테라헤르츠 새로 절제된 유방암 종양을 위한 테라헤르츠 이미징 및 특성화 프로토콜

Terahertz (THz) 화상 진찰 및 분광학은 지난 10년간 연구의 급속하게 증가하는 지역이었습니다. 0.1-4 THz 범위에서 보다 효율적이고 일관된 THz 방출기의 지속적인 개발로 인해¹애플리케이션이 크게 1증가했습니다. THz가 약속과 상당한 성장을 보여 준 한 분야는 생물 의학 분야^2입니다. THz 방사선은 일반적으로 고정 된 조직을 분석하는 데 사용되는 전력 수준에서 비온화 및 생물학적으로 안전한 것으로 나타났다^3. 그 결과, THz 이미징 및 분광법은 화상 손상 및 치유 를 나타내기 위해 수분 함량과 같은 다양한 조직 특징을 분류하고 분화하는 데 사용되어 왔으며^4,간 경변증⁵및 절제 된 조직에서의 암^6,,7. 특히 암 평가는 광범위한 잠재적 임상 및 외과 적 적용을 다루며, 뇌의 암에 대해 조사되었으며^8,간^9,난소^10,위장관^11,유방^{7,,12,,13,,14,,15,,16,,17, 18,,18, 19.18,}

유방암을 위한 THz 신청은 마진 평가를 통해 유방 보존 수술, 또는 요추 절제술을 지원하는 것에 주로 집중됩니다. 요추 절제술의 목적은 전체 유방 절제술과는 달리 종양과 주변의 건강한 조직의 작은 층을 제거하는 것입니다. 적당한 조직의 외과 마진은 일단 견본이 포르말린에서 고정되고, 절편되고, 파라핀에 매립되고, 현미경 슬라이드에 4 μm-5 μm 조각에 거치되면 병리학을 통해 평가됩니다. 이 과정은 시간이 많이 소요될 수 있으며 양성 마진이 관찰되는 경우 나중에 이차 수술이 필요합니다^20. 방사선 종양학의 미국 사회에 의하여 현재 지침은 표면 수준 마진 잉크^21를접촉하는 암세포가 있는 것과 같이 이 긍정적인 마진을 정의합니다. 고흡수 수화 조직을 위한 THz 화상 진찰은 급속한 마진 평가의 외과 필요를 충족하기위하여 충분한 조직 모형에 근거를 둔 몇몇 변화하는 침투를 가진 표면 화상 진찰에 1 차적으로 제한됩니다. 수술 설정 중 마진 조건을 빠르게 분석하면 수술 비용과 후속 절차 속도가 크게 감소합니다. 현재까지 THz는 포르말린 고정, 파라핀 내장(FFPE) 조직에서 암과 건강한 조직을 분화하는 데 효과적인 것으로 입증되었지만, 새로 절제된 조직에서 암을 안정적으로 검출하기 위해서는 추가적인 조사가 필요하다^7.

이 프로토콜은 바이오뱅크에서 얻은 갓 절제된 인간 조직 샘플에서 THz 이미징 및 분광법을 수행하는 단계를 자세히 설명합니다. 갓 절제된 인간 유방암 조직에 내장된 THz 응용은 특히 병원과 통합되지 않은 연구 집단에 의해 출판된 연구^{7,,18,,22,,23에서}거의 사용되지 않았습니다. 갓 절제된 조직의 사용은 마찬가지로 다른 암 적용에 대해드물며, 대부분의 비유방 인간암 예는 대장암^24,,25에대해 보고되고 있다. 이를 위한 한 가지 이유는 FFPE 조직 블록이 연구에 사용되는 THz 시스템이 수술 워크플로우의 일부가 아니라면 갓 절제된 조직보다 접근하고 처리하기가 훨씬 쉽다는 것입니다. 유사하게, 대부분의 상업적인 실험실 THz 시스템은 신선한 조직을 취급하기 위하여 준비되지 않으며, 그 세포주 성장을 사용하는 단계에 아직도 또는 동물 모형에서 절제된 조직을 보기 시작했습니다. 수술 중 설정에 THz를 적용하려면 분석이 표준 병리학을 수행하는 기능을 방해하지 않도록 새로운 조직을 위해 이미징 및 특성화 단계를 사전에 개발해야합니다. 본질적으로 수술 중이 아닌 응용 프로그램의 경우, 신선한 조직의 특성화는 여전히 생체 내 응용 프로그램 및 분화로 작동하기 위해 해결해야하는 도전적인 단계입니다.

이 작업의 목적은 상용 THz 시스템을 사용하여 갓 절제된 조직에 대한 THz 적용에 대한 지침을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 뮤린 유방암 종양^13,17,,19에 대한 THz 이미징 및 분광시스템(26)에서 개발되었으며 바이오뱅크^{26 77,18로부터}수득된 인간 수술 조직으로 확장되었다.^, 프로토콜이 유방암을 위해 생성되는 동안, 성공이 마진 평가^27에달려 있는 수술로 취급되는 유사한 THz 화상 진찰 시스템 및 그밖 모형에 적용될 수 있습니다. 갓 절제된 조직에 대한 상당히 적은 양의 THz 결과로 인해, 이것은 THz 이미징 및 특성화를 위한 신선한 조직 취급의 프로토콜에 초점을 맞추는 저자의 지식에 대한 첫 번째 작업입니다.

