myofibrils를 노출시킴으로써, 힘-칼슘 관계 및 칼슘 민감성을 결정할 수 있다.

또한, 압전 길이 모터는 myofibril의 빠른 스트레칭과 단축을 가능하게합니다. 이는 근시의 점탄성 특성(즉, 수동장력)을 연구할 수 있을 뿐만 아니라, 미오피브릴의 급속한 단축 및 재스트레칭을 수행하여 장력 재개발(kTR)의속도를 결정할 수 있는 가능성을 제공한다. 활성 및 수동 장력 실험모두에서 회수된 파라미터는 육종 단백질의 유전자 돌연변이에 의해 변경될 수 있다.

이 맞춤형 설정은 건강한 인간, 환자 및 마우스 골격 근육으로부터 분리된 myofibrils의 활성 및 수동 수축 특성을 측정하는 데 사용되었습니다.

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프로토콜

인간 생검을 얻기 위한 프로토콜은 VU 대학 의료 센터 (#2014/396)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며, 서면 통보 된 동의는 과목에서 얻어졌다. 동물 근육 생검을 얻기위한 프로토콜은 VU 대학의 지역 동물 윤리위원회 (AVD11400202016501)에 의해 승인되었습니다.

1. 준비 및 마이오비브릴 격리

참고: 이전에 설명된 방법을 사용하여 생검을 글리세리네이트하고, 다른 칼슘 농도(pCa) 용액77,16,17을준비하고, 근시2,18을분리한다.,

  1. -80°C에 저장되는 릴렉스(pCa 9.0, Rx) 및 활성화(pCa 4.5, Act) 용액뿐만 아니라 억제제(1M E64, 1M DTT, 1M leupeptin, 1 M PMSF)를 해동한다.
  2. 약 1mm3의 글리세라이트 근육 생검을 가져 와서 1:1 Rx /글리세롤 (v /v) 용액으로 작은 페트리 접시에 놓고 페트리 접시를 4 ° C의 냉판에 놓습니다.
  3. 해부 현미경과 집게를 사용하여 근육의 조각을 해부, 근육의 조각에서 그들을 격리하지 않고 단일 근육 섬유를 분리.
    참고: myofibril 현탁액의 오염을 방지하기 위해 가능한 한 많은 지방 및 결합 조직을 제거하십시오.
  4. 해부된 조직의 조각을 1.5mL의 릴렉스 용액(1 μL/mL E-64, 1 μL/mL/mL leupeptin, 1 μL/mL DTT 및 125 μL/mL PMSF)을 사용하여 5mL 튜브로 이송합니다. 조직이 약 4 °C에서 1 h로 템퍼되도록 하십시오.
  5. 인큐베이션 하는 동안 두 PC를 부팅 하 고 장치를 켜고 관련 소프트웨어를 엽니다 (재료표참조).
  6. 페트리 접시에 초순수 수에 힘 프로브를 잠그고 프로브를 보정합니다.
    1. 간섭계에서'시작 마법사'를누르고 화면 지침을 따릅니다. 교정을누르면 현미경 단계를 누릅니다.
      참고 : 현미경 단계를 탭하면 캔틸레버가 변두리를 편향시키고 통과하게됩니다. 이렇게 하면 프로브를 교정할 수 있습니다.
    2. 보정 후 페트리 접시에 초순수물에 잠긴 프로브를 둡니다.
  7. 압착 모터 위치를 초기화합니다. 이렇게 하려면 아래에 설명된 단계 중 하나를 따르십시오.
    1. 압전 모터가 kTR 장력에 사용될 때 길이를 0μm로 설정합니다.
      신호 발생기 설정은 표 1, 그림 5A에서찾을 수 있습니다.
    2. 압압 모터가 수동 장력에 사용될 때 길이를 50 μm로 설정합니다.
      신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다.
      참고: 단계의 차이는 압전 길이 모터의 초기 위치입니다. 근시브릴을 스트레칭하기 위해, 압제 모터는 장착 바늘 사이의 거리를 증가시키고 myofibril을 길게하기 위해 당겨야합니다. 근시브릴을 느슨하게하기 위해, 압제 모터는 장착 바늘 사이의 거리를 줄이고 myofibril을 단축하기 위해 밀어해야합니다.
  8. 현미경 슬라이드를 준비합니다. 피펫 150 μL 폴리 하이드록시틸메트하크레이트(poly-HEMA) 용액(5% 폴리-HEMA 95% 에탄올, w/v)을 현미경 슬라이드에 분산하여 모든 것이 커버되도록 합니다.
    참고: 외투되지 않은 현미경 슬라이드에서 myofibril 서스펜션이 파이프로 고정되면 바닥에 가라앉는 myofibrils가 현미경 슬라이드에 달라 붙어 접착제를 붙일 수 없습니다.
  9. pCa 솔루션으로 주사기를 채우고(그림 4A참조) 관류 시스템을 프라임합니다.
    참고: 이러한 단계에서 모든 튜브는 모든 기포가 튜브에서 제거되었는지 확인하기 위한 적절한 솔루션으로 미리 채워져 있습니다.
    1. 유동 챔버 배경 흐름의 유입 튜브를 채우면(그림3, 4A)유입을 Rx로 채웁니다.
    2. 사용 시, 공기를 제거하기 위해 초순수물로 매니폴드를 플러시하십시오. 이렇게하려면 주사기를 초순수 물과 콘센트에 연결하고 역 방향으로 씻어 내도록 합니다. 매니폴드의 사용되지 않는 포트를 차단합니다.
    3. 각 pCa 주사기를 사용하여 각 튜브를 pCa 솔루션으로 채웁니다. 그런 다음 매니폴드와 Ɵ 유리에 연결합니다.
    4. 데이터 수집 패널 소프트웨어가 있는 오픈 밸브 1 과 6(재료 표참조)을 확인하여 버튼'1+6'(그림6A)을확인하여 Ɵ 유리를 이완(pCa 9.0)으로 채우고 ƟFigure 6B유리가 채워질 때 밸브를 활성화(4.5)한다.

