아실-레신 보조 포획을 이용한 단백질 S-아실레이션 검출

S-아실화는 비질 티오에스터 결합^1을통해 표적 단백질상에 지방 아실 사슬을 내부 시스테인 잔류물로 첨가하는 가역적 번역 후 변형이다. 그것은 먼저 팔미네이트와 단백질의 수정으로 보고 되었다, 포화 16 탄소 지방산^2,따라서이 수정 은 종종 S-팔미토일화라고. 팔미네이트 이외에, 단백질은 다양한 길고 짧은 포화 (myristate 및 stearate), 단일 불포화 (oleate) 및 고도 불포화 (아라키도네이트 및 에이코사펜타노에이트) 지방산^{3,4,4,5,,6,,7에}의해 가역적으로 변형 될 수 있다. 진핵 세포에서, S-아실화는 DHHC 단백질 아실트랜스퍼라제로 알려진 효소의 가족에 의해 촉매되고 시스테인 탈아실화의 역반응은 단백질 티에스테르아제에 의해 촉매화되며,⁸대부분은 여전히 수수께끼8로 남아 있다.

티오에스터 결합의 lability는 이 지질 변형을 가역적으로 만들어, 동적으로 단백질 군집화, 혈장 막 국소화, 세포내 인신 매매, 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 안정성^9,,10. 결과적으로, S-아실레이션은 헌팅턴병, 알츠하이머병 및 여러 유형의 암(전립선, 위, 방광, 폐, 대장암)을 포함하는 여러 장애와 관련이 있으며, 이는 이러한 번역 후 단백질 변형을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법의 개발이 필요하다^11.

방사성 물질^([3H],^[14C] 또는^[125I])을 가진 대사 표지는 S-아실화 단백질 을 분석하기 위해 개발된 첫 번째 접근법 중^{하나였다(12,,13,,14.} 그러나, 방사성 표지 기반 방법은 건강 문제를 제시하고, 매우 민감하지 않고, 시간이 오래 걸리며, 고도로 풍부한 단백질의 지질만^{검출한다 15.} 방사성 표지에 대한 더 빠르고 비방사성 대안은 단백질 S-아실레이션^16의역학을 분석하기 위해 일상적으로 사용되는 생체 부착 지방산 프로브로 대사 라벨링입니다. 이 방법에서, 화학 리포터(알킨 또는 아지드기)를 가진 지방산은 단백질 아실트랜스퍼라제에 의해 S-아실화 단백질내로 통합된다. 아지드-알키젠 후이스겐 사이클로첨가반응(click chemistry)은 불소 또는 비오틴과 같은 기능화된 군을 부착하여, S-아실화^{단백질(17,,18,,19)의}검출을 허용하는 통합 지방산에 부착하는데 사용될 수 있다.

아실-비오틴 교환(ABE)은 조직^시료에대한 부적합성과 같은 대사 라벨링의 단점 중 일부를 우회하는 S-아실화성 단백질의 포획 및 동정을 위해 광범위하게 사용되는 생화학적 방법 중 하나이다. 이 방법은 조직 및 냉동 세포 시료^20,,21을포함하는 다양한 범위의 생물학적 샘플에서 S-아실레이션의 분석을 위해 적용될 수 있다. 이 방법은 중성 하이드록실라민에 의한 아실기와 시스테인 잔기 사이의 티오에스터 결합의 선택적 절단에 기초한다. 해방된 티올 그룹은 티올 반응성 비오틴 유도체로 포획됩니다. 생성된 생체면역단백질은 스트렙타비딘 아가로오스를 사용하여 친화도 정제되고 면역블로팅에 의해 분석된다.

아실-수지 보조 포획(Acyl-RAC)이라는 대안적인 접근법은 나중에 티올-반응성^{수지(22,,23)에}의한 자유 시스테인의 직접적인 접합으로 생체측화 단계를 대체하기 위해 도입되었다. 이 방법은 ABE에 비해 단계가 적고 유사하게 광범위한 샘플^1에서단백질 S-아실화를 검출하는데 사용될 수 있다.