이 프로토콜은 아칸소 대학의 환경 보건 및 안전 부서에서 설정한 모든 요구 사항을 따릅니다.

1. 조직 취급 영역 설정

1. 그림 1과같이 스테인리스 스틸 금속 트레이를 가지고 생물학적 위험 가방으로 덮습니다. 생물학적 조직의 모든 취급은 트레이 영역(즉, 조직 취급 영역) 내에서 수행됩니다.
2. 실험실 핀셋, 티슈 와이프, 종이 타월, 필터 용지 팩, 티슈 염료 병, 표백제 병 및 에탄올 병을 트레이 주위에 준비하여 필요할 때 쉽게 접근할 수 있습니다. 사용된 티슈, 와이프 및 장갑을 생물학적 위험 물질 표면에 보관하여 프로토콜 의 끝에 폐기하십시오.
3. 50 mL 원심 분리기 튜브를 최대 45 mL의 10% 중성 완충 포르말린을 채우고 조직 처리 트레이 근처의 원심 분리기 저장 트레이에 놓습니다.

그림 1: 조직 처리 영역설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. THz 전송 분광학을 위한 신선한 유방암 종양 취급

주의 사항: 살아있는 조직을 다루기 전에 니트릴 손 장갑, 눈 보호 고글, 얼굴 마스크 및 실험실 코트를 착용하십시오. 항상 실험실 핀셋을 사용하여 조직을 처리하고 손으로 직접 만지지 마십시오. 밀봉 된 용기 또는 스캐닝 단계 외부의 신선한 조직으로 의 모든 작업은 1.1 단계에서 확립 된 조직 처리 영역에서 수행되어야한다.

참고: 이 작업에서 처리된 모든 조직은 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM) 및 바이오뱅크의 항생제 용액으로 출하되었습니다.

1. DMEM 용액에서 벌크 종양을 제거하고 조직 처리 부위에 페트리 접시에 놓습니다(그림 2A참조).
2. 총 검사에서, 전송 특성화를 위한 작은 조각을 슬라이스하는 명백한 종양 지구를 확인하십시오. 그림 2B와같이 스테인레스 스틸 로우 프로파일 블레이드를 사용하여 식별 된 지점에서 종양의 0.5 mm 두께 세그먼트를 잘라냅니다. 그림 2C와같이 액체 샘플 홀더에 0.1 mm 두께의 스페이서가 있는 두 석영 창 사이에 이 슬라이스 섹션을 배치합니다.

그림 2: THz 투과 분광법 측정을 위한 종양 절제. (A)벌크 종양의 사진. (B)종양의 작은 부분(0.5 mm)의 사진은 벌크 종양으로부터 절단된다. (c)분광법 측정을 위한 0.1 mm 폴리테트라플루오로에틸렌 스페이서가 있는 두 석영 창 사이에 액체 샘플 홀더에 놓인 슬라이스 된 종양 섹션. 그림 T. Bowman^{외. 18} SPIE의 허가와 함께 다시 게시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. THz 투과 분광법 측정

1. 모듈 핸들을 코어 시스템의 장착 기둥 위에 정렬하고 스테이지를 시스템으로 밀어 THz 코어 챔버 내부의 전송 분광법 모듈을 설정합니다. 그림 3A와같이 모듈의 오른쪽 상단 및 왼쪽 아래 모서리에 있는 두 개의 장착 나사를 조입니다.
2. 전체 분광학 시술 중에 5L/min(LPM)의 건조 질소 가스로 시스템을 제거하여 샘플 공간에서 수증기를 제거합니다.
3. THz 시스템에 연결된 데스크탑에서 THz 전송 분광법 측정 소프트웨어를 엽니다. 주 창이 열립니다.
4. 창 상단의 스캔 탭을 클릭합니다. 스펙트럼 스캔 설정 창이 나타납니다. 창 오른쪽 상단에 있는 측정 모드 탭의 드롭다운 메뉴에서 전송을 선택하여 전송 분광법을 설정합니다. 피크가 자동으로 표시되지 않으면 수동 피크 검색 탭에서 활성화 옵션을 확인하고 광학 지연을 수동으로 단계별로 이동하여 피크를 볼 수 있습니다.
5. 30분 동안 퍼징한 후 아래 단계에 따라 공기 기준 신호를 기록합니다.
   1. 스펙트럼 스캔 설정 창의 스캔 설정 탭에서 참조 파일에 대한 적절한 이름을 입력하고 Num 검사를 1,800으로 설정하고 시작 지연(s)를 0으로 설정합니다.s 다른 설정을 기본값으로 둡니다.
   2. 스캔 설정 창에서 측정 참조를 클릭하여 공기 참조 측정을 수행합니다. 그런 다음 측정 샘플을 클릭하여 ~ 1 분 동안 1,800 개의 샘플 평균으로 공기를 통한 전송 신호를 측정합니다.

