형광 일생 화상 진찰을 사용하여 노화 C. Elegans에 있는 아밀로이드 구조물의 특성화

단백질 응집은 노화와 질병 모두에서 발생합니다. 큰 아밀로이드 또는 비정질 개재물의 형성 그리고 증착으로 이끌어 내는 통로는 따르기 어렵고 그들의 역학은 해명하기 위하여 유사하게 도전적입니다. 단백질은 유전 질병의 경우와 같이 코딩 순서 내의 본질적인 돌연변이 때문에 잘못 접을 수 있습니다. 단백질은 또한 그(것)들을 용해하고 제대로 접히지 않는 proteostasis 네트워크 (PN) 노후화 도중 일어나는 것과 같이 손상하기 때문에 잘못 접습니다. PN은 분자 샤페론 및 분해 기계를 포함하고 생물 발생, 접이식, 인신 매매 및 단백질의 분해에 대한 책임이^1.

C. 예쁜꼬마선충은 수명이 짧고, 등소성 성질이 나고, 유전적 조작의 용이성으로 인해 노화와 질병을 연구하는 모델로 부상했습니다. 몇몇 C. 예쁜꼬마선충은 취약한 조직에서 인간 질병을 일으키는 단백질을 발현하는 형질전환 균주가 만들어졌습니다. 중요한 것은, 응집되기 쉬운 단백질을 포함하는 많은 균주는 아밀로이드 장애, 큰 개재물의 형성의 특징을 되풀이한다. C. elegans의 투명한 바디 덕분에, 이 응집체는 비침범성 및 비파괴적으로 생체 내에서 가시화될 수 있습니다². 플루오로포어와 융합하여 관심 있는 단백질(POI)을 생성하면 그 위치, 인신매매, 상호 작용 네트워크 및 일반적인 운명을 조사할 수 있습니다.

우리는 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)를 통해 생활과 노화 C. elegans에 있는 질병 일으키는 단백질의 집합을 감시하는 프로토콜을 제시합니다. FLIM은 방출 스펙트럼이 아닌 불소의 수명을 기반으로 하는 강력한 기술입니다. 수명(tau, θ)은 광자에서 흥분 상태에서 다시 지면 상태로 붕괴하는 데 필요한 평균 시간으로 정의됩니다. 주어진 분자의 수명은 시간 상관 된 단일 광자 계수 (TCSPC)의 시간 도메인 기술로 계산됩니다. TCSPC-FLIM에서 형광 부패 기능은 짧은 고주파 레이저 펄스로 형광을 흥분시키고 펄스와 관련하여 검출기에 방출된 광자의 도착 시간을 측정하여 얻을 수 있습니다. 샘플을 스캔할 때 각 픽셀에 대해 3차원 데이터 배열이 만들어집니다. x,y 따라서 주어진 샘플은 단백질의 구조, 결합 및 환경^3,,4에대한 정보를 공개하는 수명의 지도가 됩니다. 각 형광 단백질은 생리화학적 특성에 따라 본질적으로 정확하게 정의된 수명을 가지고 있으며, 일반적으로 몇 나노초(ns)입니다. 중요한 것은 형광공의 수명은 농도, 형광 강도 및 이미징 방법론과 독립적입니다. 그러나, 생물학적 시스템 내에서, pH, 온도, 이온 농도, 산소 포화도 및 그 상호 작용 파트너와 같은 환경 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 수명은 내부 구조 변경 및 방향에도 민감합니다. POI에 형광포를 융합하면 수명이 변경되고 결과적으로 융합 된 단백질의 거동에 대한 정보가 생성됩니다. 불소가 아밀로이드 구조의 반병렬 베타 시트와 같이 단단히 결합된 환경에서 포위되거나 캡슐화되면, 비방사성으로 에너지를 잃게 되며, 담금질^5로알려진 과정이다. 불소의 담금질은 명백한 수명의 단축 귀착됩니다. 용해될 때, 단백질의 수명은 원래의 더 높은 가치에 더 가깝게 유지됩니다. 대조적으로, 단백질이 응집하기 시작하면, 그 수명은 필연적으로 더 낮은 값^6,,7로이동합니다. 따라서, 살아있는 C. elegans에있는 다른 나이에 어떤 아밀로이드 형성 단백질의 응집 성향을 감시하는 것이 가능하게 됩니다.

