Method Article

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

DOI:

10.3791/61031

⸱

May 9th, 2020

 ,  , 
1Laboratory of Separation and Spectroscopic Method Applications, Centre for Interdisciplinary Research, The John Paul II Catholic University of Lublin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명된 항암세포 배양으로부터 수집된 배지에서 키누레닌 통로(kynurenine, 3-하이드록시키누레닌, 크산, 3-하이드록산, 3-하이드록산산)에서 생성된 4개의 상이한 트립토판 대사산물의 결정 프로토콜이 단일 사각폴 황색술과 결합된 액체 염색체 배양으로부터 수집된다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kynurenine 통로 및 kynurenines에게 불린 트립토판 이환산물은 면역 조절 및 암 생물학에 그들의 연루를 위해 증가한 관심을 수신했습니다. 체외 세포 배양 분석은 종종 질병 메커니즘에서 다른 트립토판 이환산물의 기여에 대해 배우고 치료 전략을 테스트하는 데 사용됩니다. 분비대사산물과 신호 분자가 풍부한 세포 배양 배지는 트립토판 대사 및 기타 세포 사건의 상태를 반영한다. 복합 세포 배양 배지에서 다중 키누레닌의 신뢰할 수 있는 정량화를 위한 새로운 프로토콜은 여러 시료의 안정적이고 빠른 분석을 가능하게 하고자 한다. 이것은 질량 분석과 결합된 액체 크로마토그래피로 달성될 수 있습니다. 이 강력한 기술은 대사 산물의 정량화를 위한 많은 임상 및 연구 실험실에서 채택되고 kynurenines를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.

여기에 제시된 액체 크로마토그래피는 4개의 키누레닌, 즉 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌, 3-하이드록시키누레닌, 3-하이드록시스라놀릭 및 산의 동시 측정을 위한 단일 쿼드러폴 질량 분광법(LC-SQ)과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용한다. SQ 검출기는 사용하기 쉽고 다른 질량 분광계에 비해 저렴합니다. SQ-MS 분석에서, 샘플로부터의 다중 이온은 특정 질량대전비율(m/z)에따라 생성되고 분리되며, 그 다음에는 단일 이온 모니터링(SIM) 모드를 이용하여 검출한다.

이 백서는 보고된 방법의 장점에 주목하고 몇 가지 약점을 나타냅니다. 크로마토그래피 및 질량 분광분석과 함께 샘플 준비를 포함한 LC-SQ 분석의 중요한 요소에 초점을 맞추고 있습니다. 품질 관리, 방법 교정 조건 및 매트릭스 효과 문제도 논의됩니다. 우리는 모든 표적 마취에 대한 하나의 아날로그 표준으로 3 니트로티로신의 간단한 응용 프로그램을 설명했다. 인간 난소 및 유방암 세포를 이용한 실험에 의해 확인된 바와 같이, 제안된 LC-SQ 방법은 신뢰할 수 있는 결과를 생성하고 다른 체외 세포 모델에 더 적용될 수 있다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kynurenine 통로 (KP)는 인간 세포에 있는 트립토판 (Trp) 이화작용의 주요 경로입니다. 외세포에서 인돌리아민-2,3-디산소효소(IDO-1)는 KP의 최초 및 제한 효소이며 Trp를 N-formylkynurenine1로변환한다. KP 내의 추가 단계는 다른 이차 대사 산물, 즉 다양한 생물학적 특성을 나타내는 kynurenines를 생성합니다. Kynurenine (Kyn)은 아릴 탄화수소 수용체 (AhR)2에결합 한 후 독성 특성 및 조절 세포 이벤트를 보여주는 최초의 안정적인 Trp catabolite이다. 그 후, 킨은 자발적으로 또는 효소 매개 공정에서 여러 분자로 변형되어 3-하이드록시키누레닌(3HKyn), 탄트라날산(AA), 3-하이드록산(3-HAA), 키누레닉산(Kyna), xanethurnicacid(Xanethurnic)와 같은 대사산물을 생성합니다. 또 다른 하류 대사 산물, 2 아미노산-3-카복시무코닉 산-6-세미알데히드(ACMS),퀴놀린산(QA) 또는 피콜리닉산(PA)1에비효소 순환화를 겪는다. 마지막으로, QA는 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)3,중요한 효소 보조인인 KP 엔드포인트 대사산물로 더욱 변형된다. 일부 키누레닌은 키나와 PA와 같은 신경 보호 특성을 가지고 있으며, 다른 사람, 즉 3HAA 및 3HKyn은 독성4입니다. 3HKyn에서 형성되는 산투레닉 산은 항산화 및 혈관 완화 특성5를제시합니다. XA는 노화 렌즈에 축적되어 상피 세포의 세포멸각증으로이어진다 6. 20세기 중반에 설명된 KP는 다양한 장애에 대한 참여가 입증되었을 때 더 많은 관심을 얻었습니다. 이러한 대사 경로의 증가된 활동과 일부 키누레닌의 축적은 면역 반응을 조절하고 우울증, 정신 분열증, 뇌병증, HIV, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 말라리아, 알츠하이머병, 헌팅턴병 및 암4,7과같은 다른 병리학적 조건과 관련이 있다. Trp 대사의 일부 변화는 종양 미세 환경 및 암세포에서관찰된다2,8. 또한, kynurenines 유망한 질병 마커로 간주됩니다9. 암 연구에서, 체외 세포 배양 모델은 잘 확립되어 널리 항암제에 대한 반응의 전임상 평가에사용된다(10). Trp 대사 산물은 배양 배지로 세포에 의해 분비되고 kynurenine 통로의 상태를 평가하기 위하여 측정될 수 있습니다. 따라서 쉽고 유연하며 신뢰할 수 있는 프로토콜을 가진 다양한 생물학적 시편에서 가능한 한 많은 KP 대사산물의 동시 검출을 위한 적절한 방법을 개발할 필요가 있다.

