암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

Summary

여기에 설명된 항암세포 배양으로부터 수집된 배지에서 키누레닌 통로(kynurenine, 3-하이드록시키누레닌, 크산, 3-하이드록산, 3-하이드록산산)에서 생성된 4개의 상이한 트립토판 대사산물의 결정 프로토콜이 단일 사각폴 황색술과 결합된 액체 염색체 배양으로부터 수집된다.

Abstract

kynurenine 통로 및 kynurenines에게 불린 트립토판 이환산물은 면역 조절 및 암 생물학에 그들의 연루를 위해 증가한 관심을 수신했습니다. 체외 세포 배양 분석은 종종 질병 메커니즘에서 다른 트립토판 이환산물의 기여에 대해 배우고 치료 전략을 테스트하는 데 사용됩니다. 분비대사산물과 신호 분자가 풍부한 세포 배양 배지는 트립토판 대사 및 기타 세포 사건의 상태를 반영한다. 복합 세포 배양 배지에서 다중 키누레닌의 신뢰할 수 있는 정량화를 위한 새로운 프로토콜은 여러 시료의 안정적이고 빠른 분석을 가능하게 하고자 한다. 이것은 질량 분석과 결합된 액체 크로마토그래피로 달성될 수 있습니다. 이 강력한 기술은 대사 산물의 정량화를 위한 많은 임상 및 연구 실험실에서 채택되고 kynurenines를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.

여기에 제시된 액체 크로마토그래피는 4개의 키누레닌, 즉 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌, 3-하이드록시키누레닌, 3-하이드록시스라놀릭 및 산의 동시 측정을 위한 단일 쿼드러폴 질량 분광법(LC-SQ)과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용한다. SQ 검출기는 사용하기 쉽고 다른 질량 분광계에 비해 저렴합니다. SQ-MS 분석에서, 샘플로부터의 다중 이온은 특정 질량대전비율(m/z)에따라 생성되고 분리되며, 그 다음에는 단일 이온 모니터링(SIM) 모드를 이용하여 검출한다.

이 백서는 보고된 방법의 장점에 주목하고 몇 가지 약점을 나타냅니다. 크로마토그래피 및 질량 분광분석과 함께 샘플 준비를 포함한 LC-SQ 분석의 중요한 요소에 초점을 맞추고 있습니다. 품질 관리, 방법 교정 조건 및 매트릭스 효과 문제도 논의됩니다. 우리는 모든 표적 마취에 대한 하나의 아날로그 표준으로 3 니트로티로신의 간단한 응용 프로그램을 설명했다. 인간 난소 및 유방암 세포를 이용한 실험에 의해 확인된 바와 같이, 제안된 LC-SQ 방법은 신뢰할 수 있는 결과를 생성하고 다른 체외 세포 모델에 더 적용될 수 있다.

Introduction

Kynurenine 통로 (KP)는 인간 세포에 있는 트립토판 (Trp) 이화작용의 주요 경로입니다. 외세포에서 인돌리아민-2,3-디산소효소(IDO-1)는 KP의 최초 및 제한 효소이며 Trp를 N-formylkynurenine^1로변환한다. KP 내의 추가 단계는 다른 이차 대사 산물, 즉 다양한 생물학적 특성을 나타내는 kynurenines를 생성합니다. Kynurenine (Kyn)은 아릴 탄화수소 수용체 (AhR)^2에결합 한 후 독성 특성 및 조절 세포 이벤트를 보여주는 최초의 안정적인 Trp catabolite이다. 그 후, 킨은 자발적으로 또는 효소 매개 공정에서 여러 분자로 변형되어 3-하이드록시키누레닌(3HKyn), 탄트라날산(AA), 3-하이드록산(3-HAA), 키누레닉산(Kyna), xanethurnicacid(Xanethurnic)와 같은 대사산물을 생성합니다. 또 다른 하류 대사 산물, 2 아미노산-3-카복시무코닉 산-6-세미알데히드(ACMS),퀴놀린산(QA) 또는 피콜리닉산(PA)^1에비효소 순환화를 겪는다. 마지막으로, QA는 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드(NAD^+)3,중요한 효....