여기서 우리는 상이한 폴리글루타민(CAG, Q) 스트레글(Q40, Q44, 및 Q85)을 포함하는 융합 단백질의 응집을 분석하는 프로토콜을 설명한다. 우리는 기술이 청록색 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 단모공 적색 형광 단백질 (mRFP)과 같은 다른 형광체에 동등하게 적용될 수 있는 방법을 설명합니다; 그리고 C. 예쁜 꼬마의모든 조직에서, 뉴런을 포함, 근육, 그리고 내장. 더욱이, proteostasis의 맥락에서, FLIM은 분자 chaperones의 고갈시 변경을 관찰하는 아주 유용한 공구입니다. RNA 간섭을 통해 주요 분자 샤페론 중 하나인 열 충격 단백질 1(hsp-1)을쓰러뜨리면 단백질의 조기 오인이 발생합니다. 노화, 질병 또는 결핍 된 샤페론의 결과로 응집 부하의 증가는 형광 수명 감소로 측정됩니다.

1. C. 예쁜꼬마선충의 동기화

1. C. 예쁜꼬마선충을 알칼리성 하이포염소산염 용액 처리를 통해 또는 20 °C^8에서4 시간 동안 간단한 계란 누워를 통해 동기화하십시오.
2. 표준 절차에 따라 OP50 대장균으로 시드 된 선충 성장 배지 (NGM) 플레이트에서 20 °C에서 선충을 성장시키고^{유지합니다.} 선충을 원하는 발달 단계 또는 날까지 나이.
   참고 : 이 프로토콜에서는 젊은 성인이 4 일째에 이미지화되고 오래된 선충은 삶의 8 일째에 이미지됩니다.

2. 수유를 통한 샤페론 기계의 RNAi 매개 녹다운

참고: 열 충격 단백질1(hsp-1)샤페론을^{선충(10)에}상응하는 RNAi 벡터에 공급하여 녹다운을 수행한다. hsp-1 RNAi 플라스미드는 아링거 라이브러리로부터 수득되었다(클론 ID: F26D10.3).

1. HSp-1 RNAi 플라스미드를 발현하는 HT115(DE3) 대장균을 루리아 베르타니(LB) 배지에서 6시간 동안 50 μg/mL 암피실린을 함유한다.
2. 이소프로필 β-D-1-티오갈라코피라노사이드(IPTG; 1 mM)와 암피실린(25 μg/mL)을 함유한 신선한 NGM 한천 플레이트와 hsp-1 RNAi 박테리아를 함유한 씨앗을 준비합니다. 접시를 건조시키고 실온에서 1-3 일 동안 유도하십시오.
3. 동기화된 계란을 siRNA 플레이트에 놓고 부화시키거나 그레이비드 선충을 놓고 제거하기 전에 20°C에서 4시간 동안 알을 낳습니다. 선충을 원하는 나이나 단계까지 키운다.
   참고 : 선충의 2 세대는 녹다운의 강한 표현형을 제시 할 수 있습니다. 여기에 설명된 siRNA 프로토콜 및 조건은 일반적이며 hsp1에적응됩니다. 특정 클론/유전자의 siRNA를 통한 RNA 간섭은 최종 사용자에 의해 확립되고 최적화되어야 합니다. 모든 siRNA가 동일한 효율을 가지는 것은 아니며, 따라서 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 또는 웨스턴 블롯에 의한 정량화에 의한 녹다운의 효능을 테스트하는 것이 좋습니다.

3. 현미경 슬라이드의 준비

1. 이미징 당일, 이미징 슬라이드를 준비하는 것으로 시작합니다. ddH₂O에서 아가로즈를 3% 농도(w/v)로 녹여 서식합니다.
2. 1 mL 파이펫 팁의 끝을 잘라 약 200 μL의 녹은 아가로오스를 가져 가라. 아가로즈를 깨끗한 유리 슬라이드에 파이펫하고 즉시 위에 두 번째 를 배치하여 거품이 형성되지 않도록하십시오. 건조하고 상단 유리 슬라이드를 부드럽게 제거하십시오. 결과는 선충이 배치될 균일한 아가로즈 표면을 가진 유리 슬라이드입니다.
   참고 : 각 슬라이드는 5-10 선충 사이에 이미지하는 데 사용됩니다. 슬라이드를 준비하고 건조에서 아가로스를 방지하기 위해 허밍 상자에 몇 시간 동안 저장할 수 있습니다.