2. 마이오비브릴 장착

  1. 현미경 슬라이드를 폴리 HEMA로 코팅하여 myofibrils가 유리에 달라 붙는 것을 방지합니다.
  2. 균질화에 대한 균질화 (재료의 표참조)를 준비합니다. 깨끗한 티슈 페이퍼로 내부 로터 로드를 청소하고, 균질화제를 조립하고, 15초 동안 1x를 알코올과 세 번째로 초순수수로 돌보세요. 얼음 에 15 s에 대한 편안한 솔루션 1 x에서 균질화제를 prerinse.
  3. 1.4 단계에서 설명된 바와 같이 근육 조직을 함유하는 튜브에 균질화 막대를 놓고, 튜브를 얼음에 유지하면서, 로터를 5번 속도로 회전하여 근육 조직을 찢고 근시현 액수액을 얻습니다.
  4. 피펫 ~50 μL 의 myofibril 현탁액및 티슈 목욕에 폴리 HEMA로 코팅 된 현미경 슬라이드에 이완 용액의 ~250 μL. 이것은 액체 방울을 형성합니다. 먼지로부터 보호하기 위해 뚜껑으로 목욕을 덮고 5-10 분 기다린 후 myofibrils가 바닥으로 가라 앉을 수 있도록하십시오.
    참고: 서스펜션과 이완 솔루션 사이의 비율은 격리의 품질에 따라 달라지므로 그에 따라 조정합니다. 예를 들어, 미오피브릴 수율이 낮고 현탁액에 적합한 근시릴이 거의 없는 경우, 미오피릴 서스펜션을 더 추가하고 덜 편안한 용액(예: 미오피릴 서스펜션의 75 μL 및 이완용액의 225 μL)으로 희석한다. 심장과 골격 근육 조직은 그 줄무늬 패턴때문에 쉽게 인식할 수 있습니다. 10배 또는 40배 의 목표를 사용하여 이 패턴은 단일 myofibril에서도 볼 수 있습니다. 다른 조직이 현탁액에 존재하는 경우, myofibrils는 시각적으로 선택될 수 있다. 5-10분 대기를 건너뛸 수 있습니다. 그러나, 이것은 myofibril를 접착의 어려움을 증가시킵니다.
  5. 접착제를 가진 코팅 장착 바늘 (셸락 + 에탄올; 120 mg 쉘락2 mL에서 70% 에탄올). 이렇게하려면 접착제를 65 °C에서 30-60 s로 가열하고 파이펫 ~ 6 μL을 새로운 코팅되지 않은 유리 슬라이드에 가열합니다. 각 장착 바늘의 끝을 접착제에 담그고 접착제 층이 보일 때까지 반복합니다. 현미경 단계에 조직 목욕을 배치 할 수있는 공간을 만들기 위해 마이크로 조작기로 프로브와 압소를 수직으로 이동합니다. 접착제가 들어 있는 유리 슬라이드를 제거합니다.
  6. 미오미브릴 장착
    1. 현미경 단계에 myofibril 현탁액을 포함하는 폴리 HEMA로 코팅 된 현미경 슬라이드로 조직 목욕을 놓습니다. 스테이지를 사용하여 40배 의 목표를 가진 적합한 myofibril을 찾으십시오. 필요한 경우, 이동 및 장착 가능한 위치로 myofibril을 이동하기 위해 조직 목욕을 회전.
      참고: 약 30μm 길이의 눈에 보이는 트트리션 패턴이 있는 myofibrils를 찾습니다. 3.1 및 3.2.1 단계에서 자세히 설명한 바와 같이 근시릴을 접착하기 전에 길이와 사카머 길이를 확인할 수 있다. 이 수축 하는 동안 휴식 가능성이 있기 때문에, 찢어진 myofibrils 접착제 하지 마십시오.
    2. 유동 챔버를 티슈 욕조의 myofibrils를 함유한 액체 낙하 바로 위에 밀어 넣은 다음(2.4단계에서 슬라이드에 파이펫)하고 하강한다. 액체 방울에 닿기 전에 멈춥춥습니다.
    3. 압전 장착 바늘을 낮추고 근시릴의 하단 끝에 누릅니다. 약간 들어 올려 서 myofibril 바늘에 연결 되어 있는지 확인 합니다.
    4. 프로브의 장착 바늘이 유동 챔버를 만지지 않고 바닥에 도달할 수 있을 만큼 유동 챔버를 낮춥다.
    5. 미오피브릴 의 상단 끝에 있는 프로브의 장착 바늘을 누릅니다. 약간 들어 올려 서 myofibril 바늘에 연결 되어 있는지 확인 합니다.
    6. 유리 의 바닥을 만지지 않고 초점을 맞출 수있는 능력을 잃지 않고 가능한 한 목욕의 바닥에서 myofibril을 들어 올립니다.