그림 3: THz 투과 분광법 모듈 설정. (A)전송 모듈이 장착된 THz 코어 챔버. (B)액체 샘플 홀더의 사진. (C)측정을 위해 코어 챔버 내부에 배치된 샘플 홀더입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 그림 3B와같이 액체 샘플 홀더에서 두 개의 석영 창을 측정합니다.
   1. 두 개의 석영 창을 사이에 스페이서없이 액체 샘플 홀더에 놓습니다.
   2. THz 코어 챔버를 엽니다. 그림 3C와같이 전송 분광모듈에 액체 샘플 홀더를 장착합니다. 챔버를 닫습니다.
   3. 메인 창에서 스캔 탭을 클릭합니다. 석영 샘플에 대해 3.5.1-3.5.2 단계를 반복하지만 시작지연(s)을900으로 업데이트합니다. Start Delay 이렇게 하면 측정 전에 수증기를 제거할 수 있습니다.
   4. 추가 샘플에 대한 참조로 석영을 원하는 경우 스캔 설정 아래의 참조 지우기 탭을 클릭합니다. Scan Settings. 이렇게 하면 공기 참조가 지워지습니다. 그런 다음 참조 측정 탭을 클릭하여 석영 측정값을 새 참조로 기록합니다.
7. 액체 샘플 홀더 내부에 두 석영 창 사이에 슬라이스 된 종양 섹션을 배치하고 조직의 단일 지점 전송 측정을 위해 챔버 내부에 홀더를 배치합니다. 측정을 기록하려면 3.6.3 단계를 반복합니다.
8. 측정이 완료되면 액체 샘플 홀더를 챔버에서 꺼내 조직 처리를 위해 지정된 영역으로 가져 오십시오. 액체 샘플 홀더를 분해하고, 석영 창에서 티슈 와이프로 종양 부분을 닦고, 사용된 티슈 와이프를 동일한 트레이에 넣어 다른 생물학적 위험 폐기물과 함께 생물학적 위험 봉투에 폐기하십시오.
9. 필요에 따라 2.2, 3.7 및 3.8단계를 반복하여 추가 종양 조각을 특성화합니다. 측정이 완료되면 기본 창으로 이동하여 파일 탭을 클릭하여 측정 데이터를 저장합니다. 소프트웨어 창을 닫습니다.

4. THz 반사 모드 이미징을 위한 신선한 유방암 종양 취급

1. DMEM 및 항생제 용액에서 신선한 종양 샘플을 제거하고 페트리 접시에 놓습니다. 총 검사를 사용하여 종양의 측면을 선택하여 충분히 평평하고 혈액이 거의 없고 혈관이 거의 없는 이미지를 이미지화합니다. 가능하면 혈액이나 혈관으로 조직을 이미징하지 마십시오.
2. 도 4A에도시된 바와 같이, 과량의 DMEM을 건조시키고 종양으로부터 유체 또는 분비물의 조직을 지우기 위해 1등급 필터 페이퍼상에 이미지화될 측면과 함께 종양을 놓는다. 종이가 포화됨에 따라 필터 용지의 종양을 마른 지점으로 재배치합니다. ~5 분 동안 종양을 건조.

그림 4: THz 화상 진찰을 위한 신선한 종양 견본 준비. (A)필터 용지에 종양을 놓아 말리십시오. (B)과잉 유체를 흡수하기 위해 조직 닦아 패드와 이미징 창 위에 폴리스티렌 플레이트에 배치 종양. (C)종양은 방향을 추적하고 기포를 확인하기 위해 아래에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 전송 분광 모듈의 마운트를 해제하고 그림 5A와같이 THz 코어 시스템의 반사 이미징 모듈(RIM) 미러 베이스를 설정합니다. 거울을 설정하면 미러 베이스 위에 RIM 스캐닝 단계를 장착하고 코어 시스템에 나사로 조입니다(그림 5B참조).
4. 이미징 절차 전에 5 LPM에서 건조 질소 가스로 시스템을 제거하여 샘플 구획에서 수증기를 제거합니다. 30분 후, 시스템이 사용 중일 때까지 건조 질소 가스의 양을 3LPM으로 줄이십시오.
5. 두께 ~1.2 mm의 폴리스티렌 플레이트를 직경 ~ 37mm의 스캐닝 창에 놓습니다.

그림 5: 반사 이미징을 위한 시스템 설정. (A)반사 이미징 모듈 미러 베이스. (B)스캐닝 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

참고: 다른 두께 및 플레이트 재료는 단계 4.5에 적합하지만 균일한 두께를 가지고 THz 신호를 방해하지 않을 정도로 흡수가 낮아야 합니다.