4. 현미경 슬라이드에 선충을 장착

참고: FLIM은 선충을 고정시켜야 합니다. 이미징 설정(예: 현미경, 레이저, 검출기)을 사용할 준비가 되면 이 단계를 수행합니다.

1. 백금 와이어 픽을 사용하여 원하는 나이의 선충을 신선한 씨없는 접시에 놓고 크롤링하여 몸에서 과도한 OP50 박테리아를 제거하십시오.
2. 마취 화합물 (아지드 나트륨 또는 레바미솔)을 준비하여 선충을 고정시킵니다. 500 mM NaN₃ 스톡을 4°C에서 어둠 속에서 유지하고 신선한 ddH₂O로 희석하여 최종 농도250 mM으로 희석하였다. 레바미솔을 사용하는 경우, ddH_2O에서2mM의 작업 용액으로 20 mM 스톡을 희석한다.
   주의: 아지드 나트륨 (NaN_3)은독성이 매우 높습니다. 장갑과 보호 안경을 사용하고 통풍이 잘되는 후드 아래에서 작업하십시오.
3. 입체 현미경으로 작업, agarose 패드에 마 미 스틱 화합물의 10 μL 드롭을 배치 하 고 부드럽게 그것에 5-10 선충을 전송. 속눈썹 팁을 사용하여 선충을 분리하십시오. 이미지 수집 중에 선충을 쉽게 현지화할 수 있도록 두어 도는 것이 아니라 함께 가까이 유지하십시오.
4. 선충을 덮개로 조심스럽게 오버레이하십시오. 장착 후 1시간 이내에 측정하십시오.
   참고 : 두 마취제는 결국 C. 예쁜 꼬마를죽일 것입니다. 선충은 각 픽셀에서 수명이 매핑되기 때문에 이미징 중에 완전히 움직이지 않아야 합니다. x,y 매개 변수의 모든 움직임은 동일한 흥분 픽셀에서 수명을 읽는 것을 방지합니다.

5. FLIM 데이터 획득

참고: 이 프로토콜에서는 플루오로포어의 수명이 시간 도메인 TCSPC 방법을 통해 획득됩니다. FLIM은 레이저에 의해 일정한 반복 속도로 빛의 펄스를 생성해야 합니다. 반복 속도는 레이저 유형에 따라 다르며 사용자가 알아야 합니다. 수명 측정은 기존의 현미경과 함께 설치된 검출기 및 전자 장비에 의해 달성됩니다. 이 프로토콜에서 측정은 각각 mRFP, CFP 및 YFP 수명을 획득하기 위해 두 개의 서로 다른회사(재료 표)에서제공하는 검출기 및 소프트웨어로 세 가지 다른 레이저 스캐닝 공초점 현미경에서 수행됩니다. 시작하기 전에 방출/여기의 올바른 필터가 제자리에 있는지 확인하고 배경이나 모니터 백라이트를 최소화합니다. 실험을 시작하기 전에 선택한 형광단의 광안정성을 설정하십시오. 선충 조직 내에서 짧은 시간 내에 형광성형 표백이 되면, C. elegans에서FLIM 측정에 적합하지 않습니다.