3. 실험 초기화

  1. 마이크로 조작기, 카메라 및 시스템 컨트롤러소프트웨어(그림 7A, 재료 표참조)를 사용하여 사컴레 길이를 측정합니다. 압착 및/또는 힘 프로브를 이동하여 근시브릴의 초기 사혜성 길이를 2.5 μm로 설정합니다.
    참고: 2.5 μm의 사컴레 길이는 미오신 헤드와 액틴 사이의 최적의 중첩을 보장합니다.
  2. 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 선박 기능을 사용하여 미오피브릴 길이와폭(도 7B,C)을측정합니다.
    참고: 카메라를 회전할 때 수평 및/또는 세로로 기울어질 수 있습니다. 카메라의 정렬을 확인하려면 정신 레벨을 사용하여 카메라가 회전하고 기울어지지 않았는지 확인할 수 있습니다.
    1. 현미경 단계를 사용하여 비디오 이미지의 중심에 myofibril을 배치합니다.
    2. 마이오비브릴의 한쪽에서 다른 쪽으로 정사각형을 그립니다. 길이의 경우 이미지 처리가 대비를 기반으로 하기 때문에 접착제방울(도 2A)의어두운 가장자리를 사각형에 포함해야 합니다.
    3. 시스템 컨트롤러 소프트웨어(재료 표 참조)에서데이터 녹화를시작하고5초 후'일시 중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어 데이터 기록을 일시 중지합니다. 길이가 이제 데이터에 기록됩니다.
    4. 너비의 경우 먼저 카메라를 90° 회전(재료 표참조)한 다음 myofibril 자체의 가장자리의 대비를 사용합니다.
    5. 시스템 컨트롤러 소프트웨어(재료 표 참조)에서데이터 녹화를시작하고5초 후'일시 중지' 버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어 데이터 기록을 일시 중지합니다. 이제 너비가 데이터에 기록됩니다.
  3. myofibril의 활성 장력을 결정해야 하는 경우 관류 설정을 사용해야 합니다. 그렇다면 3.4단계를 계속합니다. 수동 장력만 결정되면 3.4-4.1.3.7 단계를 건너뛰고 4.2단계에서 계속하십시오.
  4. 포루서셋 설정을 배치하고 초기화합니다.
    참고: 이것은 활성 력의 생성에만 필요합니다. 수동 장력 실험을 수행할 때 4.2 단계를 계속합니다.
    1. 4V(그림5B)로빠른 스텝 모터 위치를 설정합니다.
    2. 테이블에 퍼퓨전 스탠드를 밀어 스탠드의 왼쪽 하단 모서리를 테이블의 테이프와 정렬합니다.
      참고: 힘 프로브 나 압제 모터에 충돌하지 않도록주의하십시오.
    3. 조작기를 사용하여 Ɵ 유리를 눈으로 대략 배치합니다.
    4. 접안렌즈를 살펴보고 Ɵ 유리를 조작기로 미오피릴쪽으로 조심스럽게 이동합니다.
    5. Ɵ 유리의 상단 채널을 조작기를 사용하여 myofibril과 정렬하고 시스템 컨트롤러소프트웨어(도 2B–C, 재료 표참조)와 빠른 단계(신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있음)를 수행하여 위치를 확인합니다.
      참고: 맨 아래 채널이 빠른 단계(그림2B–C)의활성화 단계에서 myofibril과 정렬되는지 확인합니다.Figure 2B
  5. Rx(도4A)의배경 흐름을 켜서 유동 챔버에서 라미나르 배경 흐름을 만듭니다.
    참고: Ɵ 유리에서 pCa 솔루션 흐름의 결과로 난류 흐름을 방지하기 위해 배경 흐름이 필요합니다.
    1. Luer 밸브 레버로 유동 챔버의 유입을 켭니다.
      1. 유동 챔버배수를 시작하고 유동 챔버의 범람을 방지하기 위해 유출 펌프에 다음 매개 변수를 보내(도 9):밸브 = 목욕 밸브 (2); 마이크로스텝 모드 = 마이크로; 플런저 대상 = 48,000; 플런저 속도 = 38-40 (임의).
        참고: 유체 수준이 항상 안정되어 있는지 확인합니다. myofibril 건조 실행 안 하 고 어느 쪽도 캔틸레버 하지 않아야. 너무 적은 흐름보다 약간의 오버플로를 하는 것이 좋습니다.
  6. 온도 조절기(그림8, 재료표참조)를 사용하여 원하는 값으로 온도를 설정하려면 원하는 온도를 입력하고'시작'을 누릅니다. 열전 온도 컨트롤러 소프트웨어에서 그래프를 확인하여 원하는 온도에 도달할 때까지 기다렸다가 계속하십시오.
    참고: 실온에서 실험을 수행할 때 열전 온도 컨트롤러를 사용할 필요가 없습니다.