6. THz 시스템에 연결된 데스크탑에서 THz 반사 이미징 측정 소프트웨어를 엽니다. 특정 함수에 대한 여러 대화 상자 아이콘과 THz 필드 플롯에 대한 두 개의 하위 창(임의 단위 a.u.)이 각각 시간과 빈도에 대해 표시되는 창이 나타납니다.
7. RIM 설정에 대한 매개 변수를 설정하려면 창 상단의 이미지 매개 변수 대화 상자 아이콘을 클릭합니다. 이미지 수집 매개 변수 창이 나타납니다. 리플렉션 이미징 설정을 위해 템플릿 탭의 드롭다운 메뉴에서 RIM을 선택합니다. 확인을 누르고 소프트웨어의 기본 창으로 돌아갑니다.
8. 메인 창에서 고정 점 스캔 아이콘을 클릭합니다. 이렇게 하면 THz 안테나가 활성화되어 입사 THz 신호를 보내고 폴리스티렌 플레이트의 단일 지점에서 반사된 THz 신호를 수신합니다.
9. 메인 창 상단의 모터 스테이지 대화 상자 아이콘을 클릭합니다. 모터 제어 창이 열립니다. 앞/후방향 화살표를 클릭하여 광 지연 축을 조정하여 메인 창의 폴리스티렌에서 반사된 펄스를 가운데에 집중시합니다.
   참고: 광학 지연 축을 조정한 후, 그림 6에나타난 바와 같이 두 개의 펄스가 창에 나타나야 한다: 폴리스티렌 플레이트의 하부 계면으로부터 하나(1차 반사), 폴리스티렌 플레이트의 상부 인터페이스(보조 반사)에서 하나.
10. 폴리스티렌 플레이트에서 기본 반사를 창 밖으로 창과 이미징 절차 동안 조직에서 반사에 기여할 것 창에 보조 반사를 유지. 이 작업은 두 단계로 이루어집니다.
    1. 먼저 기본 창 상단의 DAQ 설정 버튼을 클릭하여 DAQ 설정 대화 상자를 엽니다. 광학 지연 값을 5V(기본값)에서 4V로 변경합니다.
    2. 둘째, 이차 펄스의 최소가 가장 강할 때까지 스캐닝 스테이지에서 마이크로미터 스케일로 스캐닝 스테이지의 수직 위치를 조정합니다. 모터 제어 창에서 축의 광학 지연을 조정하여 측정되는 반사 신호의 범위를 벗어나는 기본 반사를 배치합니다.
       참고: 1.2 mm 두께의 폴리스티렌 플레이트의 경우, 보조 반사 최소 피크가 시간 도메인 윈도우의 광 지연 축에서 약 -0.3 mm일 때 1차 반사가 창 밖으로 창으로 빠져나오게 된다.

그림 6: 폴리스티렌 플레이트의 하부 및 상부 인터페이스로부터THz 반사. (A)THz 신호가 1.2 mm 두께의 폴리스티렌 플레이트로부터 반사되는 것을 사고. (B)폴리스티렌으로부터 1차 및 2차 THz 시간 도메인 신호를 측정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