1. FLIM 수집 소프트웨어를 엽니다. FLIM 소프트웨어는 또한 공초점 현미경의 제어를 허용합니다. 탭/버튼을 찾아 감지기의 출력을 사용하도록 설정하고 출력 활성화를 누릅니다.
2. 계측기 설정의 타이밍 정밀도를 설명하는 계측기 응답 기능(IRF)을 획득합니다.
   참고 : 이 단계는 선충을 장착하기 전에 바람직하게 수행되어야한다.
   1. 사용 가능한 경우 여기/방출 필터를 제거합니다.
   2. 빈 커버슬립을 목표 위에 놓고 표면을 찾습니다. 커버슬립에서 얻은 산란 신호를 최소 30s로 기록합니다.
      참고: 수나노초의 수명 동안 수집 소프트웨어는 IRF 시프트를 자동으로 추정할 수 있습니다. IRF를 구입하는 것이 좋습니다.
3. 슬라이드를 장착한 C. 예쁜꼬마선충과 함께 무대에 놓습니다. 변속기 모드에서 10배 배율 렌즈를 사용하여 슬라이드상에서 선충의 위치를 지역화합니다.
4. 슬라이드를 제거하고, 대물렌즈를 63배 배율 렌즈로 전환하고, 필요한 침지 매체(예: 오일)를 적용한다. 무대에서 슬라이드를 교체하고 선충을 지역화하십시오.
5. 수집 소프트웨어에서 핀홀 관리자를 찾아 최대값으로엽니다. 샘플 스캔을 시작하고 관심 영역(예: 머리, 상체)을 선택하고 최대 투영 평면에 초점을 맞춥니다.
6. 소프트웨어 인터페이스에 존재하는 레이저 펄스 속도와 세 가지 다른 값인 상수 분수 판별기(CFD), 진폭 시간(TAC), 아날로그-디지털 컨버터(ADC)를 모니터링합니다.
   참고: 레이저의 최대 게이트는 1 x 10⁸ 단일 광자 수여야 합니다. 이 숫자는 레이저에서 제공하는 최대 광자 수를 나타냅니다. CFD는 검출기에 의한 레이저 펄스를 참조하여 단일 광자 펄스의 수신에 대한 정보를 제공한다. 이 값은 대략 1 x 10^5여야합니다. TAC는 하나의 광자 검출 시간과 다음 레이저 펄스를 구별합니다. 마지막으로 ADC는 TAC 전압을 보관 가능한 메모리^{신호(11)로}변환합니다. CFD, TAC 및 ADC는 모두 형광포에 의해 방출되는 광자가 손실되지 않도록 비슷한 값을 가져야 합니다. 이러한 매개변수를 정확하게 평가하면 정확한 수명 맵을 만들기 위해 충분한 광자가 수집됩니다.
7. FLIM 소프트웨어의 인터페이스에서 감지된 광자 수를 미리 보기: ADC 값은 1 x 10^4와 1 x 10⁵사이여야 합니다. 필요한 경우 다른 평면에 초점을 이동하거나 레이저 전원을 증가하여 더 많은 광자를 수집합니다.
   참고: 일반적으로 초당 기록된 광자 수는 레이저 반복 속도의 1%를 초과해서는 안 됩니다.
8. 메뉴 모음에서 탭을 선택하여 수집 매개변수를 설정합니다. 스캔 동기화를 선택하여 단일 광자 감지를 허용합니다.
9. 수집을 고정된 시간 또는 고정된 광자 수로 설정합니다. 예를 들어 2분 동안 또는 단일 픽셀이 2,000개의 단일 이벤트의 광자 수에 도달할 때까지 수명 감소 곡선을 획득합니다. 시작을 Start 눌러 인수를 시작합니다.
   참고: 형광단은 다른 여기 및 방출 레이저와 필터가 필요합니다. 샘플의 밝기에 따라 레이저 전력도 조정할 수 있어 수명을 방해하지 않습니다. 이러한 프로토콜은 다음과 같은 여기/방출 설정을 사용합니다: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. 펄스 2 광자 레이저ex800/em440 nm를 사용 하 여 CFP 측정에 사용 되었다. FLIM 맵을 획득하는 데 필요한 시간과 광자 수는 각 설정 및 각 실험 목적에 대해 경험적으로 설정되어야 합니다.

6. FLIMfit 소프트웨어를 사용하여 FLIM 데이터 분석

참고: 임페리얼 칼리지 런던^12에서 개발된 FLIMfit 소프트웨어 도구를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다(그림 1참조).