아실-RAC는 4개의 주요 단계로 구성되어있습니다(그림 1),
1. 무료 티올 그룹의 차단;
2. 시스테인-아실 티에스터 결합과 중성 하이드록실라민(HAM)의 선택적 절단은 시스테인 티올 기를 노출시키는;
3. 티올 반응성 수지로 지방 시스테인을 포착;
4. 완충제를 줄이면서 용출 후 S-아사이클화 단백질의 선택적 농축.

포획된 단백질은 다양한 범위의 종 및^,조직^{22,,24,25에서}S-아실화 프로테오메를 평가하기 위해 면역블롯팅 또는 질량분광법(MS) 기반 프로테오믹스를 실시하여 분석될 수 있다. 개별 적인 S-아실화 부위는 또한 LC-MS/MS^22에의한 생성된 펩티드의 포착된 단백질및 분석의 트립신 소화에 의해 확인될 수 있다. 여기에서, 우리는 아실-RAC가 세포주 및 조직 샘플 모두에서 다중 단백질의 S-acylation의 동시 검출을 위해 사용될 수 있는 방법을 보여줍니다.

이 프로토콜에 사용된 마우스는 NIH 지침에 따라 안락사되었다. 휴스턴에 있는 텍사스 건강 과학 센터의 동물 복지 위원회는 모든 동물 일을 승인했습니다.

1. 세포 리세이츠의 준비

1. 표 1에설명된 대로 라시스 버퍼를 준비합니다. PBS 의 10 mL에, n-도데실 β-D-말토 사이드 세제 (DDM)의 0.1 g을 추가하고 용해하기 위해 회전. 100 μL의 인산염 억제제 칵테일 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) 및 프로테아제 억제제 칵테일 (1x)을 추가하고 사용하기 전에 얼음에 버퍼를 식힙니다.
2. 인큐베이터에서 세포를 함유하는 필수 매체를 15 mL 또는 50 mL 원엽 튜브로 전달하고 350 x g에서 5 분 동안 스핀 셀을 5 분 동안 흡입하여 세포 파편을 제거합니다.
   참고: 각 아실-RAC 반응에 대해 1 x 10^{x 10 7} 셀을 사용했습니다.
3. 5 mL의 PBS에서 다시 중단하고 5 분 동안 350 x g에서 회전하여 펠릿을 씻으십시오.
   참고 : PBS에서 확장 된 배양으로 인한 세포 포해를 피하기 위해 1.3 단계를 신속하게 수행하십시오.
4. 1.1단계에서 제조된 용해 완충액 600 μL을 펠릿에 넣고 4°C에서 30분 동안 열 셰이커에서 1500 rpm에서 흔들어 서 서 용해합니다.
5. 4 °C에서 20,000 x g에서 30 분 동안 펠릿 세제 불용성 물질에 원심 분리하여 제거합니다. 미리 냉각 된 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브에서 제거 된 용해액을 수집하고 얼음에 보관하십시오.
6. 브래드포드/BCA 분석기를 수행하여 단백질 농도를 추정합니다. 실험을 수행하기 전에 다른 샘플에서 동일한 양의 단백질을 확인하는 것이 중요합니다. 반응당 적어도 500 μg의 단백질을 사용하는 것이 좋습니다.
   참고: 설명된 실험에서, 우리는 쥐 조직에서 배양된 (Jurkat) 세포 및 1 차적인 비장세포를 사용했습니다. 전술한 상기 의 해방법은 다른 세포 유형에도 채택될 수 있다. 전술한 세포 유형에 대해 수득된 평균 단백질 농도는 1 x 10⁷ 세포 당 약 500 μg이다. Jurkat 세포는 RPMI-1640 배지에서 2 mM L-글루타민, 10 mM HEPES, 1 mM 나트륨 피루베이트, 4,500 mg/L 글루코스, 및 1,500 mg/L 중탄산나트륨을 37°C에서 10% FBS와 5%_CO2로보충하여 정제하였다. 우리는 반응 당 1 x 10⁷ Jurkat 세포를 사용했습니다. 1차 비장세포는^{기재된 바와}같이 마우스 비장 조직으로부터 분리되었다 26. 간단히, 비장 조직은 얼음에 macerated했다, 저혈압 용액적혈구의 용해 와 원심 분리에 의해 림프구에서 분리. 우리는 반응 당 1 x 10⁷ 1 차 적인 세포를 사용 했습니다.