Protocol

1. 표준 3NT, 킨, 3HKyn, 3HAA, XA 표준 재고 솔루션의 준비

1. 가장 높은 정확도 (각각 0.3 mg)로 바이알에서 시약을 계량합니다. 더 나은 정확도를 위해 시약을 확장하여 1.2 단계에 따라 용매의 부피를 조정합니다.
2. 시약을 용매의 300 μL로 용해하여 물에서 1g/L의 스톡 용액을 1% (v/v) 포믹산(FA)으로 용해하는; 동전 설플옥화물 (DMSO)에서 킨, 3HAA 및 XA; 3HKyn은 염산(HCl)으로 pH 2.5로 산성화하였다.
   주의: 3HAA는 눈, 코, 인후 및 폐를 자극합니다. 흡입시, 피부와 접촉하고 삼킨 경우 는 유해합니다. 장갑과 마스크와 같은 적절한 보호 기능을 착용하십시오.
3. 유리병을 단단히 닫고 용해를 가속화하기 위해 1 분 동안 초음파 욕조에 놓습니다.
   참고: 재고 용액을 -20°C에 저장하고 재고 솔루션의 불안정성으로 인해 동결/해동(최대 3사이클)을 최소화합니다.

2. 숯처리문화배지 준비

1. 튜브에서, 280 mg의 활성 탄을 계량하고 관심있는 세포를 배양하기 위해 준비된 액체 배지의 5 mL을 추가합니다.
2. 상온에서 2시간 동안 톱 록커를 보고 중간 및 숯으로 튜브를 흔들어 주세요(50....

Results

LC-MS는 복잡한 표본의 일부 구성 요소가 소위 매트릭스 효과를 일으키고 분석물의 이온화를 손상시키더라도 생물학적 활성 분자의 정량화에서 명백한 이점을 제시합니다. 이온 억제 또는 이온 향상으로 이어지며 정확도를 강력하게 감소시키고 LC-MS의 검출/정량화 한계에 영향을 미치며, 이는 이 방법의 '약한" 지점으로 간주됩니다. 우리의 프로토콜에서, 이온은 또한 Trp 대사 산물 결정 에 대한 다른 연구에서 사용 된 양성 모드에서 전기 분무 이온화 (ESI)에 의해 생성된다^13. 그러나 ESI는 대기압 화학 이온화(APCI)^28보다매트릭스 효과가 더 수그립니다. 따라서, 세포 배양 배지에서 Trp 대사산물의 정확한 정량화를 위해, 우리는 내부 표준 및 매트릭스 일치 교정을 사용하여 소행성 신호에 대한 매트릭스 의존적 효과를 보상하고 시료 준비 단계에서 표적 화합물의 손실을 교정하였다. 우리는 모든 연구 된 악성 (3HKyn, Kyn, 3HAA, .......

Discussion

본 논문은 체외 배양 인간 암세포로부터 배지에서 측정되는 4개의 주요 Trp 대사산물(3HKyn, Kyn, 3HAA, XA)의 동시 정량화를 위한 상세한 LC-SQ 프로토콜을 제시합니다. 샘플 준비, 크로마토그래피/질량 분광법 절차 및 분석 에서 가장 중요한 점인 데이터 해석에 특별한 주의를 기울입니다.