이 논문에서, 우리는 4개의 kynurenine 통로 대사산물의 동시 결정에 대한 프로토콜을 기술합니다: Kyn, 3HKyn, 3HAA 및 XA에 의하여 LC-SQ에 의하여 암세포에서 집합된 포스트 배양 배지에. 현대 분석 접근법에서, 액체 크로마토그래피(13,14,15,16)는 Ehrlich 시약11,12를활용한 생화학적 비특이적 분석과는 달리 개별 트립토판 이화산물의 동시 검출 및 정량화에 바람직하다. 현재, 주로 자외선 또는 형광 검출기13,17,18,19를가진 액체 크로마토그래피를 기반으로 인간 표본에서 키누레닌 결정에 사용할 수 있는 많은 방법이 있다. 질량 분석 검출기(LC-MS)와 결합된 액체 크로마토그래피는 높은 감도(검출의 하한), 선택성 및 반복성으로 인해 이러한 유형의 분석에 더 적합한 것으로 보입니다.

Trp 대사 산물은 이미 인간 혈청, 혈장 및소변(13,20,21,22,23)에서결정되었지만, 세포 배양 배지와 같은 다른 생물학적 표본에 대한 방법도 원하고 있다. 이전에는 LC-MS가 인간 신경교종 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 인터페론 감마(IFN-γ)24,25,26으로처리된 성상세포를 배양한 후 수집된 배지에서 Trp 유래화합물에사용되었다. 현재, 암 모델에 사용되는 다른 배양 매체, 세포 및 치료에 있는 몇몇 대사산물의 평가를 허용할 수 있는 새로운 검증된 프로토콜을 위한 필요가 있습니다.

개발된 방법의 목적은 KP에서 이상을 나타낼 수 있는 4개의 주요 키누레닌(1개의 분석 실행 내)을 정량화하는 것입니다. 여기에 제시된 시험관내 배양 인간암세포(27)로부터수집된 배지에서 하나의 내부 표준(3-니트로티로신, 3NT)을 사용하여 선택된 의미 있는 kynurenines의 정량적 LC-SQ 분석을 위한 당사의 최근 발표된 프로토콜의 중요한 단계이다. 우리의 가장 좋은 지식에, 그것은 체외 성장 세포에서 얻은 배양 배지에서 3HKyn, 3HAA, Kyn 및 XA의 동시 정량화를위한 최초의 LC-SQ 프로토콜입니다. 일부 수정시, 방법은 세포 배양 모델의 넓은 범위에서 Trp 물질 대사의 변화를 연구하기 위해 더 적용 될 수있다.

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Protocol

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1. 표준 3NT, 킨, 3HKyn, 3HAA, XA 표준 재고 솔루션의 준비

  1. 가장 높은 정확도 (각각 0.3 mg)로 바이알에서 시약을 계량합니다. 더 나은 정확도를 위해 시약을 확장하여 1.2 단계에 따라 용매의 부피를 조정합니다.
  2. 시약을 용매의 300 μL로 용해하여 물에서 1g/L의 스톡 용액을 1% (v/v) 포믹산(FA)으로 용해하는; 동전 설플옥화물 (DMSO)에서 킨, 3HAA 및 XA; 3HKyn은 염산(HCl)으로 pH 2.5로 산성화하였다.
    주의: 3HAA는 눈, 코, 인후 및 폐를 자극합니다. 흡입시, 피부와 접촉하고 삼킨 경우 는 유해합니다. 장갑과 마스크와 같은 적절한 보호 기능을 착용하십시오.
  3. 유리병을 단단히 닫고 용해를 가속화하기 위해 1 분 동안 초음파 욕조에 놓습니다.
    참고: 재고 용액을 -20°C에 저장하고 재고 솔루션의 불안정성으로 인해 동결/해동(최대 3사이클)을 최소화합니다.