2. 아실-RAC: 무료 티올 그룹 차단

참고: 모든 후속 단계는 실온(RT)에서 수행할 수 있습니다.

1. 용해액을 신선한 1.5 mL 마이크로퍼지튜브로 옮기고 아래에 설명된 바와 같이 클로로포름 메탄올(CM) 침전을 수행한다.
   1. 메탄올(MeOH) 및 클로로포름(CHCl_3)을리세이트의 최종 비율로 리액수에 첨가합니다: MeOH: CHCl₃ 의 2:2:1 및 균질한 현탁액을 만들기 위해 힘차게 흔들어주세요.
   2. 수성 및 유기 상 사이의 중간 상에서 펠릿 ("팬케이크")를 형성하기 위해 5 분 동안 10,000 x g에서 회전하십시오.
   3. 바늘 이나 젤 로딩 팁을 사용 하 여 가능한 한 많은 용매를 튜브를 기울입니다.
   4. 단백질 펠릿을 몇 분 동안 건조시키고 MeOH 600 μL을 추가하고 펠릿이 부서지지 않도록 부드럽게 혼합하여 부드럽게 씻어냅니다.
   5. 나머지 MeOH를 조심스럽게 제거하고 벤치탑에서 약 5분 동안 단백질 펠릿을 건조시면 됩니다.
   6. (선택 사항) 추가원심분리 단계를 수행하여 MeOH 세척 후 깨진 펠릿을 스핀다운하여 시료 손실을 방지합니다.
      참고: 실험은 CM 강수 단계 후에 중지될 수 있다. 펠렛이 수득되면, 최대 1주일까지 -20°C에서 500 μL의 MeOH에 저장될 수 있다.
      1. 펠릿이 용해될 때까지 열 셰이커에서 42°C/1500 rpm에서 와르싱하여 2SHB 완충제의 200 μL에서 단백질 펠릿을 용해시면 됩니다.
   7. (선택 사항) 초음파 처리 수조에서 추가로 5-10 분 동안 배양하여 펠릿을 용해시다.
      참고 : 초음파 처리의 길이는 재료의 용해도에 따라 다릅니다. 그러나 장기간 초음파 처리는 단백질 저하를 일으킬 수 있습니다.
2. 2SHB 완충액의 998 μL에 MMTS의 2 μL을 추가하여 2SHB에서 0.2% 메틸 메탄티오술포네이트(MMTS)(v/v)를 준비합니다.
   참고: 각 실험에 대해 갓 준비한 0.2% MMTS를 사용하십시오.
3. 각 튜브에 2SHB에 0.2% MMTS의 200 μL을 추가하여 최종 농도0.1% MMTS를 추가합니다. 42°C에서 15분 동안 인큐베이션하고 열 셰이커에서 1500 rpm에서 흔들어 줍니다.

