Method Article

형광 일생 화상 진찰을 사용하여 노화 C. Elegans에 있는 아밀로이드 구조물의 특성화

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

형광 일생 화상 진찰은 생활, 노화 및 응력 C. elegans 질병 모형에 있는 단백질의 집합 경향을 정량화하고 구별합니다.

Abstract

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아밀로이드 섬유소는 헌팅턴병, 파킨슨병 또는 알츠하이머병과 같은 여러 신경 퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 이러한 아밀로이드 섬유소는 단백질 성 세포(PN)의 성분뿐만 아니라 내인성 메타안정 단백질을 격리시킬 수 있으며, 이로 인해 세포에서 단백질오폴딩을 악화시킬 수 있다. 동물 내의 아밀로이드 단백질의 응집 과정을 평가하는 데 사용할 수 있는 도구의 수가 제한되어 있습니다. 우리는 뉴런과 같은 특정 세포에서 아밀로이드 섬유의 정량화뿐만 아니라 모니터링을 허용하는 형광 평생 현미경 검사법 (FLIM)에 대한 프로토콜을 비침습적 방식으로, 노화의 진행과 함께 PN. FLIM은 형광단의 발현 수준과 무관하며 더 이상 염색이나 표백없이 응집 과정을 분석할 수 있습니다. 형광광은 아밀로이드 구조의 가까운 곳에 있을 때 담금질되어 형광 수명이 감소합니다. 담금질은 아밀로이드 단백질의 응집과 직접 관련이 있습니다. FLIM은 비침습적 방식으로 생체 내상에서 상이한 아밀로이드 단백질, 환경 자극 또는 유전적 배경의 섬유화 과정을 비교하기 위해 적용될 수 있는 다목적 기술이다.

Introduction

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단백질 응집은 노화와 질병 모두에서 발생합니다. 큰 아밀로이드 또는 비정질 개재물의 형성 그리고 증착으로 이끌어 내는 통로는 따르기 어렵고 그들의 역학은 해명하기 위하여 유사하게 도전적입니다. 단백질은 유전 질병의 경우와 같이 코딩 순서 내의 본질적인 돌연변이 때문에 잘못 접을 수 있습니다. 단백질은 또한 그(것)들을 용해하고 제대로 접히지 않는 proteostasis 네트워크 (PN) 노후화 도중 일어나는 것과 같이 손상하기 때문에 잘못 접습니다. PN은 분자 샤페론 및 분해 기계를 포함하고 생물 발생, 접이식, 인신 매매 및 단백질의 분해에 대한 책임이1.

C. 예쁜꼬마선충은 수명이 짧고, 등소성 성질이 나고, 유전적 조작의 용이성으로 인해 노화와 질병을 연구하는 모델로 부상했습니다. 몇몇 C. 예쁜꼬마선충은 취약한 조직에서 인간 질병을 일으키는 단백질을 발현하는 형질전환 균주가 만들어졌습니다. 중요한 것은, 응집되기 쉬운 단백질을 포함하는 많은 균주는 아밀로이드 장애, 큰 개재물의 형성의 특징을 되풀이한다. C. elegans의 투명한 바디 덕분에, 이 응집체는 비침범성 및 비파괴적으로 생체 내에서 가시화될 수 있습니다

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Protocol

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1. C. 예쁜꼬마선충의 동기화

  1. C. 예쁜꼬마선충을 알칼리성 하이포염소산염 용액 처리를 통해 또는 20 °C8에서4 시간 동안 간단한 계란 누워를 통해 동기화하십시오.
  2. 표준 절차에 따라 OP50 대장균으로 시드 된 선충 성장 배지 (NGM) 플레이트에서 20 °C에서 선충을 성장시키고유지합니다. 선충을 원하는 발달 단계 또는 날까지 나이.
    참고 : 이 프로토콜에서는 젊은 성인이 4 일째에 이미지화되고 오래된 선충은 삶의 8 일째에 이미지됩니다.

2. 수유를 통한 샤페론 기계의 RNAi 매개 녹다운

참고: 열 충격 단백질1(hsp-1)샤페론을선충(10)에상응하는 RNAi 벡터에 공급하여 녹다운을 수행한다. hsp-1 RNAi 플라스미드는 아링거 라이브러리로부터 수득되었다(클론 ID: F26D10.3).