1. 소프트웨어를 열고 파일을 통해 FLIM 데이터 파일을 가져옵니다 | FLIM 데이터 로드. 다른 세션과 다른 생물학적 반복에서 얻은 경우에도 하나의 조건에서 모든 샘플을로드합니다.
2. 필요한 경우, 세분화를 통해 FLIM 사진에서 단일 선충을 분할 | 세분화 관리자. 강조 표시될 때까지 관심 영역 주위로 자르기 도구를 끕을 끕을 끕을 끕을 끕을 끕을 끕이 있는 영역 주위로 드래그합니다. 완료되면 확인을누릅니다.
   참고: 모든 이미지에 대해 세분화를 수행해야 합니다.
3. C. 예쁜꼬마선충의 강도 기반 이미지가 나타나는 작은 영역을 선택합니다(그림1,화살표 1). 해당 영역의 감쇠 곡선은 인터페이스의 오른쪽에 있는 큰 감쇠 창에나타납니다(그림 1,화살표 2).
   참고: 감쇠는 선형 또는 로그hmically 표시할 수 있습니다.
4. 6.5-6.8 단계에 설명된 대로 소프트웨어 알고리즘을 통해 수명을 추정하기 위해 올바른 매개 변수를 설정합니다.
5. 데이터 탭(그림 1, 화살표 3):
   1. 임의의 통합 최소값을 설정하여 너무 어둡게 표시된 픽셀을 제외하면 적합도가 높습니다. C. elegans 샘플에 따라이 값은 40-300에서 다릅니다. 만족스러운 미리 보기가 달성될 때까지 다른 값을 입력합니다.
   2. 최소 시간 및 시간 최대 숫자를 선택하여 FLIM 신호를 이러한 값으로 제한합니다. 이 임계값 전후에 나타나는 모든 이벤트는 제외됩니다.
      참고: 예를 들어 mRFP 분석을 위해 800ps 이전 및 4,000ps 이후의 이벤트는 제외되었습니다. 이러한 값은 형광단의 수명에 따라 달라지며 최종 사용자가 결정해야 합니다.
   3. 1의 사전 설정 개수/광자 도 변경하지 마십시오.
   4. 수집 중에 사용되는 레이저의 반복 속도를MHz에서 입력합니다.
      참고 : 현재 프로토콜의 경우, 다른 레이저는 다양한 반복 속도로 활용되었다. CFP 수명 수집에 사용되는 두 개의 광자 레이저는 80MHz의 반복 속도를 가지며, YFP의 경우 레이저는 40MHz에서 반복되며 mRFP의 경우 값은 78.01 MHz입니다. 이들 값은 분석된 샘플에 따라 FLIMfit에 입력하였다.
   5. 게이트 최대 값을 입력하여 포화 된 모든 픽셀을 제외합니다.
      참고: C. elegans의수명 측정의 경우 이 값은 큰 숫자(예: 1 x 10^8)로설정됩니다.
6. 수명 탭에서 사용할 전역 피팅(예: 픽셀 별 피팅)을 선택합니다. 그림 1, 화살표 4를 참조하십시오.
   참고: 픽셀 별 피팅은 각 개별 픽셀에 맞는 감쇠를 생성합니다. 이미지 별 피팅은 각 개별 이미지의 전역 피팅을 생성하고 이미지당 단일 수명 값을 표시합니다. 전역 별 피팅은 전체 데이터 집합에 걸쳐 단일 피팅을 생성합니다. 모든 이미지에 대해 단일 수명 값이 제공됩니다.
7. 아니오를 제외한 다른 매개 변수는 변경하지 마십시오. 선택된 형광 붕괴가 다과능이며 단일 수명 이상을 나타낸다는 것이 알려진 경우 Exp 선택.
   참고: 본 프로토콜에서, 이 함수는 비에시포넨트 형광피의 수명을 계산하는 데 이용되었다.
8. IRF 메뉴를 통해 IRF 업로드: IRF | 로드 IRF. IRF 시프트를 추정하려면 IRF | 예상 IRF 시프트. 값 집합이 IRF 탭에 자동으로 나타납니다. 이 설정이 완료되면 이 탭의 다른 매개 변수를 변경하지 마십시오.
9. 모든 매개변수가 설정되면 데이터 집합 맞춤(그림 1,화살표 5)을 누릅니다. 알고리즘은 감쇠 곡선에 맞는 값을 생성하고 각 이미지에 대한 수명 값을 설정합니다.
   참고: 파란색 선으로 강조 표시된 결과 맞춤은 모든 이벤트와 겹쳐야 합니다. 모든 이벤트가 맞춤을 따라 정렬될 때 적합합니다.
10. 소프트웨어 인터페이스의 오른쪽 상단 메뉴에 있는 매개 변수 탭(그림1,화살표 6)을 클릭하고 통계: w_mean(가중치 평균)를 선택하고 chi2 값이 가능한 1에 가깝습니다.
    참고: chi2가 1에 가깝기 때문에 착용감의 정확성을 보장합니다. 따라서 선택한 이미지의 수명 값은 tau_1.
11. 관심 정보 내보내기: 파일 | 강도 이미지/맞춤 결과 테이블/이미지/히스토그램 내보내기. 수명을 계산하는 데 사용되는 데이터 설정 저장: 파일 | 데이터 설정 저장.
    참고: 선택한 샘플의 향후 분석을 위해 사용되는 매개변수가 저장됩니다.