2. 숯처리문화배지 준비

  1. 튜브에서, 280 mg의 활성 탄을 계량하고 관심있는 세포를 배양하기 위해 준비된 액체 배지의 5 mL을 추가합니다.
  2. 상온에서 2시간 동안 톱 록커를 보고 중간 및 숯으로 튜브를 흔들어 주세요(50μg/분으로 설정). 다음으로, 15 분 동안 6000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
  3. 원심분리기에서 튜브를 제거하고 퇴적물을 방해하지 않고 상퍼를 조심스럽게 수집합니다. 필요한 경우 원심분리를 반복하여 모든 숯 잔류물을 제거합니다.
  4. 0.45 μm 주사기 필터를 사용하여 상체를 필터링합니다.
  5. 6.3.2 단계에서 설명된 바와 같이 LC-MS에서 파일럿 샘플을 실행하여 숯 전처리 된 배양 배지가 kynurenines 흔적을 박탈당하는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 2.1-2.4 단계를 반복하십시오.
    참고: 완전한 배양 배지가 처음에는 키누레닌을 포함하지 않으면 숯을 이용한 정화 단계가 생략될 수 있습니다. 이 경우 일반적으로 세포 배양에 대해 준비된 전체 매체를 사용하여 교정 표준 및 품질 관리 샘플을 준비합니다.
  6. 분석될 때까지 준비된 매체를 4°C로 저장합니다.

3. 교정 솔루션 및 교정 곡선 만들기

  1. 0.1 g/L 3NT 용액의 0.75 μL로 숯 전처리 배양 배지를 스파이크하고 적어도 6개의 서로 다른 농도(3HKyn, 3HAA, Kyn, XA)를 추가하여 교정 범위를 커버합니다. 각 샘플의 최종 부피를 150 μL. 소용돌이에 잘 보관하십시오. 샘플 준비를 위해 1.5mL 원심분리기 튜브를 사용합니다.
    참고: 3HKyn에 대한 권장 교정 포인트: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 μmol/L; Kyn: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 μmol/L; 3HAA: 0.033, 0.16, 0.65, 3.27, 6.53, 13.06 μmol/L; XA: 0.019, 0.13, 0.49, 1.22, 3.65, 4.87 μmol/L.
  2. 150 μL의 차가운 메탄올(-20°C)을 첨가하여 1%(v/v) 포름산을 함유하여 각 튜브에 첨가하여 시료 탈단백질화를 한다. 튜브와 소용돌이를 단단히 닫습니다.
  3. 샘플을 -20°C에서 40분 동안 배양합니다.
  4. 4°C에서 15분 동안 14,000 x g의 샘플을 원심분리합니다. 원심분리기에서 튜브를 제거합니다. 새로운 튜브에 슈퍼 네이츠를 수집합니다. 퇴적물을 방해하지 마십시오.
  5. 자동 파이펫을 사용하여 상류체의 270 μL을 유리 바이알로 옮킨다. 바이알을 증발기에 넣고 건조할 때까지 부드럽게 증발합니다. 휘발성 성분을 증발시키기 위해 물/메탄올 분획에 적합한 프로그램을 사용합니다. 40°C 이상의 온도를 적용하지 말고 과다 건조를 피하십시오.
    참고: 평평한 바닥 유리 바이알, 즉 크로마토그래픽 바이알은 플라스틱 원추형 튜브에 비해 더 빠른 증발과 더 높은 회수를 용이하게 합니다.
  6. 30분 후 증발 상태를 확인합니다. 필요한 경우 증발을 계속합니다(예: 10분 추가). 과다 건조를 피하십시오.
  7. 증발기에서 바이알을 제거합니다. 물 에서 0.1 % (v /v) 포믹 산의 60 μL에서 각 샘플을 재구성합니다. 잔류 재질을 포함하는 유리병에 용매를 추가합니다. 유리병과 소용돌이를 단단히 닫습니다.
  8. 샘플을 1.5mL 튜브로 옮기고 침전된 단백질을 분리하기 위해 4°C에서 15분 동안 14,000 x g에서 회전합니다.
  9. 단백질 펠릿을 방해하지 않고, 자동 파이펫으로 원추형 유리 인서트와 크로마토그래픽 바이알로 슈퍼네틱제를 전송합니다. 바이알을 단단히 닫습니다.
  10. 삽입 유리병에 기포의 존재를 확인하고 필요한 경우 제거 (예를 들어, 소용돌이에 의해).
  11. 샘플을 포함하는 크로마토그래픽 바이알을 LC 자동 샘플러로 옮는다. 자동 샘플러 트레이에 배치된 샘플의 위치를 기록합니다.