  1. HSp-1 RNAi 플라스미드를 발현하는 HT115(DE3) 대장균을 루리아 베르타니(L....

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Results

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이 프로토콜은 자연 노화 중과 스트레스를 받을 때 살아있는 C. 예쁜 꼬마의응집된 종의 형성을 정확하게 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 우리는 40Q, 44Q 또는 85Q 반복의 폴리글루타민 단백질을 발현하는 형질전환 선충의 4개의 다른 긴장을 선택했습니다. 이 단백질은 다른 조직에서 합성되고 다른 형광단에 융합되었습니다. C. 예쁜꼬마선충 균주는 체내 벽 근육(mQ40-RFP), 신경계의 Q40-CFP(nQ40-CFP) 및 창자 내 Q44-YFP 또는 Q85-YFP(iQ44-YFP 및 iQ85-YFP)13에서Q40-mRFP를 발현하였다. 노화가 응집을 촉진하는 방법을 설명하기 위해, 우리는 8 일째에 젊은 선충, 4 일째, 오래된 선충에서 이러한 polyQ 균주의 수명을 수집했습니다. PN에서 결핍의 효과를 보여주기 위해 mQ40-RFP 및 nQ40 균주에서 hsp-1의 넉다운을.......

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Discussion

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여기에 제시된 프로토콜은 C. elegans 모형 시스템에서 집계된 종을 확인하기 위하여 현미경 검사법 기지를 둔 기술을 기술합니다. FLIM은 형광 수명 부패의 측정을 통해 형광에 융합된 응집및 수용성 종의 존재를 정확하게 특성화할 수 있습니다. 융합 단백질이 집계되기 시작하면 기록된 평균 수명은 더 높은 값에서 더 낮은값(16)으로이동합니다. 응집의 성향은 다음 수명에 있는 하락에 의해 추론될 수 있습니다: 더 낮은 수명, 시스템에 응집된 단백질 종의 더 높은 존재. 이에 의해, 노화의 영향을 따를 수 있게 된다, 질병, 또는 임의의 단백질의 응집 성향에 PN의 손상.

기술의 다양성을 강조하기 위해, 우리의 결과는 FLIM이 조직 이나 형광에 관계없이 다양한 polyQ 구조의 구조 변화를 식별 할 수 있음을 명확하게 보여주었습니다. 중요한 것은, FLIM은 α-synuclein17과

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

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CGC에 의해 제공되는 근육 Q40-mRFP 긴장, 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실에 의해 투자되는 (P40 OD010440). 뉴런-Q40-CFP는 모리모토 연구소의 일종의 선물이었습니다. 우리는 DFG를 인정 (JK에 KI-1988/5-1, MLP에 우수성의 NeuroCure 클러스터에 의해 NeuroCure 박사 펠로우십), EMBO (MLP에 단기 펠로우십) 및 생물학자의 회사 (CG와 MLP에 여행 보조금) 자금. 우리는 또한 YFP 구조물을 이미지화하기 위한 설치를 제공하기 위한 베를린 분자 의학을 위한 막스 Delbrück 센터에 있는 고급 빛 현미경 화상 진찰 시설을 인정합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM 구성 요소
Ahringer Library hsp-1 siRNASource BioScience UK LimitedF26D10.3
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3항생제
B& H DCS-120 SPC-150베커 & Hickl GmbHFLIM 인수 소프트웨어
B& H SPC830-SPC 이미지Becker & Hickl GmbHFLIM Aquisition 소프트웨어
BD Bacto 펩톤BD-Bionsciences211677NGM component
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS 유전학 센터 (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPMorimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP모리모토 연구소의 친절한 선물
C. elegans nQ40-CFPMorimoto Lab
Deckglä로부터의 친절한 선물; ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2커버 슬립
이소프로필-&베타;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AG장착 실체현미경
Leica TCS SP5Leica Camera AG컨포칼 현미경
Levamisole HydrochlorideAppliChem GmbHA4341마취
OP50 대장균CAENORHABDITIS 유전학 센터(CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM 인수 소프트웨어
Sodium AzideCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1마취
염화나트륨Carl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM 구성 요소
표준-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1유리 슬라이드
범용 아가로스바이오 & GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AG컨포칼 현미경
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AG컨포칼 현미경
의 친절한 선물제 판매

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

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