3. 아실-RAC: 하이드록실라민(HAM) 절단 및 S-아실화 단백질 포획

1. MMTS를 제거하기 위해 위에서 설명한 바와 같이 3-4x CM 강수량을 반복합니다. MMTS의 제거는 MMTS의 뚜렷한 냄새의 부족에 의해 추정될 수 있습니다. 각 침전 후, 펠릿이 용해될 때까지 열 셰이커에서 42°C/1500 rpm에서 소용돌이치면서 2SHB 완충액의 100 μL에 펠렛을 용해시키고 300 μL의 완충액 A로 희석합니다.
2. 최종 침전 후, 위에서 설명한 바와 같이 2SHB 완충액의 200 μL에서 샘플을 용해시키고 완충A의 240 μL로 희석한다.
3. 여러 치료 조건에 반응하여 S-아실화의 변화를 비교하는 경우, 단백질 농도를 다시 측정하고 각 조건에 대해 동일한 양의 단백질을 진행합니다.
4. 입력 제어로 각 샘플에서 40 μL을 유지합니다.
5. 샘플을 200 μL의 두 개의 동등한 부분으로 분할하고 튜브를 "+ HAM" 및 "- HAM"으로 표시합니다. 50 μL의 갓 제조된 중성 2 M HAM(pH 7.0-7.5)을 튜브 중 하나에 400 mM의 최종 농도(+HAM) 및 50 μL의 중성 2 M NaCl을 제2 튜브(-HAM)에 첨가하여 음극 대조군으로 사용할 것이다. 티오프로필-세파로스(TS) 비드를 첨가한다.
   참고: CM 강수 단계 중 임의의 실험이후에 실험을 중단할 수 있다. 펠렛이 수득되면, 최대 1주일까지 -20°C에서 500 μL의 MeOH에 저장될 수 있다. 2 M HAM의 중성 pH는 아실 시스테인 티오에스터 결합에 대한 선택성을 보장하고 신중하게 조정해야합니다. 과도한 발포로 인한 시료 손실을 방지하기 위해 2SHB 버퍼에서 시료를 취급할 때주의를 기울여야합니다. HAM 및 + HAM 샘플 - 다음 단계는 모두 동일합니다.
6. 각 튜브에 30 μL의 TS 비드 슬러리를 추가하고 RT에서 튜브를 1-2 시간 동안 회전시다.
7. TS 비드를 버퍼 A에서 1% SDS로 4x 세척하여 잔류 HAM을 제거합니다.
   1. 1분 동안 마이크로 퍼지를 사용하여 모든 구슬 샘플을 부드럽게 스핀다운하고 상월체를 조심스럽게 흡인합니다.
   2. 버퍼 A에서 1% SDS의 500 μL에서 비드를 다시 일시 중단합니다.
   3. 3.7.1-3.7.2세를 반복합니다.
      참고: 활성화된 티오프로필-세파로스(TS)는 커플링 전에 중성 pH로 세척해야 하는 첨가제의 존재 하에서 동결 건조로 공급됩니다. 붓기와 세척에는 증류수를 권장합니다. 0.1 g의 구슬을 계량하고 증류수 1 mL에서 다시 중단하고 RT에서 30 분-1 시간 동안 회전하면서 팽창 할 수 있습니다. 버퍼 A로 구슬 1 을 씻고 버퍼 A로 슬러리를 50 % 정착 된 중간에서 50 % 버퍼로 준비하십시오. 부어 오른 TS는 4°C에서 최대 1주일까지 20% 에탄올의 존재 속에서 중성 pH에 저장될 수 있다. 아지드 이온이 2-피리딜 이황화물 기와 반응하기 때문에 아지데 나트륨을 정균제로 사용하지 마십시오. 더 높은 효율성을 위해 신선한 구슬을 준비하십시오. 구슬을 취급하는 동안 P200 파이펫 팁의 끝을 약간 절단하여 손상을 방지할 수 있습니다.
      참고: 실험은 CM 강수 후 모든 단계에서 중지할 수 있습니다. 펠릿은 최대 1주일까지 -20°C에서 MeOH의 500 μL에 보관될 수 있다.