4. 품질 관리 (QC) 샘플의 준비

  1. 0.1 g/L 3NT 용액의 0.75 μL과 4개의 키누레닌(3HKyn, 3HAA, Kyn, XA)의 기준을 교정 곡선의 선형 범위에서 선택된 한 농도로 숯 전처리 배양 배지(1.5ml 원심 튜브로 제조)를 스파이크한다. 샘플의 최종 부피를 150 μL로 유지합니다.
    참고: 해당하는 경우 교정 곡선의 선형 범위 아래에 속하는 다양한 농도로 여러 QC 샘플을 준비합니다.
  2. 섹션 3에 설명된 프로토콜을 따릅니다(3.2-3.11 단계).

5. LC-MS 시스템 설정

  1. 이동상 용매 준비: 용매 A: 20 mmol/L 암모늄 초순수(pH 4.3+ 산으로 조정); 용매 B : 100 % 아세토나이트.
    참고: 보로실리케이트 유리병만 사용하세요. 병을 초순수물로 헹구고 다시 채웁니다. 세제로 청소한 병을 사용하지 마십시오.
    주의: 아세토나이트는 심각한 건강 효과 나 사망을 일으킵니다. 그것은 쉽게 열에 의해 점화된다. 아세토닐리액과 증기는 눈, 코, 인후 및 폐를 자극할 수 있습니다.
    1. 유리병에 초순수 50mL로 결정성 시약(15.77g)을 용해시켜 암모늄 용액 5몰/L 스톡 용액을 준비한다. 모든 잔류가 녹을 때까지 저어줍니다. 0.45 μm 멤브레인을 통과하여 잔류 이물질을 제거합니다(예: 나일론 주사기 필터를 사용하여). 스톡 용액을 4°C로 저장합니다.
    2. 호박색 유리 병에 초순수 980mL에 물에 5 mol/L 암모늄의 4mL를 첨가하여 용매 A를 준비하고 잘 저어줍니다. 교반 바를 침지하고 용매를 자기 교반기위에 놓습니다. pH 전극을 용액에 담그고 교반 하에서 pH를 제어합니다. 포믹산 재고 용액 추가(98%-100%) 0.2mL 팁의 자동 파이펫을 사용하여 pH 4.3을 얻고, 초순수 물로 최대 1L까지 볼륨을 조정하고 잘 저어줍니다.
      참고: 어떤 미생물 성장을 방지하기 위해 적어도 일주일에 한 번 용매를 준비합니다.
      주의: 포믹산(FA)은 흡입시 독성이 있어 피부 화상과 눈 손상을 유발합니다. 연기 후드 아래에서 작업; 보호 장갑과 코트를 착용하십시오.
    3. 0.22 μm 멤브레인(예: 나일론 주사기 필터)을 통해 모든 솔루션을 필터링하여 잔류 이물질을 제거합니다. 선택적으로 LC 용매 저장소 전용 용매 입구 필터를 사용하여 들어오는 입자로부터 시스템을 보호합니다.
  2. LC-MS 제어 및 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다.
  3. 모바일 단계로 LC 시스템을 제거하여 거품을 제거하고 모든 용매 채널을 프라임합니다.
  4. 가드 열을 앙상블하여 분석 컬럼이 막힘으로부터 보호합니다.
  5. 가드 및 분석 컬럼(C18, 2.1 x 100mm, 1.8 μm)을 약 30분 동안 100% 아세토나이트로 플러시한 다음, 열내의 안정적인 압력이 관찰될 때까지 100% 용매 A를 사용합니다. 제어 소프트웨어를 사용하여 시스템 성능을 제어합니다.
  6. 데이터 수집 소프트웨어에 적절한 LC 매개 변수를 설정합니다.
    1. 그라데이션 프로그램 설정: 0-8분 용매 B 0%; 8-17 분 용매 B 0-2 %; 17-20 분 용매 B 2 %; 20-32 분 용매 B 10-30 %; 32-45 분 용매 B 0 %.
    2. 이동상 유량은 0.15mL/min, 총 분석 런타임 45분, 기둥 온도 +40°C, 사출 부피 10μL로 설정합니다.
  7. 질량 분석 검출기의 획득 매개변수를 설정합니다.
    1. 이온화 파라미터 적용: 단일 이온 모니터링(SIM), 양성 이온화, 50psi의 분무기 압력, +350°C 건조 가스 온도, 12L/min의 건조 가스 흐름, 5500 V 모세관 전압.
    2. 3HKyn m/z 225.0 (스캔 기간: 2-6분, 조각전압: 100 V);용, 3HKyn m/z 225.0의 경우, 문체 모니터링 이온을 선택합니다. Kyn m/z 209.0 (스캔 기간: 6-12 분, 조각 전압: 80 V); 3HAA m/z 154.0 (스캔 기간: 12-18 분, 단편전압: 80 V); 3NT m/z 227.0 (스캔 기간: 18-23 분, 조각전압: 100 V); XA m/z 206.0의 경우(스캔 기간: 23-45분, 조각전압: 100 V).
  8. 작업 목록을 구성하고 LC 시스템에서 샘플을 실행합니다.
  9. 처음에 실험 용 샘플을 분석하기 전에 적어도 삼중 시료(Solvent A)를 실행한 다음 하나의 QC 샘플을 실행합니다.
  10. 데이터 분석 소프트웨어를 열고 QC 샘플에 대해 얻은 결과를 로드합니다.
  11. 크로마토그램의 아나리테 봉우리 위치를 확인합니다. 신호가 예상 위치를 넘어 이동하면 적절한 단화 신호 수집을 위한 시간 게이트를 조정합니다. 신호 통합에 대한 지침에 대한 소프트웨어 설명서를 참조하십시오.