11. 샘플 스테이지를 평준화하고 기준 신호를 기록합니다.
    1. 샘플 창 가장자리 근처의 폴리스티렌 플레이트의 위치를 나타내는 각 축(A축 및 B축)에서 두 점을 선택합니다. 예를 들어-15mm-15mm 범위의 A축의 경우 두 위치 포인트는 -10mm 및 10mm일 수 있습니다. -15mm-15mm범위의 B축의 경우 두 위치 지점은 -10mm 및 10mm가 될 수 있습니다.
    2. 모터 제어 대화 상자를 클릭하여 모터 제어 창을 엽니다. 모터 위치를 조정하는 동안 시간 도메인 신호가 표시되도록 모터 제어 창과 기본 소프트웨어 창을 재배치합니다. A축과 B축을 모두 0mm로 설정합니다.
    3. 다음 단계를 사용하여 A축을 평준화합니다. -10mm-10mm 범위가 예로 사용됩니다.
    4. 모터 제어 창에서A축 값을 0에서 -10으로 변경하고 Enter를 누르고 있습니다. 스테이지가 A축에서 -10mm 위치로 이동하고 메인 윈도우의 신호 위치의 변화가 관찰됩니다.
    5. 도 5B에 표시된 스캐닝 단계에서 조정 가능한 마이크로미터 스케일을 사용하여 신호의 최소 피크를 4.10.2단계에서 설정된 위치로 다시 이동합니다.
    6. A축 값을 +10으로 변경하고 enter를 누르십시오. 이제 스테이지가 -10mm 위치에서 A축의 +10mm 위치로 이동하고 신호의 시프트가 다시 관찰됩니다. 신호가 이전 위치에서 이동한 방향과 거리를 기록하고 A축 값을 다시 -10으로 변경합니다. 신호는 4.11.5 단계에서 설정된 위치로 돌아갑니다.
    7. 도 5B에 나타난 바와 같이 스캐닝 스테이지의 A축에서 레벨링 스크류를 회전시키고 신호를 원래 위치에서 이동한 것과 동일한 방향으로 두 배로 이동합니다. 스캐닝 스테이지의 마이크로미터를 사용하여 신호를 원래 위치(폴리스티렌 1.2mm의 경우 -0.3mm)로 다시 이동합니다.
    8. 반복 단계 4.11.6-4.11.7 +10 및 -10의 신호가 같을 때까지 두 위치의 피크가 원래 위치(광축에서 -0.3 mm)에 집중될 때까지 반복합니다.
12. A축의 평준화가 완료되면 A축 값을 0으로 변경하고 B축에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 먼저 모터 제어 창의 B축 값을 0에서 가장 양수 값(예: +10mm)으로 변경합니다. 또한, 수평화하는 동안, 도 5B에도시된 스캐닝 스테이지의 B축에 수평 나사를 사용한다.
13. 두 축이 모두 수평이 되면 A축과 B축을 모두 0mm로 되감고 모터 제어 창을 닫고 신호가 약간 이동하는 경우 신호가 원래 위치에 있는지 확인합니다.
14. 이 신호를 참조로 기록합니다.
    1. 설정된 DAQ 속성 창으로 이동합니다. 평균 값을 5로 변경하고 다른 모든 매개 변수를 기본값으로 유지합니다.
    2. 새 참조를 클릭합니다. 창 오른쪽 상단의 평균 카운터는 0-20으로 계산됩니다. 카운터가 20에 도달하면 평균 값을 1로 변경하고 확인을클릭합니다. 폴리스티렌에서 반사 된 신호는 나중에 찍은 모든 스캔에 대한 참조로 저장됩니다.
       참고 : THz 이미징 절차만 수행되어야하는 경우 DMEM 용액에서 종양 조직을 복용하기 전에 4.3-4.14 단계를 수행하는 것이 가장 좋습니다.
15. 주사 단계 창을 덮는 폴리스티렌 플레이트에 종양을 장착하십시오.
    1. 스캐닝 단계에서 이미징 창을 제거하고 조직 처리 부위로 가져 오십시오. 그림 4B와같이 폴리스티렌 플레이트에 종양을 놓습니다.
    2. 플레이트와 종양 사이에 유의한 기포가 없는지 확인하십시오. 기포가 관찰되면 핀셋으로 종양을 누르거나 종양을 들어 올리고 공기 간격이 최소화 될 때까지 폴리스티렌에 부드럽게 굴립니다.
    3. 그림 4B와같이 시험 샘플 주위에 일정한 간격으로 흡수 스페이서를 놓습니다. 종양 위에 또 다른 폴리스티렌 플레이트를 놓고 종양 표면을 가능한 한 평평하게 만들기 위해 부드럽게 누릅니다. 샘플 창에이 폴리스티렌 - 종양 - 폴리스티렌 배열을 테이프.
16. 그림 4C와같이 샘플 창을 뒤집고 종양의 사진을 찍어 방향의 기록을 유지합니다. 종양이 있는 샘플 창을 스캐닝 단계로 되돌려 줍니다.
17. 이미지 매개 변수 대화 상자 버튼을 클릭하여 이미지 수집 매개 변수 창을 엽니다. 이미징 창에서 종양의 위치를 완전히 동봉하도록 Axis1min, Axis1max, Axis2min및 Axis2max값을 설정합니다.
    주: 기본적으로 축1은 A축이고 축2는 B축입니다.
18. 이미징 스캔을 위해 Axis1step 및 Axis2step을 0.2mm로 설정합니다.
    주: Axis1step 및 Axis2step을 설정하면 스캐닝 프로세스 중에 스테퍼 모터의 스텝 크기가 200μm 증분으로 설정됩니다. 총 스캔 시간은 이미지 수집 매개 변수 창에서 추정할 수 있습니다.
19. 기본 창에서 측정 탭을 클릭하고 Flyback 2D 스캔 옵션을 선택합니다. 팝업 창에서 검색 데이터를 저장할 디렉토리 및 파일 이름을 지정합니다.

5. 조직 병리학 절차 준비에 신선한 조직을 후처리

1. 스캐닝 프로세스가 완료되면 핵심 THz 시스템에서 샘플 창, 폴리스티렌 플레이트 및 샘플을 제거하고 유해 폐기물로 지정된 영역으로 이동합니다. 폴리스티렌 플레이트에서 종양을 제거하고 종양과 비슷한 크기의 평평한 판지 위에 놓습니다. 이미징 얼굴이 판지만지고 있는 폴리스티렌의 방향이 폴리스티렌과 동일한지 확인하십시오.
2. 면봉을 붉은 조직 염료에 담그고 종양의 가장자리가 판지와 접촉하는 곳까지 종양의 왼쪽을 얼룩지게하십시오. 유사하게, 청색 조직 염료로 종양의 오른쪽을 얼룩. 도 7A에나타난 바와 같이, 붉은 얼룩을 청색 얼룩에 연결하는 노란색 조직 염료라인으로 종양의 노출된 표면을 염색하여 시료의 뒷면을 나타내고 있다.
   참고: 잉크가 포르말린 용액에 얼룩을 지도록 하려면 얇은 층만 조직에 바하십시오. 이것은 조직을 염색하기 전에 다른 표면에 면봉을 두드리거나 깨끗한 면봉을 사용하여 여분의 염료를 닦아 낼 수 있습니다. 염료가 피부나 의류에 닿지 않도록 하십시오. 이 종양 염색 프로세스는 종양의 화상 진찰 측및 병리학자에 그것의 방향에 관하여 정보를 제공하기 위하여 참조로 행해지다.

