이 프로토콜은 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역지역화를 위한 식물 물질이 어떻게 고정되는지, 친수성 아크릴 수지에 내장되어, 단면화및 유리 슬라이드에 장착되는지 자세히 설명합니다. 우리는 세포벽 관련 전형이 특정 항체로 검출될 것임을 보여준다.
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이 논문에서
요약
초록
식물 발달은 내부 및 외부 자극에 대한 응답으로 세포벽 조성 및 구조의 지속적인 조정을 포함한다. 세포벽은 단백질, 페놀 화합물 및 물과 함께 셀룰로오스 및 비 셀룰로오스 다당류로 구성됩니다. 세포벽의 90%는 다당류(예를 들어, 펙틴) 및 아라비노갈락탄 단백질(AGP)으로 구성된다. 식물 조직학적 섹션에서 특정 글리칸 에피토프의 형광 면역 국소화는 벽 다당류 네트워크, 구조 및 구성 요소의 리모델링을 발견하는 핵심 도구로 남아 있습니다.
여기서, 우리는 식물 조직에서 AGPs와 펙틴에서 글리칸 에피토프를 검출하기 위해 최적화 된 형광 면역 국소화 절차를보고합니다. 파라포름알데히드/글루타랄데히드 고정은 식물 샘플의 LR-White 포함과 함께 사용되어 조직 구조 및 조성물의 더 나은 보존을 가능하게 하였다. 초미세토메로 수득된 임베디드 샘플의 얇은 섹션은 특정 항체를 이용한 면역지역화를 위해 사용되었다. 이 기술은 뛰어난 해상도, 높은 특이성 및 동일한 샘플에서 여러 글리칸 에피토프를 감지 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 기술은 글리칸의 세포 세포 소중화를 허용하고 세포벽에 축적의 그들의 수준을 검출합니다. 또한 발달 과정에서 AGP 및 펙틴 분포의 현수체 패턴의 결정을 허용합니다. 이 도구의 사용은 궁극적으로 연구 방향을 안내하고 식물의 특정 기능에 글리칸을 연결할 수 있습니다. 더욱이, 얻어진 정보는 생화학적 및 유전자 발현 연구를 보완할 수 있다.
서론
식물 세포벽은 다당류와 당단백질로 구성된 복잡한 구조입니다. 세포벽은 세포유형, 국소화, 발달단계, 외부 및 내부 자극1에따라 건축, 조직 및 구성이 변화하는 매우 역동적인 구조이다. 아라비노갈락탄 단백질(AgPs)과 펙틴은 식물 세포벽의 중요한 성분입니다. AGP는 매우 글리코화 단백질이며펙틴은 상이한 식물 발달 단계2,3,4동안 조성물, 양 및 구조가 크게 변화하는 균질균투로난 다당류이다. AgPs와 펙틴 연구는 프로그램 된 세포 죽음, 무생물 스트레스에 대한 반응, 성적 식물 번식, 많은 다른 사람의 사이에서5와같은 여러 식물 프로세스에 참여한 것으로 나타났습니다. 이 연구의 대부분은 면역 지역화 연구 결과에서 얻은 정보로 시작했습니다.
복잡성을 감안할 때 세포벽연구에는 다양한 도구가 필요합니다. 단일 클론 항체 (mAbs)를 사용하여 글리칸 에피토페를 검출하는 것은이 구조를 따라 다당류 및 당단백질 분포를 해결하는 귀중한 접근 방식입니다. 글리칸 에피토프를 검출할 수 있는 mAbs의 큰....
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프로토콜
1. 샘플 준비 : 고정, 탈수 및 LR-화이트 포함
- 고정 및 탈수
참고: 고정 프로세스는 샘플을 보존하는 데 중요합니다. 분자를 교차 연결하 여 세포 대사 중단, 세포 무결성 보장 하 고 분자 확산을 방지. 고정제 및 사용된 농도는 그 목적에 맞게 조정되어야 하며, 항원이 항체와 상호 작용하기에 충분히 노출되어야 한다. 다음 프로토콜은 파라포름알데히드의 온화한 고정 능력과 글루타랄데히드의 더 강한 효과를 결합합니다. 그들의 비율은 AGPs 및 세포벽 분대에 최적화되었습니다, 그러나 그밖 단백질 및 세포 구조물에 적합합니다. 후속 탈수 공정은 LR-White 포함시 샘플을 준비합니다. 여러 식물 종에서 식물 조직은이 실험에 사용되었다. 퀘르쿠스 스터스터 샘플은 들판에서 자란 나무에서 수집되었습니다. 트리투리아 잠수함 샘플은 폴라 루달 (큐 가든, 런던, 영국)에 의해 친절하게 우리와 함께 공유되었다.- 모든 애기독시스 식물을 토양에 직접 뿌리고 실내 성장 시설에서 60%의 상대 습도와 16h의 16h 빛, 18°C에서 8시간 의 어둠을 가진 실내 성장 시설에서 자랍니다. 분석할 식물 조직을 선택하고 샘플을 16mm2 크기로 트리밍합니다.
- 샘플을 즉시 충분....