4. 실험 프로토콜

  1. 수행할 활성 힘 프로토콜을 결정합니다.
    참고: 연구에 필요한 데이터에 따라 여러 유형의 활성 힘 실험을 수행할 수 있습니다: 단계 4.1.1, 포화시 최대 힘의 측정 [Ca]2+]; 단계 4.1.2, 단계 4.1.1 이외에 칼슘 감도를 결정하기 위해 포스-pCa 곡선을 획득; 단계 4.1.3, 4.1.1 또는 4.1.2 단계 이외에 단축 재스트레칭 프로토콜을 수행하여 장력 재개발의 속도를 결정한다.
    1. 최대 활성 힘을 측정합니다.
      1. '시작'을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어(재료 표 참조)에서데이터 기록을시작합니다.
      2. 데이터 수집 패널이 있는 오픈 밸브 1과 6(재료 표참조) 소프트웨어는 버튼'1+6'을확인하여 이완 솔루션의 유리 Ɵ 흐름을 시작하고 Ɵ 유리(도6A)를통해 용액을 활성화한다.
      3. 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다(재료 표참조).
      4. 힘 추적이 안정되면 Ɵ 유리 속기 단계(단계 크기 = 100 μm)를 수행합니다.
        신호 발생기 설정은 표 1(그림 5C)에서찾을 수 있습니다. 그림 4D와 유사한 활성화 완화 추적은 시스템 컨트롤러 소프트웨어에 기록되고 표시됩니다.
      5. '일시중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어 데이터 기록을 일시 중지합니다.
      6. 더 이상 활성화가 수행되지 않으면 밸브 1과 6을 닫으면 버튼을 분리하여 Ɵ 유리 흐름을 중지하여'1+6'(그림6B),주사기 펌프를 중지(도 9, 재료의 표참조) 눌러'종료',루어 밸브를 닫음으로써 배경 흐름을 중지합니다.
    2. 포스-pCa 곡선
      참고: 최대 활성 힘을 얻기 위한 4.1.1 단계와 유사하지만 다른 pCa 솔루션을 사용하여 여러 정품 인증이 수행됩니다.
      1. '시작'을눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 데이터 기록을 시작합니다.
      2. 데이터 수집 패널 소프트웨어로 밸브 1과 2를 열어 Ɵ 유리를 통해 편안한 솔루션과 pCa 6.2의 흐름을 시작합니다.
      3. 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다.
      4. 힘 추적이 안정되면 Ɵ 유리 속기 단계(단계 크기 = 100 μm)를 수행합니다.
        신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다.
      5. '일시중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어를 일시 중지합니다.
      6. 밸브 1 및 3 (pCa 5.8), 밸브 1 및 4 (pCa 5.6), 밸브 1 및 5 (pCa 5.4), 밸브 1 및 5 (pCa 5.4), 밸브 1 및 6 (pCa 4.5)용 4.1.2.1-4.1.2.4 단계를 반복하십시오.
      7. 더 이상 활성화가 수행되지 않으면 밸브 1과 6을 닫으면 버튼을 분리하여 Ɵ 유리 흐름을 중지합니다 '1+6'(그림6A),주사기펌프(그림 9)를누르면'종료'를누르면, 루어 밸브를 닫음으로써 배경 흐름을 중지한다.
    3. 장력재개발(kTR)의측정 속도.
      참고: 최대 활성 력의 경우 4.1.1단계와 유사하지만 일부 변경 및 추가 단계가 있습니다.
      1. 근시브레이15%를 느슨하게 하는 데 필요한 압조 움직임을 계산하고 신호 발생기(도5D, 표 1)에이 값을 입력합니다.