그림 7: THz 이미징 후 종양에 대한 사후 처리. (A)종양을 판지 홀더에 아래로 향하게 놓고 조직 표시 염료로 염색했습니다. (B)종이를 종양 위에 놓고 테이프로 붙인 후 접촉을 유지합니다. (C)10% 중성 완충 포르말린 용액에 침지된 골판지상에 스테인드 종양을 고정시키고 파라필름으로 밀봉하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 잉크를 약 3-4분 동안 말리게 하십시오. 그림 7B와같이 종양에 놓고 필터 용지와 판지 주위에 테이프 조각을 완전히 감쌉니다. 테이프와 여과지는 큰 압력을 가하지 않고 판지에 종양을 고정해야합니다.
4. 도 7C와같이 10% 중성 완충 포르말린 용액에 판지에 부착된 스테인드 티슈를 침지하고 파라핀 필름을 사용하여 원심분리튜브를 밀봉한다. 튜브 라벨에 샘플에 대한 샘플 번호, 날짜, 조직 유형 및 종양 번호를 지정합니다. 추가 조직 병리학 처리를 위해 병리학자에게 종양을 보냅니다.

6. 유해 폐기물 처리

1. 그림 8과같이 트레이를 덮고 새로운 생물학적 위험 가방에 넣는 데 사용되는 생체 위험 봉투와 함께 조직 처리 트레이에서 모든 폐기물을 수집합니다. 가방을 건물의 지정된 생물학적 유해 폐기물 구역으로 가져와 폐기물 수거를 위해 환경 보건 및 안전(EH&S) 부서에 약속을 지정합니다. 10% 표백제 용액과 에탄올로 티슈 처리 트레이와 주변 부위를 청소합니다.

그림 8: 생체 유해 폐기물 봉투의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 스페이서와 석영 창, 종양이 장착된 샘플링 창, 폴리스티렌 플레이트 및 실험실 핀셋을 세척 영역으로 가져 가라. 모든 재료를 물로 헹구고 10% 표백제를 헹구고 필요에 따라 종이 타월로 닦아 조직 이물질을 제거하십시오. 물로 다시 헹구고, 알코녹스 용액으로 문지르고, 완전히 헹구세요. 유리 및 플라스틱 제품의 경우, 70% 이소프로필 알코올로 헹구고 건조시키기 위해 따로 두십시오.
   참고: 종양이 포르말린에 있고 견본 공간이 깨끗해지면, 데이터 처리는 화상 진찰 또는 나중에 같이 처리될 수 있습니다.

7. THz 이미지를 구성하는 데이터 처리

1. THz 시스템에서 저장된 .tvl 데이터 파일을 내보냅니다. 시스템에서 얻은 원시 데이터 파일은 파이썬으로 작성되며 MATLAB 데이터 파일로 저장하기 전에 파이썬에서 읽는 것이 가장 좋습니다.
2. 스캔된 신선한 조직의 THz 이미지를 구성하려면 원시 데이터 매트릭스의 세 번째 차원(즉, 시간 차원)에서 푸리에 변환을 사용하여 원시 시간 도메인 반사 이미징 데이터를 주파수 도메인으로 변환합니다. 또한 참조 데이터의 푸리에 변환을 수행합니다.
   참고: 일반적인 주파수 도메인 스펙트럼은 0.1THz-4THz범위의 데이터를 제공해야 합니다.
3. 다음 방정식^19를사용하여 샘플 데이터를 참조 데이터로 정규화하고_주파수 범위에 걸쳐 정규화된 데이터의 통합을 기반으로₂ 전력 스펙트럼을 수행합니다.
   
   참고: 여기서 E_샘플은 조직 샘플의 주파수 영역 반사 이미징 데이터및 E_{레퍼런스는} 기준 신호의 단일 포인트 반사 데이터의 주파수 도메인이다.
4. A축 및 B축으로 정의된 행렬의 각 지점에서 계산된 전력 스펙트럼 데이터를 플로팅하여 2차원 이미지를 구성합니다. 이를 전력 스펙트럼 THz 이미지라고 합니다.
   참고: 대신 단면 THz 이미지를 얻는 방법은 단계 7.5-7.7에 자세히 설명되어 있습니다.
5. 특성화의 경우 다음 수학식^18을사용하여 잠재적 조직 특성 범위에 대한 이론적 주파수 의존성 반사를 계산합니다.
   