일반적으로 LC-MS 분석은 높은 감도로 인해 사용되는 재료의 프로토콜 엄격성 및 순도의 최고 표준을 필요로 합니다. 그것은 깔끔하게 청소하고 제대로 세척 유리 제품뿐만 아니라 표준 절차에 걸쳐 고급 화학 물질의 응용 프로그램을 의미한다. 이 민감한 접근 법에서 분석에 크게 영향을 미칠 수 있는 미생물 오염을 피하기 위해 이동 상의 담수 기반 용매를 사용하는 것이 매우 중요합니다. LC 시스템에 주입하기 전에 분석된 샘플은 임의의 용해성 입자의 존재를 주의 깊게 검사해야 합니다. 샘플 분석 전에 열을 충분히 평형화해야 합니다. 이러한 규칙을 준수하지 않으면 샘플,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-하이드록시-DL-키누레니나	시그마-알드리치	H1771
3-하이드록시안트라닐산	시그마-알드리치	148776	97%
3-니트로-L-티로신	시그마-알드리치	N7389
아세토니트릴	Supelco	1.00029	LC-MS LiChrosolv
활성탄	Supelco	05105	분말
분석 저울	Ohaus
분석 컬럼	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 빠른 해상도 HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µ m)
포름산암모늄	Supelco	7022	용리액 첨가제; 99.0%
소 혈청 알부민 시	그마	1001887398
크로마토그래피 바이알용 캡	Agilent Technologies	5185-5820	파란색 나사 캡, PTFE/레드 실 세파
세포 배양 접시	Nest	704004	폴리스티렌, 비발열성, 멸균
세포 배양 플레이트	Biologix	07-6012	12-well, 비발열성, 비cytoxic, sterille
Cell incubator	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i Cu
원심분리기	Eppendorf		model 5415R
원심분리기	Eppendorf		model 5428
원심분리기 튜브	Bionovo	B-2278	Eppendorf type, 1.5 mL
원심분리기 tubes	Bionovo	B-3693	Falcon type, 50 mL, PP
크로마토그래피 데이터 수집 및 분석 소프트웨어	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
크로마토그래피 인서트 바이알	Agilent Technologies	9301-1387	100 µ L
크로마토그래피 바이알	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL, 투명 유리
디메틸 설폭사이드	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
듀얼 미터 pH/전도도	Mettler Toledo		SevenMulti
증발기	Genevac		모델 EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F9665
Formic acid	Supelco	5.33002	for LC-MS LiChropur
시약 보관	용 유리 병Bionovo	S-2070	50 mL, 투명 유리
가드 컬럼	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 협구경 가드 컬럼 (2.1 x 12.5 mm, 5 µ m)
염산	Merck	1.00317.1000
L-kynurenine	Sigma-Aldrich	K8625	≥ 98% (HPLC)
마그네틱 교반기	Wigo		ES 21 H
Microbalance	Mettler Toledo		모델 XP6
Milli-Q 시스템	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole 질량 분석기	Agilent Technologies	G1948B	모델 6120
페니실린-스트렙토마이신	Sigma-Adrich	048M4874V
플레이트 리더	Bio Tek Synergy		2 Gen5
염화칼	Merck	1.04936.1000
인산이수소 칼	Merck	1.05108.0500
단백질 분석 염료 시약 농축액	BioRad	500-0006
시소 로커	Stuart	SSL4
혈청학 피펫	둥지	326001	5 mL, 폴리스티렌, 비 발열성, 멸균
염화나트륨	Sigma-Aldrich	7647-14-5
인산나트륨 이염 기성	Merck	1.06346.1000
용매 입구 필터	Agilent Technologies	5041-2168	유리 필터, 20 μ m 기공 크기
용매 저장소(LC-MS용)	Agilent Technologies	9301-6524	1L, 투명 유리
용매 저장소(LC-MS용)	Agilent Technologies	9301-6526	1L, 호박색 유리
스프레드시트 프로그램	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Stir bar	Bionovo	6-2003	테플론 코팅
주사기 필터 중간 여과	Bionovo	7-8803	재생 셀룰로오스, Ø 30 mm, 0,45 µ
이동상 성분 여과를 위한 m 주사기 여과	Bionovo	6-0018	나일론, Ø 30 mm, 0,22 &마이크로; m
조직 배양 플레이트	VWR	10062-900	96-wells, 멸균
Trypsin-EDTA 솔루션	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
초고성능 액체 크로마토그래피 시스템	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 Infinity 시스템은 자동 시료 주입기(G1367D), 탈기 장치(G1379B), 이진 펌프(G1312B), 컬럼 온도 조절기(G1316C)로 구성되었습니다.
초음파 목욕	Polsonic	104533	모델 6D
Vortex	Biosan		모델 V-1 플러스
크산투렌산	Sigma-Aldrich	D120804	96%