방법 논문

유동 세포형을 사용하여 개발 중인 제브라피시에서 변경된 혈액 형성을 감지하고 양량화합니다.

DOI:

10.3791/61035

⸱

2021년 4월 29일

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 분석법은 배아 제브라피시를 개발하는 데 혈토포이성 세포를 양수화하는 간단한 방법입니다. 해리된 제브라피시로부터의 혈액세포는 혈류 세포측정 분석을 받게 된다. 이것은 돌연변이 동물및 유전 수정 후에 혈액 결점의 검출을 허용합니다.

초록

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척추 동물에서 성숙한 혈액을 포함하는 세포 혈통의 다양성은 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 분화에서 발생합니다. 이것은 유기체의 수명 내내 생기는 중요한 프로세스이고, 배아 발생 도중 관련시킨 분자 통로의 중단은 치명적인 장기 결과를 가질 수 있습니다. 여러 가지 이유로, 제브라피쉬(다리오레리오)는조혈을 연구하는 모델 유기체가 되었습니다. Zebrafish 배아는 외부적으로 발전하고, 7일 후에 풍부하게함 (dpf)까지 그들의 일생을 위해 지속될 결정적인 혈액 세포의 대부분의 특수형을 생성했습니다. 조혈 세포의 수를 평가하는 분석이 개발되었으며, 주로 특정 조직학적 얼룩, 시상 혼성화 기술 및 형광 단백질의 발현을 유도하는 혈액 세포 별 프로모터를 활용하는 형질 세포 특이적 프로모터를 활용하는 형질 동물의 현미경 검사를 활용하고 있다. 그러나, 대부분의 염색 된 애법과 현장에서 혼성화 기술은 정확하게 존재하는 혈액 세포의 수를 양량하지 않습니다; 셀 수의 큰 차이만 쉽게 시각화할 수 있습니다. 형질 또는 공초점 현미경 검사를 가진 개별을 분석하는 것은 수행될 수 있습니다, 그러나 이 분석의 양은 수동으로 계산하거나 고가의 화상 진찰 소프트웨어를 이용에 의존합니다, 둘 다 오류를 만들 수 있습니다. 혈액 세포 수를 평가하는 추가 방법의 개발은 경제적일 것이고, 더 빨리, 심지어 CRISPR 매개 유전자 수정의 효력, 모르폴리노 중재한 성적증명서 감소 및 대규모에 조혈증에 영향을 미치는 약 화합물의 효력을 신속하게 평가하기 위하여 자동화될 수 있었습니다. 혈액 세포를 양화하는 이 새로운 분석은 전체 제브라피시 배아를 해리하고 존재하는 형광표 혈액 세포의 양을 분석해서 수행됩니다. 이 분석서는 혈액 세포 생성, 확장 및 태아 발생 도중 규칙에 책임 있는 분자 통로의 elucidation를 허용해야 합니다, 이는 연구원이 혈액 질병 도중 변경된 새로운 요인을 추가로 발견할 수 있을 것입니다, 뿐만 아니라 척추 동물 조혈의 진화 도중 필수적인 통로.

서론

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혈액 생산 (혈종)은 초기 배아에서 처음 시작되는 필수적인 발달 과정입니다. 이 과정은 원시적 적혈구와 대식세포를 중구로부터 직접 생성하여 시작하여 나중에 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 생산으로 전환합니다. 다능성 인 이 줄기 세포는 유기체에서 성숙한 혈액 세포의 모든 종류를 생성합니다. 자체 갱신이 가능한 이 시스템은 이러한 HSPC를 통해 지속적으로 보충됩니다. 이 과정은 개발 초기에 시작되는 동안, 혈액 조혈은 동물의 생명을 위해 계속, 신체의 먼 사이트에 산소를 수송 하는 기능을 제공, 부상 후 출혈을 중지, 감염에서 시체를 보호. 이 복잡한 시스템의 발달은 발달 도중 시간적으로 그리고 공간적으로 통제되고 혈액 세포 생산에 있는 어떤 동요든지 유기체를 위한 치명적일 수 있습니다, 빈혈, 혈소판감소증, 백혈병 및 백혈병의 결과로.