6. 교정 곡선 구성

  1. 데이터 수집 소프트웨어에서 교정 표준을 작업 목록에 추가하고 트리클리케이트에서 표준을 실행합니다.
  2. 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT 및 XA에 대응하는 피크 영역을 각각 약 4.4분, 10분, 16분, 21분 및 30분의 유지시에 통합및 측정합니다.
  3. 스프레드시트 프로그램을 사용하여 각 대사 산물에 대해 개별 교정 곡선을 구성합니다.
    1. 교정 차트를 만들려면 분석물의 농도대비 3NT 피크 영역에 걸쳐 분석 피크 영역의 비율에 대한 값을 플롯합니다.
    2. 빈 시료(3NT로만 스파이크된 숯전배배지)를 분석하여 배지에 연구된 분석물의 흔적이 없도록 한다. 그렇지 않으면 각 교정 지점에서 얻은 값을 뺍니다.
    3. 각 교정 곡선의 선형성을 확인합니다.
      1. 개별적으로, 각 분석물의 경우, 경사-가로채기 선형 방정식(y=ax+b)을 생성하여, 여기서 y는 분석피크 영역 대 3NT 피크 영역의 비율에 해당하며, a는 경사, x는 분석 농도(μmol/L)이며, b는 곡선 차단을 의미한다. 그래프 'y'와 'x'를 플로팅하면 보정 곡선이 생성됩니다.
      2. 차트에 선형 추세선을 추가하고, 차트에 교정 곡선 방정식 및 회귀 계수를 표시합니다. 회귀 계수가 > 0.990인지 확인합니다. 일치하지 않는 교정 표준의 경우 다시 한 번 준비 및/또는 분석합니다. 선택적으로 보정 곡선의 농도 범위를 변경합니다.
    4. 실험 샘플을 분석하기 전에 QC 샘플을 분석하여 시스템 성능을 확인합니다. 비호환성(기준값에서 ± 20% 편차)의 경우 새 교정 곡선을 준비합니다.

