이 프로토콜은 시분큘러스 누두스 coelomic 유체에서 표적 유전자의 mRNA 발현 수준 및 공간 패턴을 검출하는 situ 혼성화 접근법에 효과적인 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
기업에서 혼성화(ISH)는 조직에서 특정 유전자(예를 들어, mRNA 및 ncRNA)의 세포 분포 패턴을 제시하는 매우 유익한 기술이다. 시펀큘리드 웜 시분큘러스 누두스는 영양및 약용 가치가 높기 때문에 중요한 어업 자원입니다. 현재, Sipunculus nudus의 분자 생물학에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 이 문서의 목적은 시분큘러스 누두스 coelomic 유체에서 특정 mRNA를 국소화하기 위한 민감한 방법을 개발하는 것이다. 이 프로토콜에는 디곡시제닌 표지된 안티센스 및 센스 리보프로브 제제, coelomic 유체 수집 및 섹션 준비, 특정 리보프로퍼 혼성화, 항체 배양, 착색 및 착색 후 처리를 포함한 ISH의 상세한 단계가 포함됩니다. 이 방법을 사용하여 성공적인 실험에서 얻은 대표적인 결과가 입증됩니다. 프로토콜뿐만 아니라 다른 시분큘라 종에 적용 할 수 있어야합니다.
서론
ISH는, 표지된 핵산 프로브를 이용하여 관심 있는 특정 DNA 또는 RNA 서열을 검출하고, 형태학적으로 보존된 조직1,,2,,3에서표적 유전자의 공간 발현 패턴을 설명하는 유용한 방법이다. 일반적으로, 표적 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성되고, 디곡시겐린 뇨딘-5'-삼인산염으로 표지된 안티센스/센스 RNA 프로브를 합성하기 위한 템플릿으로 사용된다. 샘플은 리보프로브로 배양하기 전에 고정되고 투과됩니다. 과잉 프로브를 세척 한 후, 혼성화는 알칼리 성 인산염 - 공액3,,4,,5,,6인항 디그산소인 항체를 사용하여 면역 조직 화학에 의해 시각화됩니다.
시분큘러스 누두스(Phylum Sipuncula; 주문 시분쿨리다: 시분큘리대)는 세분화되지 않은, coelomate 및 양측 대칭해양 벌레
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프로토콜
동물 절차는 화차오 대학의 동물 관리 및 복지위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 리보프로브 준비
- 프라이머 디자인
- 프로그램 프라이머 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)를 엽니 다. dmrt1 시퀀스(GenBank: MK182259)를 시퀀스 창에 복사합니다.
- 설정 프라이머 길이 (23-25 bp), 용융 온도 (55-60 ° C), 및 G / C 함량 (40-60%). 프라이머 선택을클릭합니다.
참고: RNA 프로브에 필요한 최소 크기는 약 500 bp입니다. - T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열(5, -TAATACGCACTATAGGG-3) 을 선택된 프라이머 중 하나에 첨가한다., ISH에 대한 dmrt1 프라이머 서열은 표 1에나타내고 있습니다.
참고: 센스 프로브의 경우, T7 RNA 폴리머라제 프로모터는 5' 전달 프라이머의 끝에 위치합니다. 안티센스 프로브의 경우, T7 RNA 폴리머라제 프로모터는 역프라이머의 5'-끝에 위치한다.
- P....
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결과
ISH와 관련된 단계에 대한 요약은 그림 1에나와 있습니다. dmrt1에 대한 안티센스 및 상응하는 감각 리보프로브는 COELOMIC 유체 cDNAs로부터 증폭된 PCR 제품으로부터 합성되었다. PCR 제품의 진위는 직접 시퀀싱을 통해 확인되었습니다. 리보프로브는 제조사의 프로토콜및 이전 보고서4에 따라 T7 RNA 폴리머라제와 약간의 수정을 사용하여 합성되었다. ISH의 대표적인 신호는 그림 2에나와 있습니다. dmrt1을 표적으로 하는 안티센스 리보프로브를 가진 시분누스 누두스 coelomic 유체의 ISH는 정자의 트로포블라스트 세포에 집중된 보라색 염색을 밝혀냅니다(그림2A, B,적색 화살표). 센스 리보프로브는 음성 대조군으로 사용되었고, <.......
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토론
이전 연구는 ISH가 다중 표적 RNA16,,17,,18을검출하기에 적합하다는 것을 보여주었다. 이 프로토콜에서, 우리는 coelomic 액체에 있는 mRNA를 검출하고 Sipunculus nudus에 있는 최적화된 혼성화 조건을 강조하는 고분해능 ISH 방법을 기술했습니다. 우리가 관찰한 dmrt1의 명백한 신호는 유전자 발현의 검출에서 이 프로토콜의 성공적인 적용을 입증하였다(도2).
실험 중에 일련의 단계가 특별한 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 표적 유전자에 대한 감지 리보프로브는 대조군으로서 합성되어야 한다. 합성 후, 리보프로브의 품질은 겔상에서 확인되어야 한다. 불 쌍 한 RNA 합성 섹션에 아무 얼룩 귀 착될 것 이.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단의 젊은 과학자 기금에 의해 지원되었다 (그랜트 번호 31801034), 푸젠 성의 자연 과학 재단, 중국 (2016J01161), 화차오 대학의 과학 연구 기금 (15BS306) 및 Huaqiao 대학의 과학 연구에 대학원생의 혁신적인 기금.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT 알칼리성 인산가수분해효소 발색 키트 | , Beyotime | C3206 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma | B2064 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm 화학 시약 Co. | 5949-29-1 | |
| 구연산 트리 소듐 | Sinopharm 화학 시약 유한 | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| 탈이온화 포름아미드 | Amresco | 1975년 12월 7일 | |
| EDTA | 시그마 | 431788 | |
| 전기 영동 젤 이미징 | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| 에탄올 | Sinopharm 화학 시약 Co. | 64-17-5 | |
| 젤 추출 키트 | 오메가 | D2500 | |
| 젤 전기 영동 장치 | 베이징 Liuyi 악기 공장 | DYY-6C | |
| 글리세롤 | Sinopharm 화학 시약 Co. | 56-81-5 | |
| 글리신 | 시그마 | G5417 | |
| 헤파린 | 시그마 | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm 화학 시약 Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm 화학 시약 Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | 시그마 | 203637 | |
| 말레산 | 시노팜 화학 시약 Co. | 110-16-7 | |
| 메탄올 | Sinopharm 화학 시약 Co. | 67-56-1 | 유해 물질 |
| MgCl2 | Sinopharm 화학 시약 Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm 화학 시약 Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm 화학 시약 Co. | 1310-73-2 | 부식성 |
| 파라핀 필름 | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| 파라포름알데히드, PFA | 시그마 | 158127 | 유해 물질 |
| PCR 기기 | 생명 기술 | Proflex | |
| 핀 | Deli | 16 | |
| 피펫 | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine 처리 현미경 슬라이드 | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | ||
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| 슬라이드 염색 용기 | Beyotime | FG010 | |
| 슬라이드 보관함 | Beyotime | FBX011 | |
| 소형 오토클레이브 가위 | Shuanglu | sku_8330 | |
| 분광 광도계 | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA 중합효소 | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA 중합효소 믹스 (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | ||
| Tween-20 | 시그마 | P1379 | |
| 수조 | 정주 만리장성 과학 산업 | HH-S2 |
참고문헌
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
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