조혈 연구에 사용되는 인기있는 동물 모델은 인간과 비교할 때 혈액 발달이 유사하기 때문에 제브라피시(Danio rerio)입니다. 사실, 조혈 중에 사용된 많은 유전자와 분자 통로는 척추 동물 진화 전반에 걸쳐 보존되어 제브라피시를 연구하여 인간 유전자에 대해 배울 수 있게 합니다. 중요한 것은, 제브라피시 배아는 바디 외부에서 발전하고 7 일 안에 가장 성숙한 혈액 세포 모형을 생성했습니다, 짧은 시간에 조혈 계통의 직접적인 가시화를 허용하. Zebrafish는 또한 매우 fecund, 이는 연구원이 재현 가능한 데이터를 생성하는 데 중요한 짧은 시간 프레임에서 샘플의 더 많은 수를 관찰 할 수 있습니다. 제브라피쉬의 짧은 생성 시간 및 외부 발달은 돌연변이 발생 연구1,2,3,4,5 및 약물 스크리닝6,7,8,9,10동안 보다 쉽게 조작 및 관찰을 제공한다. 이것은 인간 혈액 무질서를 위한 유망한 치료 화합물의 패널이 신속하고 능명하게 시험될 수 있게 합니다.

중요한 것은, 제브라피쉬는 또한 유전적으로 순종하며, 게놈은 순서와 부가된다. 이 기관성은 모르폴리노와 같은 역유전학 기술을 허용합니다-(MO-) 중재된 녹다운 및 CRISPR 매개 유전 절제술이 수행될 수 있습니다. Zebrafish는 또한 앞으로 유전 스크린을 수행하는 모델로 자신의 유틸리티를 입증했다; 척추 동물 혈액 형성에 관련 된 많은 필수 유전자와 경로이러한 방식으로 발견 되었습니다. 혈액 세포를 관찰하는 수많은 방법은 또한 제브라피시에서 개발되었습니다. 전통적인 조직학적 염색 기술이 존재하지만 혈액 특이적 성적증명서에 대한 시투 혼성화에서도 수행할 수 있습니다. 중요한 것은, 수많은 형질전환선도 존재하여 형광 단백질이 계보 특이적 프로모터에 의해 발현되어 형광단백질(11)을가진 특정 혈액 세포의 라벨링을 허용한다. 이것은 연구원이 시간이 지남에 따라 살아있는 유기체에 있는 혈액 세포 창세기, 확장 및 규정의 상시 관측을 능력을 발휘할 수 있습니다.

전반적으로, 조혈 시스템의 보존, 형질 대사의 존재와 쉬운 개발, 쉬운 시각화, 짧은 세대 시간은 제브라피쉬가 패혈증의 경제적이고 빠르며 적응 가능한 모델로 만들었습니다. Zebrafish 연구원을 위해 사용할 수 있는 기술의 도구 상자를 개선하기 위해, 우리는 태아에 있는 혈액 세포의 수를 강력하게 양을 하기 위하여 이 분석법을 개발했습니다. 이 방법은 형질전환 동물을 소화하고 형광 혈액 세포를 위한 유동 세포측정을 능력을 발휘하는 관련시킵니다. 이러한 방식으로, 돌연변이 동물로부터의 혈액 세포, MO 및 CRISPR 수정의 효과 및 소분자의 효과는 빠르고 재현 가능한 방식으로 정량적으로 분석될 수 있다. 이러한 소는 시간이 지남에 따라 그들의 세대, 증식 및 유지 보수의 검사를 허용, 혈액 세포를 열거 하는 사용자 친화적 이고 경제적인 방법.