7. FLIM 데이터의 그래픽 표현

참고: 다양한 샘플에서 수집된 수명은 다양한 방법으로 시각적으로 나타낼 수 있습니다. 나노초 또는 피코초 단위로 수명 값을 나타내려면 선택합니다.

1. FLIMfit에서 직접 감쇠 곡선을 내보내 곡선의 맞춤 품질과 정확도를 표시합니다.
2. 광자 수의 빈도와 히스토그램의 수명 값을 플로팅하여 광자의 분포를 나타냅니다.
3. 마지막으로 통계 비교를 위해 두 개 이상의 샘플을 비교하는 경우 분산형 플롯 막대 그래프에서 수명 값과 평균의 표준 편차를 배치합니다. 원하는 통계 분석을 수행합니다.

이 프로토콜은 자연 노화 중과 스트레스를 받을 때 살아있는 C. 예쁜 꼬마의응집된 종의 형성을 정확하게 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 우리는 40Q, 44Q 또는 85Q 반복의 폴리글루타민 단백질을 발현하는 형질전환 선충의 4개의 다른 긴장을 선택했습니다. 이 단백질은 다른 조직에서 합성되고 다른 형광단에 융합되었습니다. C. 예쁜꼬마선충 균주는 체내 벽 근육(mQ40-RFP), 신경계의 Q40-CFP(nQ40-CFP) 및 창자 내 Q44-YFP 또는 Q85-YFP(iQ44-YFP 및 iQ85-YFP)13에서Q40-mRFP를 발현하였다. 노화가 응집을 촉진하는 방법을 설명하기 위해, 우리는 8 일째에 젊은 선충, 4 일째, 오래된 선충에서 이러한 polyQ 균주의 수명을 수집했습니다. PN에서 결핍의 효과를 보여주기 위해 mQ40-RFP 및 nQ40 균주에서 hsp-1의 넉다운을 수행했습니다.

FLIMfit 소프트웨어를 통해 수명 값을 추정한 후, 얻은 데이터는 글루타민 부하, 노화 또는 응력으로 인해 집계될 때 polyQ 구문 중 임의의 수명이 명확하게 감소하는 것으로 나타났습니다. FLIM은 수용성 단백질 분획과 응집된 종, 그리고 그들의 수명에 있는 변화를 기록해서 그들의 전이를 구별했습니다.