7. 분석을 위한 체외 세포 배양 및 샘플 수집

  1. DMEM에서 연구된 암세포(MDA-MB-231 또는 SK-OV-3)를 플레이트(DMEM(덜벡코의 수정독수리 의 매체)는 ᴅ 포도당의 4.5g/L을 함유하고, 10% (v/v) 태아 소 혈청 (FBS), 2 mmol/L ʟ 글루타민 과 1 U 페니실린 /연쇄 상색 및 문화 37 °C에서 5%CO2의 가습 된 분위기에서 실험을 확장한다. 결합의 80 %에서 세포를 통과.
  2. 트립신을 이용한 배양 접시로부터 세포를 분리하고, 12웰 플레이트에 대한 실험을 위한 종자 당 0.3 × 106 세포의 밀도로 하룻밤 동안 인큐베이터에 배치된다.
  3. 다음 날, 배양 배지를 흡인하고 실험 설계에 따라 연구된 화합물의 첨가 유무에 관계없이 신선한 DMEM을 첨가한다.
  4. 48h 후, 세포 위(약 500 μL)에서 1.5mL 튜브로 배지를 수집한다. 14, 000 x g의 원심분리기는 5분 동안 세포 이물질을 제거합니다. 상체를 수집하고 분석 할 때까지 -80 °C에 저장합니다.
  5. 단백질 추정을 위해 7.4 단계에서 세포 펠릿을 저장하십시오. 샘플을 -20°C에서 동결합니다.
    참고: 다른 우물에서 배지에 대해 얻은 결과는 개별 우물의 세포 수의 가변성을 설명하기 위해 총 단백질 함량으로 정규화되어야 합니다. 단백질 농도는 9단계에서 설명된 바와 같이 평가될 수 있다.

8. LC-MS 분석을 위한 샘플 준비

  1. 실온에서 냉동 샘플을 해동하고 잘 섞습니다. 배양 배지의 149.25 μL을 원심분리관(1.5mL)으로 옮긴다.
  2. 3NT 용액의 0.1 g/L의 0.75 μL(내부 표준)을 추가합니다. 튜브와 소용돌이를 잘 닫습니다.
  3. 시료 단백질화를 위해 -20°C 메탄올1%(v/v) FA에서 150μL를 추가합니다. 튜브와 소용돌이를 잘 닫습니다.
  4. 섹션 3(3.3-3.11 단계)에 설명된 바와 같이 샘플 준비를 계속합니다.
    참고: SK-OV-3와 같은 일부 암세포는 다량의 킨을 배양 배지로 분비합니다. 데이터를 보정 곡선의 선형 범위에 맞추기 위해서는 샘플의 약 100배 희석이 필요합니다. 이 경우, 물 에서 0.1% (v/v) FA로 샘플의 일부를 희석하고 희석되지 않은 시료 이외에 분석한다. 교정 곡선에 대한 표준의 기준 샘플은 100배 희석된 완전한 배양 배지로 제조되어야 합니다. 또는 교정 곡선에 더 많은 점을 추가하여(적절한 용해도 및 선성이 달성되는 경우) 실험 샘플에서 Kyn의 농도 수준으로 조정한다.
  5. 5항에 설명된 바와 같이 LC-MS에 의해 샘플을 분석합니다. 작업 목록을 구성하고 각 샘플을 트리플리케이트로 실행합니다.
  6. 작업 목록이 완료되면 aalyte의 피크 영역을 측정합니다.
  7. 사용 가능한 소프트웨어와 얻어진 숫자 데이터를 사용하여 스프레드시트를 생성합니다.
  8. 하나의 스프레드시트 열에서 3NT 피크 영역에 대한 분석 피크 영역의 비율을 계산합니다.
  9. 각 해석물(단계 6.3.에서)에 전념하는 개별 선형 교정 방정식을 사용하여 실험 샘플에 존재하는 해석물의 농도를 계산합니다.