      2. '시작'을눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 데이터 기록을 시작합니다.
      3. 데이터 수집패널(그림 6A)소프트웨어가 있는 오픈 밸브 1과 6은 이완 솔루션의 흐름을 시작하고 pCa 4.5는 Ɵ 유리를 통해 진행한다.
      4. 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다.
      5. 힘 추적이 안정되면 Ɵ 유리 속기 단계(단계 크기 = 100 μm)를 수행합니다.
        신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다.
      6. 힘 고원에 도달하면, 압소와 함께 단축 재스트레칭을 수행합니다.
        신호 발생기 설정은(그림 5D, 표 1)에서찾을 수 있습니다. 그림 4E와 유사한 활성화 완화 추적은 시스템 컨트롤러 소프트웨어에 기록되고 표시됩니다.
        참고: 위의 단계를 자동화하기 위해 사용자 지정 프로토콜을 만들 수 있습니다.
      7. '일시중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어를 일시 중지합니다.
      8. 더 이상 활성화가 수행되지 않으면 밸브 1과 6을 닫으면 버튼'1+6'(도6B)을선택 해제하여 Ɵ 유리 흐름을 중지하고, 주사기펌프(그림 9)를누르기 위해'종료'를누르고, 루어 밸브를 닫음으로써 배경 흐름을 중지한다.
  2. 수동 력 측정을 수행합니다.
    1. 연속 스트레칭을 수행합니다.
      1. 근시브릴을 스트레칭하고 신호 발생기(표1)에서이 값을 입력하는 데 필요한 압조 운동을 계산합니다.
        참고: 예제 설정입니다. 사컴레 길이에 비해 스트레치의 양과 스트레치 시간을 계산합니다. 이러한 설정은 사컴레당 스트레치 속도가 근시 브릴전체에 동일하게 유지되도록 하는 데 필요합니다.
      2. '시작'을눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 데이터 기록을 시작합니다.
      3. 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다.
      4. 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 신호 발생기와 함께 연속 스트레칭을 수행하여 압조를 작동시합니다. 예 신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다.
      5. 스트레치가 끝난 후 페조로 길이가 느슨해지는 근시브릴을단축(표 1).
    2. 단계별 스트레칭을 수행합니다.
      1. '시작'을눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 데이터 기록을 시작합니다.
      2. 간섭계에서'리셋 범위'를선택하고 눌러 기준힘이 0V되도록 간섭계의 범위를 재설정합니다.
      3. 시스템 컨트롤러 소프트웨어의 신호 발생기로 단계별 스트레치를 수행하여 압조를 작동시합니다. 예시 신호 생성기 설정은 표 1(그림 5E)에서찾을 수 있습니다.
    3. 스트레치가 끝난 후 페조와 함께 길이가 느슨해지는 근시브릴을 짧게 합니다. 예 신호 생성기 설정은 표 1에서찾을 수 있습니다.
  3. '일시중지'버튼을 눌러 시스템 컨트롤러 소프트웨어를 일시 중지합니다.
  4. 시스템 컨트롤러 소프트웨어의'중지'버튼을 눌러 데이터 기록을 중지합니다.
  5. 시스템 컨트롤러 소프트웨어에'파일'및'저장 데이터'를눌러 데이터를 저장합니다.