4일째에 mQ40-RFP는 평균 형광 수명 1.69ns를나타냈다(그림 2). 노화시, 더 많은 집계 된 종 발생, 일생 이미지에서 낮은 평생 초점으로 표시 하 고 감소 된 수명에 히스토그램을 이동(그림 2A). 선충의 나이에 걸쳐 획득된 모든 이미지의 평균 형광 수명을 플로팅함으로써 형광 수명의 현저한 감소, 따라서 응집된 종의 축적이 가시화되었다(도2B). PN의 단백질 접이식 용량은 C. elegans14및 응집 되기 쉬운 단백질에 있는 생활의 4 일 후에 감소된 아밀로이드와 비정질 응집체로 클러스터링하기 위하여 더 잘못 접혀. PN 을 제외하고, 특정 단백질의 본질적인 응집 성향은 골체 형성의 진행에 중요한 역할을 했다. 이는 iQ44-YFP 및 iQ85-YFP의 거동을 비교하여 분석되었다. iQ85의 더 긴 Q-스트레치는 응집하는 경향이 있었고, 생후 4일째에 이미 히스토그램에서 형광 수명 변화를나타냈다(그림 3A). 사실, 4 일째에, 초점 형성은 iQ85에 대해 관찰되었지만 iQ44에는 여전히 존재하지 않았습니다. 노화시, 그러나, iQ44는 또한 초점 형성을 전시하고 따라서 감소된 형광 수명. iQ85는 이미 초기 성인기에 응집체를 나타내었기 때문에 노화 시 응집의 진행은 덜 뚜렷했지만 유의한 것으로나타났다(도 3B). 마지막으로, 우리는 nQ40-CFP 균주에서 초점 형성이나 감소된 형광 수명을 검출하지않았다(도 4A). 이 균주에 대 한, 노화시 평균 형광 수명에 미묘한, 중요 하지 않은 변화만 있었다(그림 4B),잠재적으로 아직 알 수 없는 이유로 덜 취약 되 고 뉴런 으로 인해.

hsp-1을 쓰러뜨리면 mQ40및 nQ40의 PN이 선충을 표현하는 데 어려움을 초래합니다. HSp-1의 RNAi 매개 고갈은 응집의 현저한 증가로이어졌다(도 5 및 도 6). 신체 벽 근육에서 발현되는 Q40은 비응집 물질로 둘러싸인 소수의 큰 초점을 형성하는 경향이 있었다. 이것은 히스토그램에 있는 2개의 구별가능한 피크 귀착되었습니다 (약 1.7 ns 및 1.4 ns, 그림 5A참조). 노인 및 RNAi 처리 선충은 궁극적으로 평균 형광 수명을 감소 낮은 수명 피크에 강한 증가를 보였다(그림 5B). 근육에서 Q40의 이편 행동과 비교하여, 뉴런 Q40은 보다 다양한 응집 거동을 나타냈다. 우리는 근육 발현 변형에서와 같이 초점 형성과 응집을 직접 상관시킬 수 없었다(도 6A). FLIM은 응집 정도를 평가할 수 있는 기회를 제공했기 때문에, 히스토그램은 뚜렷한 피크가 아니라 형광 수명의 광범위한 분포가 아니라 다른 올리고머와 더 높은 차수 의 응집체의 복잡한 구성을 가리키는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고, 전체 집계 정도는 평균 형광 수명(그림6B)을플로팅하여 평가될 수 있으며, hsp-1 녹다운이 집계의 향상으로 이어졌다는 것을 보여준다.

융합 파트너와 생물학적 시스템 외부에서 자유로운 형광단의 수명이 더 높았다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 수명은 주로 환경에 의해 영향을 받기 때문에, YFP와 RFP의 수명의 약간의 감소는 이미 C. elegans의 조직 내에서 눈에 띄었습니다. 따라서 적절한 대조군으로서 선충 내의 수용성 POI의 수명을 얻는 것이 중요하다. 더 높은 수명과 더 낮은 수명을 가진 응집된 분율을 가진 용해성 분획 을 비교한 다음 만들 수 있습니다. 여기에서, 일생에 있는 감소는 근육과 장 세포 내의 눈에 보이는 초점의 대형과 상관관계가 있습니다. 여전히, 초점의 분수는 형광 수명의 감소를 나타내지 않았다 (그림 2 및 그림 2, 흰색 화살표 참조). 이 기능은 융합 구단의 일부만이 특정 시공간 지점에서 어떻게 응집될 수 있는지, 그리고 언바운드 단백질의 존재와 가용성을 강조합니다. 더 복잡한 시나리오는 신경 Q40-CFP 긴장의 조사에서 일어났습니다. CFP는 본질적으로 두 가지 뚜렷한 형광 수명을 가지고 있습니다. CFP는 Förster 공명 에너지 전달(FRET)15 측정에 이상적인 형광단이지만 YFP와 함께 C. elegans에서응집체 형성을 모니터링하는 것은 바람직하지 않습니다.