9. 단백질 함량 및 데이터 정규화 평가

  1. 1.5mL 튜브에서 인산염 완충식염(PBS)의 100 μL로 7.5단계에서 세포 펠릿을 다시 분리한다.
    참고: 염화나트륨 8g, 염화칼륨 0.2g, 인산나트륨 디베이직 1.44g, 칼륨 이산화수소 인산염 950mL를 녹여 PBS 용액을 준비한다. 잘 저어주세요. 염산 (드롭 와이즈)으로 pH를 7.4로 조정합니다. 초순수물로 최대 1L의 부피를 조절합니다. 균질할 때까지 잘 저어줍니다.
    주의: 염산은 부식성이 매우 높으며 적절한 안전 예방 조치로 처리해야 합니다. 인간의 피부와의 접촉은 발적, 통증, 피부 화상을 일으킬 수 있습니다. 연기 후드 아래에서 작업; 보호 장갑과 코트를 착용하십시오.
  2. 샘플을 -20°C에서 동결한 다음 얼음에 해동합니다. 이 단계를 3배 반복합니다.
  3. 4°C에서 15분 동안 14, 000 x g의 시료원심분리. 새로운 튜브에 슈퍼 네이티퍼를 수집합니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.
  4. PBS로 수퍼네이트 10배희석.
  5. 웰 범위당 단백질의 0에서 2 μg까지 교정 곡선을 구성합니다.
    1. 교정을 위한 소 세럼 알부민(BSA) 표준 솔루션을 준비합니다. 1mL의 초순수와 소용돌이에 BSA 1.23 μg를 잘 녹입니다.
    2. 96웰 플레이트에서 다양한 양의 BSA 표준 용액(1.23 μg/mL): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL을 적재합니다.
    3. PBS로 우물을 50 μL의 최종 부피에 채웁니다.
  6. 부하 10 - 15 μL 셀은 동일한 96웰 플레이트의 9.4 단계에서 lysate합니다. 50 μL의 최종 부피에 도달하기 위해 PBS로 우물을 채웁니다.
    참고: 필요한 경우 각 웰의 셀 리세이트 알리쿼트의 부피를 조정하여 교정 곡선의 선형 범위에 맞게 조정합니다. 최종 부피를 샘플당 50 μL로 유지합니다.
  7. 브래드포드 시약200μL(초순수물로 희석5회)를 각 웰에 넣습니다.
  8. 실온에서 최소 5분 동안 96웰 파테를 배양합니다. 접시를 마이크로 플레이트 판독기에 삽입합니다. λ = 595 nm에서 흡광도를 측정합니다.
  9. 스프레드시트 프로그램을 사용하여 교정 곡선을 구성합니다. BSA 양(μg)과 흡광도를 플롯합니다. 선형 추세선을 추가하고, 차트에 교정 곡선 방정식 및 회귀 계수를 표시합니다.
  10. 선형 방정식(y = ax +b, 여기서 y는 λ = 595 nm에서 흡광도에 해당하며, a는 경사이고, x는 단백질 함량(μg) 및 b가 곡선 차단을 의미하여 시료에서 단백질 양을 계산한다.
    참고: 계산에서 샘플 희석 계수를 고려합니다.
  11. 단백질 1 mg당 샘플에서 키누레닌 양을 정상화하기 위해 추정 된 단백질 함량을 사용합니다. 이를 위해, 8.9단계에서 결정된 키누레닌의 농도를 9.10단계에서 총 단백질 함량과 나눈다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LC-MS는 복잡한 표본의 일부 구성 요소가 소위 매트릭스 효과를 일으키고 분석물의 이온화를 손상시키더라도 생물학적 활성 분자의 정량화에서 명백한 이점을 제시합니다. 이온 억제 또는 이온 향상으로 이어지며 정확도를 강력하게 감소시키고 LC-MS의 검출/정량화 한계에 영향을 미치며, 이는 이 방법의 '약한" 지점으로 간주됩니다. 우리의 프로토콜에서, 이온은 또한 Trp 대사 산물 결정 에 대한 다른 연구에서 사용 된 양성 모드에서 전기 분무 이온화 (ESI)에 의해 생성된다13. 그러나 ESI는 대기압 화학 이온화(APCI)28보다매트릭스 효과가 더 수그립니다. 따라서, 세포 배양 배지에서 Trp 대사산물의 정확한 정량화를 위해, 우리는 내부 표준 및 매트릭스 일치 교정을 사용하여 소행성 신호에 대한 매트릭스 의존적 효과를 보상하고 시료 준비 단계에서 표적 화합물의 손실을 교정하였다. 우리는 모든 연구 된 악성 (3HKyn, Kyn, 3HAA, ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 논문은 체외 배양 인간 암세포로부터 배지에서 측정되는 4개의 주요 Trp 대사산물(3HKyn, Kyn, 3HAA, XA)의 동시 정량화를 위한 상세한 LC-SQ 프로토콜을 제시합니다. 샘플 준비, 크로마토그래피/질량 분광법 절차 및 분석 에서 가장 중요한 점인 데이터 해석에 특별한 주의를 기울입니다.