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프로토콜

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캘리포니아 주립 대학 치코의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문위원회는 아래에 설명 된 모든 방법을 승인했습니다.

참고: 1페닐 2-티오레아(PTU)로 배아를 치료하는 것이 좋습니다. 표 1) 24시간 후유증(hpf)에서 유동 세포측정에 의한 형광 차별에 부정적인 영향을 미치는 색소 침착을 방지한다. 아래에 나열된 모든 절차는 유동 세포 측정 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 허용됩니다. 그러나 FACS 후 조혈 세포를 배양하는 것이 목표라면 샘플을 처리 할 때 멸균 관행을 준수하십시오. 멸균 방식으로 배아 샘플을 표백 및 준비하기 위한 프로토콜은 이전에12에기술되었다.

1. 48 hpf 제브라피시 배아의 반향

  1. 10cm 플라스틱 페트리 접시에 배아(최소 5개, 배아 200개 이상)를 사용하면 배아가 바닥 가장자리로 가라앉도록 접시를 기울입니다.
    참고 : 뚜껑을 제거하고 페트리 접시의 한 가장자리 아래에 뚜껑을 배치하여 접시를 기울이기 쉽습니다.
  2. 제거 및 가능한 한 많은 E3 매체(표 1)를폐기하고 불반향 protease (10 mg / mL)의 500 μL을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
  3. 5분 후, 페트리 접시(모든 배아를 접시 의 하단 가장자리에 유지)를 집어 들고 페트리 접시의 측면을 부드럽게 탭하여 배아가 접시 바닥에 부드럽게 문질러 서 채온을 완전히 제거합니다.
  4. 스퀴즈 병으로 E3 배지 ~20mL를 추가하여 프로테아지를 희석시보냅니다. 배아가 해독하여 E3 배지를 정착시키고 제거할 수 있도록 합니다.
  5. 단계 1.4 3x를 반복하여 반향 프로테아제의 모든 흔적을 제거합니다.
    참고: 각 개별 샘플을 분석하려면 적어도 5개의 배아가 필요합니다. 이 불반향 절차는 페트리 접시 당 최대 200 개의 배아를 수용 할 수 있습니다. 샘플은 이 단계에서 그룹화하고 원하는 경우 나중에 분리할 수 있습니다. 또는, 수동 비반향은 시계 제작자의 집게로 부드럽게 chorions를 찢어서 수행 할 수 있습니다. 이것은 태아의 작은 숫자가 있을 때 유리합니다. 일반적으로 제브라피쉬는 72hpf로 그들의 chorions에서 부화합니다. 그러나 심하게 기형된 배아는 그렇지 않을 수 있으며, 그 시간 이후에는 비반향(수동 또는 화학 물질)이 필요할 것입니다.

2. 해리를 위한 배아 샘플 준비

  1. P1000 파이펫을 사용하여 5-10 개의 배아를 단일 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에 놓습니다.
  2. 파이펫으로 E3 매체를 제거하고 폐기합니다.
    주의: 배아가 다음 단계에서 쉽게 버릴 수 있기 때문에 주의하는 파이펫.
  3. 10mM 디티오트리톨(DTT)의 1mL를 E3 배지에 추가하여 배아 제브라피시(11,12,13,14)를둘러싼 점액코팅을제거한다. 마이크로센트심분리기 튜브를 수평으로 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