그림 1: FLIMFit 소프트웨어 인터페이스의 스크린샷. 형광 수명을 계산하는 데 사용되는 소프트웨어의 스크린 샷. 창은 설정이 텍스트에 설명된 대로 정의된 후 인터페이스를 표시하고 수명 계산을 수행했습니다. 번호가 매겨진 화살표는 프로토콜 내의 특정 단계를 참조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 근육 Q40-RFP의 형광 수명은 나이가 들면서 감소하였다. (A)FLIMfit에 의해 생성 된 삶의 4 일 또는 8 일에 근육 Q40-RFP를 표현하는 C. 예쁜 꼬마의 대표지도. 형광 수명, 형광 강도 및 두 가지 의 병합 된 이미지가 제공됩니다. 스케일 바 = 25 μm. 히스토그램은 100개의 범주로 나뉘어진 분석된 모든 선충에 대해 측정된 수명의 분포를 보여줍니다. (B)바 플롯은 각각 4일째 또는 8일째에 분석된 모든 동물의 가중평균 형광 수명을 나타낸 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 장 Q44-YFP및 장 Q85-YFP의 형광 수명은 나이가 들면서 감소했습니다. (A)FLIMfit에 의해 생성된 생명의 4일 또는 8일째에 장 Q44-YFP 또는 장 Q85-YFP를 표현하는 C. 예쁜꼬마선충의 대표지도. 형광 수명, 형광 강도 및 두 가지 의 병합 된 이미지가 제공됩니다. 스케일 바 = 25 μm. 히스토그램은 100개의 범주로 나뉘어진 분석된 모든 선충에 대해 측정된 수명의 분포를 보여줍니다. (B)바 플롯은 각각 4일째 또는 8일째에 분석된 모든 동물의 가중평균 형광 수명을 나타낸 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 뉴런 Q40-CFP의 형광 수명은 나이에 따라 변하지 않았다. (A)FLIMfit에 의해 생성된 생명의 4일 또는 8일째에 뉴런 Q40-CFP를 표현하는 C. elegans의 대표지도. 형광 수명, 형광 강도 및 병합된 이미지가 모두 제공됩니다(두 번째 수명, θ2는 모든 샘플에 표시됩니다). 스케일 바 = 25 μm. 히스토그램은 100개의 범주로 나뉘어진 분석된 모든 선충에 대해 측정된 수명의 분포를 보여줍니다. (B)바 플롯은 각각 4일째 또는 8일째에 분석된 모든 동물의 가중평균 형광 수명을 나타낸 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 근육 Q40-RFP의 형광 수명은 hsp-1의녹다운시 감소했습니다. (A)FLIMfit에 의해 생성 된 삶의 4 일 또는 8 일에 근육 Q40-RFP를 표현하는 C. 예쁜 꼬마의 대표지도. 형광 수명과 강도 맵의 병합이 표시됩니다. 두 시간 점 동안, 빈 벡터(control) 또는 hsp-1 RNAi 구조를 발현하는 박테리아를 발현하는 박테리아에서 자란 선충이 도시된다. 스케일 바 = 25 μm. 히스토그램은 100개의 범주로 나뉘어진 분석된 모든 선충에 대해 측정된 수명의 분포를 보여줍니다. (B)바 플롯은 각각 대조군 또는 hsp-1 RNAi와 함께, 생후 4일 또는 8일째에 분석된 모든 동물의 가중 평균 형광 수명을 나타낸 플롯이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: hsp-1의녹다운 시 뉴런 Q40-CFP의 형광 수명 감소. (A)FLIMfit에 의해 생성된 생명의 4일째에 뉴런 Q40-CFP를 표현하는 C. 예쁜꼬마선충의 대표지도. 형광 수명과 강도 맵의 병합이 표시됩니다. 선충류는 hsp-1 RNAi 구조를 발현하는 빈 벡터(control) 또는 박테리아를 발현하는 박테리아에서 성장하였다. 스케일 바 = 25 μm. 히스토그램은 100개의 범주로 나뉘어진 분석된 모든 선충에 대해 측정된 수명의 분포를 보여줍니다. (B)바 플롯은 대조군 RNAi 또는 hsp-1 RNAi와 함께 4일째에 분석된 모든 동물의 가중평균 형광 수명을 나타낸 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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