   참고: 여기서 _T,ij는 영역 i와 영역 j;d_j 사이의 복잡한 프레넬 반사 계수가 영역 j의 두께이며 θ_j는 Snell의 법칙에 의한 입사각과 관련된 영역 j에서 전파의 각도입니다. 영역 j의복잡한 전파 계수는 ω이 각도 주파수이고, c는 진공 에서 빛의 속도이며, n_j는 굴절률의 실제 부분이며, α_{abs, j는} 흡수 계수^18입니다. 영역 1은 공기이고, 영역 2는 폴리스티렌 플레이트이고, 영역 3은 조직이다.
6. 영역3(n₃ 및 α_abs,3)에대한 사용자 정의 굴절률 및 흡수 계수 범위에 대한 방정식 2의 반사를 계산하고 각 지점에서 측정된 신호와 비교하여 크기 및 위상에 대한 결합된 평균 제곱 오차를 계산합니다.
   참고: 굴절률 및 흡수 계수에 대한 해결책은 가장 낮은 오차를 제공하는 값 쌍입니다.
7. 각 픽셀에서 추출된 굴절률 및 흡수 계수데이터(n3₃ 및 α_abs,3)에서토모그래피 THz 이미지를 구성합니다. 병리학자로부터 얻은 병리학 슬라이드 이미지와 비교하여 종양 부위를 분석합니다. 대표적인 결과는 도 9에나와 있으며, 도 10 및 도 11의프로토콜 준수가 부족한 예와 함께.

8. 전송 분광학 데이터를 사용하여 조직의 전기적 특성 추출

1. THz 전송 분광법 측정 소프트웨어의 메인 창에서 파일 탭으로 이동하여 내보내기 옵션을 클릭합니다. 내보낼 데이터 유형 및 샘플을 선택하려면 창이 나타납니다. 석영 및 조직 시료 측정을 위한 투과 및 투과 단계 데이터 유형을 선택합니다.
2. 다음 방정식^15를사용하여 잠재적 조직 특성의 범위에 대한 이론적 주파수 의존 적 전송을 계산합니다.
   
   참고: 다음은 샘플 및 참조 설정에 대한 프레넬 전송 계수 간의 비율입니다. _γ1 및 _γ3는 각각 공기와 조직의 복합전파 상수; 및 d는 조직의 두께입니다. 일반적으로 전파 상수는 로 정의됩니다. ñ는 n이 굴절률의 실제 부분인 복합 굴절률로 정의된 것입니다. c는 빛의 속도입니다. ω은 각도 주파수입니다. 및 α_복근은 흡수 계수^15입니다.
3. 방정식 3에서 전송의 크기와 위상과 사용자 정의 n 및 α_abs 값 범위에 대한 시스템의 측정 데이터 사이의 결합된 평균 제곱 오차를 계산합니다.
   참고: 굴절률 및 흡수 계수에 대한 해결책은 가장 낮은 오차를 제공하는 값 쌍입니다.
4. 추출된 굴절률 및 흡수 계수 데이터를 0.15-3.5 THz의 주파수 범위에 대해 Figure 12플롯합니다.

상기 인간 유방암 종양 시편의 전술한 프로토콜에 따라 수득된 THz 이미징 결과18은 #ND14139 바이오뱅크로부터 수신된 도 9에제시되어 있다. 병리학 보고에 따르면, #ND14139 종양은 왼쪽 유방 요추 절제술 수술 절차를 통해 49 세 여성에게서 얻은 I /II 등급 침투 덕트 암 (IDC)이었습니다. 종양의 사진은 도 9A에도시되어, 도 9B에서병리학 적 이미지, 및 프로토콜에서 수학식 1을 사용하여 얻은 THz 전력 스펙트럼 이미지는 도 9C에도시되어 있다. 병리학 심상의 평가는 오클라호마 주립 대학에 우리의 컨설팅 병리학자에 의해 행해졌습니다. 병리학 이미지와 THz 이미지를 상호 연관시킨 후, 암 영역(즉, 도 9C의적색 영역)이 지방 영역(즉, 도 9C에서청색 영역)보다 더 높은 반사를 보였다는 것이 분명했다. 도 9C에서 암 부위의 중심에 가까운 청색 원은 이미징 과정 동안 종양 아래에 기포가 존재하기 때문이었다.

상기 논의된 모델을 이용하여 수득된 종양의 전기적 성질에 기초한 단층 촬영 이미지(총 2,477픽셀)도 제시된다. 흡수계수(cm-1)데이터(α-image) 및 빈도 0.5 THz 및 1.0 THz에서 수득된 종양의 굴절률(n-image) 데이터를 기반으로 하는 토모그래피 이미지는 각각 도n Figure 99D, 9E, 9F,및 9G에나타내었다. 빈도가 증가함에 따라 암 및 지방 픽셀에 대한 계산된 흡수계수(cm-1)값이 증가하였고, 암 픽셀은 두 주파수에서 지방보다 더 높은 값을 나타낸다. 대조적으로, 두 조직의 굴절률은 주파수가 증가함에 따라 감소하였다. 측정된 단계는 주파수가 증가함에 따라 이미징 단계 레벨링, 폴리스티렌 플레이트 두께 및 스테퍼 모터 지터에서 마이크로미터 스케일 의 변화에 따라 달라졌다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 도 9E 및 9G에서 관찰된 수평 선은 스캐닝 공정 동안 스테퍼 모터에 의해 도입된 작은 위상 시프트에 기인하였고, 이는 낮은 주파수에서 관찰되지 않았다.