3. 배아 해리

  1. DTT의 흔적을 제거하기 위해 Ca2+ 및 Mg 2+로 덜벡코의 인산완충식염(DPBS)의 1mL로 배아 3배를 세척합니다. 마지막 세척 후 Ca2+ 및 Mg2+ 및 5 μL5 mg/mL (26 U/mL) 해리 프로테아이즈와 DPBS의 500 μL을 추가합니다.
    참고: 다른 동소완충액이 사용될 수 있지만 해리 효소가 제대로 작동하려면 Ca2+ 및 Mg2+를 포함해야 합니다.
  2. 60 분 동안 185 rpm에서 수평 궤도 셰이커에 37 °C에서 샘플을 배양합니다. 샘플이 완전히 해리 될 때까지 P1000 파이펫으로 배아를 삼각합니다.
    주의: 배아를 과소화하지 않도록 주의하십시오. 일부 고체 조직이 존재해야하며 완전히 균일해서는 안됩니다. 과다 소화가 가능하며, 이는 혈류 세포계(보충도 1)에서관찰되는 표적 혈액 세포를 파괴할 것이다.
    참고 : 이 절차는 48-72 hpf 배아에 가장 적합합니다. 이후 단계는 해리 프로테아제와 더 긴 잠복이 필요할 수 있습니다. 다른 단계에 대한 타이밍은 경험적으로 결정해야합니다. 배아 조직을 해리하는 더 빠른 대체 방법이 있지만, 이 방법은 60 분이 걸리지만 살아있는 조혈 세포의 효율적인 격리를 허용 할 만큼 부드럽고 철저하다는 것을 경험적으로 발견됩니다.

4. 유동 세포종에 대한 해리된 배아의 준비

  1. 파이펫 5 해리 배아는 35 μmM 세포 스트레이너 캡을 가진 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브의 상단 저수지에 분리된 배아.
  2. 여과된 세포를 포함하는 5mL 폴리스티렌 튜브의 스트레이너 캡에 Ca2+ 또는 Mg2+가 없는 4mL의 인산염 완충식식염(PBS)을 첨가하여 세포를 헹구는 세포를 헹구는 세포를 헹구는 다.
    참고: 다른 동소완충액도 사용될 수 있지만, 해리 효소를 희석하고 비효율적이게 만들기 위해 Ca2+ 또는 Mg2+가 부족해야 합니다.
  3. 원심분리기 튜브는 4°C, 300 x g에서 5분 동안 세포를 펠릿합니다. 파이펫으로 상체를 제거하고 폐기합니다. PBS의 500 μL에서 세포를 다시 일시 중지합니다 (Ca2+ 또는 Mg2 +없음).