5. 청소

  1. 측정된 마이오미브레이를 제거하고 다음 묘비브릴을 준비하십시오.
    1. 이렇게하려면 40배의 목표로 안구를 바라보면서 myofibril을 조심스럽게 찢어 버리면 됩니다.
    2. 힘 프로브와 압전을 위로 이동합니다. Ɵ 유리를 오른쪽으로, 뒤쪽으로 이동합니다. 그런 다음 위로 이동하고 흐름 챔버를 멀리 밀어. 티슈 목욕을 제거합니다.
    3. 장착 바늘을 청소하려면 10x와 안구를 사용하여 초점을 맞춥니다. 브러쉬를 에탄올에 담그고 조심스럽게 닦고 바늘에서 접착제를 제거합니다.
      참고 : 접착제가 벗겨지기까지 시간이 걸릴 수 있음을 명심하십시오.
    4. 유동 챔버와 티슈 목욕을 초순수물로 헹구는 다.
    5. 프로브를 초순수물로 채워진 작은 페트리 접시에 놓습니다. 프로브가 완전히 잠수되었는지 확인합니다.
  2. 실험이 완료되면 위와 같이 설정을 정리하고 다음 추가 단계를 수행합니다.
    1. 흐르는 욕조에서 튜브를 비웁다. 유출 주사기 펌프에 매개 변수를 보냅니다(재료 표, 그림 9참조). 밸브 = 목욕 밸브 (2); 마이크로스텝 모드 = 정상; 플런저 대상 = 0; 플런저 속도 = 30.
      참고: 튜브가 비어 있을 때 명령을 종료합니다.
    2. 펌프를 여러 번 초기화합니다(도9B).
    3. 주사기를 빼내십시오. 이렇게하려면 모든 Luer 밸브를 닫고 모든 밸브를 열고 주사기의 바늘에서 튜브를 제거하고 바늘 아래에 특정 pCa튜브를 잡고 Luer 밸브를 엽니다. 압력 플러그를 사용하여 프로세스 속도를 높일 수 있습니다.
    4. 튜빙을 주사기바늘에 다시 부착합니다. 주사기를 ~ 5mL의 초순수로 채웁니다. 컵을 Ɵ 유리 아래에 놓습니다. 모든 밸브를 열고 압력 밸브를 열어 시스템을 플러시합니다.
    5. 시스템을 종료합니다. PC, 간섭계 및 압착 컨트롤러 전원 블록을 끕니다.

6. 데이터 분석

  1. 데이터 파일을 열고 원하는 세그먼트를 선택하여 시스템 컨트롤러 소프트웨어(재료 표참조)에서 스프레드시트 소프트웨어 프로그램 또는 클립보드로 데이터 추적을 내보냅니다. 표시된 흔적은 내보내집니다(예: 원시 힘, 사코메르 길이 및 압전 위치).
  2. 선택한 소프트웨어(예: MATLAB)로 분석을 수행합니다.