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결과
성공적인 실험에서, 이차 항체는 특히 밝은 녹색의 특정 에피토프의 위치를 일관되게, 세포, 조직 또는 기관의 특정 발달 단계에서 세포벽 조성물의 특성화를 가능하게 할 것이다. 예를 들어 LM6 항체는 1,5-아라비난에 대한 높은 친화성을 가지며, 개발 중인 퀘르쿠스 스터버 개미(그림2A)의세포벽을 풍부하게 라벨링하는 것을 발견할 수 있는 타입-I rhamnogalacturonan을 가진 화합물을 가지며, 따라서 이러한 유형의 펙틴이 풍부하고 1차 세포벽 조성물의 일부임을 결론지을 수 있다. JIM5는 일반적으로기관(도 2B)의기계적 특성을 지정하는 퀘르쿠스 스터배아의 루트 끝에서 발견되는 동균균투로난에 대한 친화력을 가지고 있다. Xylogalacturonan는 세포벽 느슨해지는 것과 관련되었던 자일로오스에 풍부한 펙틴의 모형입니다, 그(것)들은 퇴행성 세포에서 있습니다. 항체 LM8은 특히.......
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토론
여기에 설명 된 식물의 형광 면역 지역화 방법은 원활하게 간단하면서도 여러 개의 작은 단계의 성공에 의존합니다. 첫 번째는 샘플 준비 및 고정입니다. 이 첫 번째 단계 동안, 포름알데히드와 글루타랄데히드의 혼합물은 세포 성분의 대부분을 교차 연결하는 데 사용된다. 용액의 포름알데히드는 부드럽고 뒤집을 수 있는 고정을 제공하며 글루타랄데히드는 더 영구적인 연결을 제공합니다. 두 고정제 사이의 균형은 적정량의 교차 연결을 제공하여 에피토프의 노출이 1차항체(10)와반응할 수 있도록 한다. 고정 솔루션이 제대로 작동하려면 샘플이 작아야 합니다. 직경이 7mm 이상인 대형 구조물은 고치기가 매우 어렵고 고정 침투를 보장하기 위해 잘립니다.
상처 나 스트레스 후, 일부 식물은 고정 과정을 방해하는 포름알데히드와 반응 할 수있는 어두운 침전을 형성하는 탄닌의 다량을 분비. 샘플을 얼음에 보관하고 흐려질 때마다 고정 솔루션을 교체하면 이 효과를 줄이.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 H2020-MSCA-RISE-2015및 종자 바퀴 FCT PTDC / BIA-FBT / 27839 /2017에 의해 투자 된 EU 프로젝트 690946 '섹스 시드'(성적 식물 재생 - 종자 형성)로부터 지원을받았다. AMP는 유럽 연합의 MSCA-IF-2016 프로젝트(No. 753328)로부터 보조금을 받았습니다. MC는 FCT 박사 과정 보조금 SFRH/BD/111781/2015로부터 교부금을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 25%(w/v) 글루테알데히드 | Agar Scientific | AGR1010 aq. 용액, 메탄올 무함유 | |
| 8웰 유리 반응 슬라이드 | Marinfeld | MARI1216750 | 기타 브랜드를 사용할 수 있습니다 |
| GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| Anti-Rat IgG(wole 분자)-FITC 항체 | |||
| mm | Marinfeld | MARI0100222 | 커버 슬립은 모든 우물을 덮어야 합니다. 다른 브랜드가 사용될 수 있습니다 |
| DDH2O | na | ||
| absolute ethanol | na | ||
| a Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| 젤라틴 캡슐 | Agar scientific | AGG29211 | 캡슐 크기는 샘플의 크기에 맞아야 합니다. |
| 밀봉 | 수 있는 간단하고 저렴한 유리 바이알을 사용할 수 있습니다. 바이알은 LR-White 잔여물을 제거하기 위해 사용 후 96% 에탄올로 세척하고 재사용할 수 있습니다. | ||
| LR-white 중간 등급, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White는 여러 형태로 제공됩니다. 중간 등급은 대부분의 조직에 적절한 절단 지원을 제공하는 반면, 더 단단한 조직의 경우 더 단단한 등급의 LR-white가 권장될 수 있습니다. 가능하면 이미 Polimeration 활성제(과산화벤조일)와 혼합된 수지를 사용하고, 그렇지 않은 경우 공급업체의 지침에 따라 수지를 준비하십시오. |
| 무지방 건조 우유 | Nestlé | 무지방 분유가 적절한 | |
| 오븐 | 및 | 일반 실험실 오븐 | |
| 페트리 접시, 10cm x 10cm 정사각형 | 및 | ||
| 파이프 | Sigma Aldrich | P1851 | |
| 쥐 생성 단클론 항체 | 식물 프로브 | 세포벽 성분을 인식하는 여러 항체는 Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) 및 Plant Probes(Paul Knox Cell Wall Lab, Leeds University UK)에서 모두 이용할 수 있습니다. 세포벽 성분을 인식하는 여러 항체는 있습니다. 일반적으로 사용되는 일부 MABS 및 구매할 수 있는 곳 의 짧은 목록>< 은 보충 표 1 | |
| 일반 면도날 | |||
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 초박절편기에 | 나와 있습니다.UV | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| 진공 챔버 | 및 | ||
| 진공 펌프 | 및 | ||
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | 다른 페이드 방지 기능을 사용할 수 있습니다. FITC 및 Fluorescente brightner 28과의 호환성을 확인하십시오. (참고: 비상업적 대안의 경우(Jonhson et al 198218 참조) 9:1(v/v) 글리세롤에 25mg/mL의 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane(DABCO)을 1xPBS에 혼합하여 페이드 방지 배지를 만들 수 있습니다. 희석된 HCl로 pH를 8.6으로 조정합니다.) |
참고문헌
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7
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재인쇄 및 허가