그림 9: THz 화상 진찰 기술을 사용하여 #ND14139 유방암 종양의 분석. (A)종양 사진. (B)종양의 저전력 병리학 이미지. (C)주파수 범위에 대한 THz 전력 스펙트럼 이미지 0.5 THz-1.0 THz.(D)THz 토모그래피 흡수 계수 이미지는 0.5 THz에서 획득하였다. 이 이미지는 종양의 원시 반사 이미징 데이터로부터 각 픽셀에서 추출된 흡수 계수 데이터를 사용하여 구성되었다. (e)0.5 THz에서 얻은 흡수 계수이미지(F)굴절률 이미지(n-image).n 이 이미지는 종양의 원시 반사 이미징 데이터로부터 각 픽셀에서 추출된 굴절률 데이터를 사용하여 구성되었다. (G)굴절지수 이미지(n-image)는 1.0THz에서 획득하였다.n18 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 9에서 논의된 THz 결과는 기재된 프로토콜을 성공적으로 따로 따로 따로 구했다. 조직의 불충분 한 처리 오해의 소지가 이미징 결과로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 인간 유방암 종양에 대한 도 10의 THz 이미징 결과는 불충분한 건조의 효과를 보여 #ND10405. 도 10A28에 도시된 병리학 이미지와 상관관계가 없는 높은 반사를 가진 도 10B28에서 종양의 THz 전력 스펙트럼 이미지를 지배한 조직 내의과잉 DMEM 용액.28 이것은 종양에 있는 암의 더 큰 존재를 건의하는 거짓 양성 결과로 이끌어 냈습니다. DMEM은 도 10C19 및10D 10D19에서볼 수 있듯이 물에 유사한 높은 굴절률 및 흡수 계수를 나타내므로 이미징 전에 종양을 적절하게 건조하는 것이 좋습니다.

도 10: 여과지를 사용하여 건조하지 않고 DMEM 용액에서 채취한 종양 이미징에 미치는 영향. (A)종양의 저전력 병리학 이미지 #ND10405. (B)종양의 전력 스펙트럼 이미지는 주파수 범위 0.5 THz-1.0 THz를 통해 #ND10405.(C)DMEM, PBS 및 0.15 THz-3.5 THz에 이르는 물에 대한 전송 굴절률 플롯(D) 전송 흡수 계수(cm-1) DMEM용 플롯, PBS, 및 0.15 THz-3.5 THz. 도 10A에서배열 하는 물, 10B는 T. Bowman 등 에서 다시 게시28 IEEE 및 그림 10C,그림 10D는 IOP 출판의 허가와 함께 N. Vohra 외19에서 다시 게시, 주식 회사는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. D–1

도 11에서종양 #ND11713 대한 프로토콜에 대한 불충분한 준수의 또 다른 예가 도시되어 있다. 이 경우, 폴리스티렌 플레이트와 종양 사이의 기포는 이미징 절차를 위해 판상에 종양을 놓았을 때 제거되지 않았다. 이로 인해 그림 11B의THz 이미지에서 낮은 반사 지점이 여러 개 발생하여 도 11A의병리학과 정확한 비교가 방지되었습니다. 따라서, 판에 종양을 놓은 후에 기포가 관찰되면 핀셋으로 누르거나 종양을 들어 올리고 공기 가공을 제거 할 때까지 폴리스티렌에 부드럽게 굴립니다.

그림 11: 폴리스티렌 플레이트와 종양 사이에 기포가 존재하여 THz 이미지의 아티팩트. (A)종양 의 저전력 병리학 이미지 #ND11713. (B)0.5-1.0 THz의 주파수 범위에 걸쳐 종양 #ND11713 THz 전력 스펙트럼 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

동일한 샘플에 대한18 전송 분광법 결과 18(#ND14139)은 도 12에제시되어 있다. 종양 절편은 포인트 및 도 12A에서 취해졌으며 프로토콜을 따르는 것을 특징으로 한다. 선택된 두 점은 도 12B의병리학 적 이미지에 따라 종양에서 암 조직 영역으로부터 취수되었다. 두 종양 섹션에 대한 추출된 흡수 계수 및 굴절률은 도 12C,D에제시되어 있다. 두 점 모두 전체 주파수 범위에 대해 양호한 합의를 보였다. 도 12C 및 도 12D에서 0.15-2 THz의 검정 곡선은 문헌23으로부터 얻은 데이터를 나타내어 당사 작업에서 얻은 결과를 비교한다.

도 12: THz 투과 분광법을 사용하여 유방암 종양의 특성이 #ND14139. (a)두 개의 선택된 점이 표시된 종양의 사진과 종양의 0.5 mm 두께의 단면을 투과 분광법 측정을 위해 절단하였다. (B)종양의 저전력 병리학 이미지. (C)전송 흡수 계수 (cm-1)포인트 및 0.15-3.5 THz의 범위플롯. (D)전송 굴절률 플롯은 0.15~3.5THz의 지점에서 및 . 그림 T. Bowman외. 18 SPIE의 허가와 함께 다시 게시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.