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결과

데이터 추적은 시스템 컨트롤러 소프트웨어로 기록되고 열렸습니다(재료 표참조). 전체 추적 또는 선택한 세그먼트는 원하는 소프트웨어로 추가 분석을 위해 클립보드 또는 텍스트 파일로 내보냈습니다. 다양한 솔루션의 흐름을 제어하는 밸브는 사용자 지정 소프트웨어 또는 수동으로 전환되었습니다. 사용자 지정 MATLAB 스크립트는 활성화 속도 분석하는 데 사용되었습니다, 긴장 재개발, 및 휴식. 수동력 실험의 최대 활성력과 피크 및 고원력은 시스템 컨트롤러 소프트웨어 힘 추적으로부터 직접 촬영하였다. 마이오피브릴(도2)을장착한 후 원하는 프로토콜을 선택했습니다.

최대 활성 력과 칼슘-마우스와 인간의 골격 근육 생검에서 분리 된 근안의 힘의 감도
도 4A에서 활성 힘 실험에 사용되는 실험 용...

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토론

설명된 것은 인간 또는 동물 골격 근 조직으로부터 분리된 myofibrils의 수축 기능을 평가하는 프로토콜입니다. 이 설정의 힘 해상도는 Chavan 외12에의해 이전에 설명되었습니다. 요컨대, 검출 섬유와 캔틸레버 사이에 형성된 파브리-페로 캐비티의 길이의 임의변동에 의해 결정되며, 이는 판독값(V로 발현됨)의 출력에서 소음의 지배적인 부분을 생성하며, 편향 감도(m/V로 표현)와 캔틸레버의 스프링 상수(N/m로 표현됨)에 의해 배합하여 배분하게하여 잡음(N/m으로 표현됨)을 제공한다. 우리의 설정의 경우, 판독값의 출력시 공기 중의 루트 평균 정사각형(rms) 노이즈는 1,000개의 데이터 포인트/s(샘플/s)로 샘플링되어 약 2mV입니다. 일반적인 myofibril 측정의 경우, ferrule-top 프로브는 ~0.7 N/m의 스프링 상수(편향 감도 300 nm/V)와 함께 사용됩니다. 이 rms 값은 0.6nm의 캔틸레버 편향 해상도에 해당하며, 이는 ~0.37 nN의 힘 감도...

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공개 사항

미치엘 헬름스는 IONOptix Inc.의 주주이자 공동 소유주입니다.

감사의 글

이 프로젝트는 AFM-텔레톤과 네말린 근종 요법을위한 재단 건물 강도에 의해 지원되었다. 저자는 이 기사에서 언급 된 제품의 제작자를 인정하고자합니다, IONOptix Inc.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
바이오 사양 제품, Inc.985370-XL근섬유
사용자 정의 코딩Matlab
사용자 정의 제작직렬 연결을 제어하는 Labview 프로그램이 포함되어 있습니다. 밸브
맞춤형 제작펠티에 모듈을
맞춤형 제작
맞춤형 알루미늄 조직 챔버
맞춤형 제작밸브를 제어하기 위해; USB
IonOptix: 피에조 및 패스트 스텝
IonOptixMCS100IonOptix
포함합니다: Optiforce(간섭계), Micromanipulators, 신호 인터페이스, Piezo 모터 및 컨트롤러. MyoStretcher
IonOptixForce 프로브
KoolanceADT-EX004S
KoolanceEX2-755기반 펠티에 모듈
Microsoft데이터 등록
올림푸스IX71
올림푸스TH4-200
시그마-알드리치529265폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트); 조직의 고착을 방지하기 위한 현미경 슬라이드 코팅
TE-63-1.0-1.3조직 유동 챔버
TE Technology, Inc.TC-720에는 USB
Tecan Trading AG20736652
Tecan Trading AG20739263주사기 펌프를 제어하여 빠른 단계 관류 시스템과 함께 배경 흐름을 유도하는 PC 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 조직 유동 챔버
Thermo scientific2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)단종된대안: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)TG150-4조직을
IonWizard용 PC 1대, 기타 소프트웨어
를 분리하려면를 제어하려면냉각시키기 위해 시스템 컨트롤러 소프트웨어를 제어할 수 있는 PC 소프트웨어 포함을 위한 고급 신호 발생기가 있는 데이터 기록 소프트웨어 는 다음을 냉각 Sigma-Aldrich 78471 결정이 에탄올에 용해되어 접착제를 생성함 TE Technology, Inc.냉각용에서 유출 관류하려면 용 PC 1대

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