4. 용출 및 S-아실화 단백질 검출

1. 마지막 세척 후, 위에서 설명한 대로 구슬을 부드럽게 스핀 다운하고 구슬을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상급제를 흡인합니다.
2. DTT를 사용하여 4x SDS 샘플 버퍼로 구슬에서 단백질을 회수합니다.
   1. 50 μL의 4x SDS 샘플 버퍼를 구슬에 넣고 열 셰이커에서 15분 동안 80°C, 1500rpm에서 배양합니다. 튜브를 식힙니다.
   2. 5,000 x g에서 3분 동안 구슬을 원심분리하여 구슬을 완전히 펠렛하고 용출된 단백질을 젤 로딩 팁을 사용하여 신선한 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
3. SDS-PAGE를 실행하고 서쪽 블로팅에 의한 관심 단백질의 S-아실화를 분석합니다.

전술한 프로토콜에 따라, 우리는 먼저 아실-RAC를 사용하여 주캇 세포에서 여러 단백질의 S-acylation을 동시에 검출하인, T 세포 백혈병 환자27의말초 혈액으로부터 유래된 불멸의 T 세포주를 검출하였다. 이전에 S-아실화9,,28,,29로 확인된 조절T 세포 단백질은 이 방법의 유용성을 입증하기 위해 선택되었다. 도 2A에도시된 바와 같이, 티로신 키나아제 Lck는 중성 2M 하이드록실라민으로 처리된 라이세트에서 검출되어 시스테인 잔기와 지방산 잔기 사이의 티에스터 결합을 갈라낼 수 있다(+HAM lane). 2M NaCl(-HAM 레인)으로 처리된 샘플은 티오에스테르 결합의 검출을 위한 분석법의 선택성을 나타내는 중요한 음성 대조군을 나타낸다. 입력 차선은 신호의 특이성을 더욱 확증하고 관심 있는 단백질이 S-아실레이트가 아닌 경우 양성 대조군역할을 할 수 있다. 그 후 멤브레인을 단백질 Fyn 및 LAT에 대한 항체로 벗겨내고 재프로브하여 아실-RAC 분석제가 동시에 다중 단백질의 S-아실화를 분석하는데 사용될 수 있음을 입증하였다(도2A).

조직 샘플에서 단백질 S-아실화를 검출하는 이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 우리는 마우스 비장에 아실-RAC 프로토콜을 적용하였다. 도 2B에도시된 바와 같이, Lck, Fyn 및 LAT의 S-아실화는 이러한 변형이 두 종 사이에서 보존됨을 나타내는 1차 마우스 비장세포에서 용이하게 검출될 수 있다.

그림 1. 아실-RAC의 개략적 표현. 이 방법은 4개의 주요 단계로 구성되어 있습니다: (1) 메틸 메탄티오설포네이트(MMTS)를 가진 자유 티올 기를 차단하고, (2) 시스테인-아실 티에스터 결합을 중성 하이드록실라민(HAM)과 선택적 절단으로 차단하여 시스테인 티올 기를 노출시키는 단계, (3) 새로 노출된 시스테인 티올을 티올 반응성 수지와 직접 컨쥬게이션하고 (4) 감소용용용액 완충제를 사용하여 포획된 단백질의 회수, 면역블롯 또는 MS 분석을 통해 단백질을 포획한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. S-아사이클화 단백질 검출. 아실-RAC 분석기는 Jurkat T세포(A)및 뮤린 비장조직(B)에서T 세포 신호 단백질의 S-acylation을 검출하는 데 사용되었다. Lck-, Fyn- 및 LAT 특이적 항체를 가진 면역블롯질은 하이드록실라민 처리 샘플(+ HAM lane)에서 이들 단백질의 S-아실화를 나타낸다. 염화나트륨(-HAM 레인)으로 처리된 시료는 음성 대조군역할을 한다. 처리되지 않은 라세이트는 입력 레인에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 프로토콜에 필요한 일반적으로 사용되는 버퍼의 버퍼 구성. 2SHB 버퍼 및 버퍼 A는 사전에 준비할 수 있지만 pH는 정기적으로 확인해야 합니다. 라시스 버퍼와 HAM은 실험당일에 준비되어야 한다.

이해 상충이 선언되지 않았습니다.