일반적으로 LC-MS 분석은 높은 감도로 인해 사용되는 재료의 프로토콜 엄격성 및 순도의 최고 표준을 필요로 합니다. 그것은 깔끔하게 청소하고 제대로 세척 유리 제품뿐만 아니라 표준 절차에 걸쳐 고급 화학 물질의 응용 프로그램을 의미한다. 이 민감한 접근 법에서 분석에 크게 영향을 미칠 수 있는 미생물 오염을 피하기 위해 이동 상의 담수 기반 용매를 사용하는 것이 매우 중요합니다. LC 시스템에 주입하기 전에 분석된 샘플은 임의의 용해성 입자의 존재를 주의 깊게 검사해야 합니다. 샘플 분석 전에 열을 충분히 평형화해야 합니다. 이러한 규칙을 준수하지 않으면 샘플,...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 동유럽 2007-2013의 운영 프로그램 개발에 따라 유럽 지역 개발 기금에서 유럽 연합 (EU)에 의해 지원되었다 (POPW.01.03.00-06-003/000), 루블린의 존 폴 II 가톨릭 대학의 생명 공학 및 환경 과학 학부에 의해 (일론사사옥에 대한 젊은 과학자 보조금), 폴란드 국립 과학 센터, 폴란드 국립 과학 센터, 폴란드 국립 과학 센터, 폴란드 OPUS13 (막달레나 스타니스제프스카, 원칙 조사관에 대한 OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198)  저자는 산화 스트레스 연구소에서 교수 Agnieszka Şcibior 감사, 학제 간 연구 센터, 세포 배양 및 단백질 정량화를위한 장비를 공유하기위한 JPII CUL.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-하이드록시-DL-키누레니나시그마-알드리치H1771
3-하이드록시안트라닐산시그마-알드리치14877697%
3-니트로-L-티로신시그마-알드리치N7389
아세토니트릴Supelco1.00029LC-MS LiChrosolv
활성탄Supelco05105분말
분석 저울Ohaus
분석 컬럼Agilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 빠른 해상도 HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µ m)
포름산암모늄Supelco7022용리액 첨가제; 99.0%
소 혈청 알부민 시그마1001887398
크로마토그래피 바이알용 캡Agilent Technologies5185-5820파란색 나사 캡, PTFE/레드 실 세파
세포 배양 접시Nest704004폴리스티렌, 비발열성, 멸균
세포 배양 플레이트Biologix07-601212-well, 비발열성, 비cytoxic, sterille
Cell incubatorThermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
원심분리기Eppendorfmodel 5415R
원심분리기Eppendorfmodel 5428
원심분리기 튜브BionovoB-2278Eppendorf type, 1.5 mL
원심분리기 tubesBionovoB-3693Falcon type, 50 mL, PP
크로마토그래피 데이터 수집 및 분석 소프트웨어Agilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
크로마토그래피 인서트 바이알Agilent Technologies9301-1387100 µ L
크로마토그래피 바이알Agilent Technologies5182-07142 mL, 투명 유리
디메틸 설폭사이드Supelco1.02950Uvasol
Dubelcco' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM)PAN BiotechP04-41450
듀얼 미터 pH/전도도Mettler ToledoSevenMulti
증발기Genevac모델 EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serumSigma-AldrichF9665
Formic acidSupelco5.33002for LC-MS LiChropur
시약 보관용 유리 병BionovoS-207050 mL, 투명 유리
가드 컬럼Agilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 협구경 가드 컬럼 (2.1 x 12.5 mm, 5 µ m)
염산Merck1.00317.1000
L-kynurenineSigma-AldrichK8625≥ 98% (HPLC)
마그네틱 교반기WigoES 21 H
MicrobalanceMettler Toledo모델 XP6
Milli-Q 시스템MilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole 질량 분석기Agilent TechnologiesG1948B모델 6120
페니실린-스트렙토마이신Sigma-Adrich048M4874V
플레이트 리더Bio Tek Synergy2 Gen5
염화칼Merck1.04936.1000
인산이수소 칼Merck1.05108.0500
단백질 분석 염료 시약 농축액BioRad500-0006
시소 로커StuartSSL4
혈청학 피펫둥지3260015 mL, 폴리스티렌, 비 발열성, 멸균
염화나트륨Sigma-Aldrich7647-14-5
인산나트륨 이염 기성Merck1.06346.1000
용매 입구 필터Agilent Technologies5041-2168유리 필터, 20 μ m 기공 크기
용매 저장소(LC-MS용)Agilent Technologies9301-65241L, 투명 유리
용매 저장소(LC-MS용)Agilent Technologies9301-65261L, 호박색 유리
스프레드시트 프로그램Microsoft OfficeMicrosoft Office Excel
Stir barBionovo6-2003테플론 코팅
주사기 필터 중간 여과Bionovo7-8803재생 셀룰로오스, Ø 30 mm, 0,45 µ
이동상 성분 여과를 위한 m 주사기 여과Bionovo6-0018나일론, Ø 30 mm, 0,22 &마이크로; m
조직 배양 플레이트VWR10062-90096-wells, 멸균
Trypsin-EDTA 솔루션Sigma-AldrihT4049-100 mL
초고성능 액체 크로마토그래피 시스템Agilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity 시스템은 자동 시료 주입기(G1367D), 탈기 장치(G1379B), 이진 펌프(G1312B), 컬럼 온도 조절기(G1316C)로 구성되었습니다.
초음파 목욕Polsonic104533모델 6D
VortexBiosan모델 V-1 플러스
크산투렌산Sigma-AldrichD12080496%
용 하이퍼그레이드LC-MS, LiChropur, &ge용 , , , , 륨 륨 배양용 기

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