5. 유동 세포측정

  1. 셀 현탁액을 부드럽게 소용돌이쳐 1:1,000 개의 붉은 죽은 세포 얼룩(재료 표)을추가합니다.
    참고: 적색 세포 얼룩은 표적 세포로부터 죽은 세포와 이물질을 배제할 수 있는 세포 투과성 염료이며, 633nm 레이저에 의해 흥분되기 때문에, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 DRed와 같은 일반적인 형광을 자극하는 데 사용되는 488 nm 레이저와 는 다른 것으로 나타났습니다. 이런 식으로, 죽은 세포와 형질 전환 혈액 세포에서 스펙트럼 중복이 없습니다. 1 mg/mL에서 프로피듐 요오드 (PI)는 붉은 죽은 세포 얼룩에 대한 저렴한 대안이지만, 피의 플루오로포어만으로 PI로 얼룩진 일부 샘플을 예약해야합니다. 그렇지 않으면 GFP와 같은 PI 및 형광구의 신호가 겹쳐져 거짓 양성 결과가 발생합니다. 유동 세포계에도 405nm 레이저가 있는 경우, 블루 아빠 세포 얼룩과 같은 다른 염료도 탁월한 선택입니다.
    주의: 혈액 세포를 분석할 때, 30 분 후에 특정 세포 모형이 빨간 죽은 세포 얼룩을 phagocytose 하기 시작할 것이라는 점을 주의하십시오. 분석될 때까지 빛과 얼음에서 세포를 보호하고 염료를 첨가한 지 30분 이내에 유동 세포측정을 수행합니다.
  2. 유동 세포측정 분석
    참고: 모든 흐름 사이토미터는 약간 다르지만 다음 단계는 대부분의 컴퓨터에서 분석을 위한 샘플을 준비하는 데 도움이 됩니다. 세포측정을 유동하는 사용자를 위해 특정 장비에 대한 전문가인 사람의 조언을 구하십시오. 다음 지침은 BD FACSAria 융합 흐름 세포계에 관련이 있습니다.
    1. 사이토미터를 켜고 레이저가 20분 동안 따뜻해집니다. 빈 폐기물 탱크, 적절한 솔루션 (흐름 세포계에 따라 다름)와 칼집 탱크를 채우고 유체 시스템을 시작합니다.
      참고: 일반적으로 각 유형의 유동 세포계에 대한 특정 시작 절차가 있습니다. 해당 시작 절차를 신중하게 따르십시오.
    2. 분석 소프트웨어에서 5개의플롯(그림 1A)을그립니다.
      1. y 축의 x 축 및 측면 분산(SSC)에 대한 첫 번째 점 플롯 측정 전방 분산(FSC)을 갖습니다. FSC를 선형으로 설정하고 SSC를 로그로 설정합니다.
        참고: FSC는 셀 크기의 측정이며, SSC는 세분성의 측정이다; 이것은 파편에서 세포의 차별을 허용할 것입니다. 배아 제브라피쉬 혈액세포는 이전에 설명된 성인 제브라피시 혈액세포와 동일한 방식으로 크기 및 세분성에 의해 분리되지않는다. 대신 그(것)들은 그밖 모든 소화한 배아 세포를 가진 동일 인구에서 나타날 것입니다.
      2. 두 번째 플롯을 설정하여 FSC 높이(H)와 FSC 너비(W)를 검사합니다. SSC(H)와 SSC(W)를 측정하기 위해 세 번째 플롯을 설정합니다.
        참고: 이 단계는 이중(레이저를 통과할 때 함께 붙어 있는 셀)을 제외하는 데 사용됩니다.
      3. x 축의 적색 죽은 세포 얼룩을 측정하기 위해 네 번째 점 플롯을 설정합니다 (사이토미터에 따라 이는 일반적으로 동종 코시아니닌 [APC]에 사용되는 필터와 동일합니다) 및 y 축의 SSC. 이것은 죽은 세포에서 살아있는 세포의 차별을 허용할 것입니다.
        참고: 각 사이토미터의 필터 세트는 다를 수 있습니다. 죽은 세포 차별 염료에 올바른 검출 필터를 사용해야 합니다.
      4. 다섯 번째 플롯은 선택의 불소를 측정합니다. 이를 형광소(도1)의히스토그램으로 시각화하거나 점도플롯(보충도 2)을사용한다.
        참고: 동일한 동물에서 둘 이상의 플루오로포어를 검사할 때 점 플롯을 사용하여 두 매개 변수를 동시에 보는 것이 좋습니다. 형광이 서로 스펙트럼 중복될 가능성이 있는경우(보조도 2),점도 도표도 추천합니다. 영역(A) 설정을 사용하여 모든 매개 변수에 대해 사이토미터의 레이저 펄스에 의해 생성된 곡선 아래 영역을 계산합니다.
    3. 샘플을 로드하고 샘플이 빠르게 실행되지 않도록 유량을 줄입니다. 세포 집단의 대부분을 명확하게 볼 수 있도록 FSC 및 SSC 설정을 조정합니다(그림1A).
    4. 세포 인구 주위에 게이트를 그리고 그것을 세포를 레이블. 두 번째 점 플롯이 셀에 게이트되어 있는지 확인하고, FSC에서 첫 번째 게이팅을 한 다음 SSC 싱글t에서 더블을 제외합니다.
    5. 네 번째 플롯에서 빨간색 죽은 세포 얼룩 설정을 조정하여 분명히 부정적인 집단이 있습니다. 이 세포 주위에 게이트를 그리고 그(것)들을 살아있는 세포에 레이블을 지정합니다. 다섯 번째 플롯에서, 살아있는 세포에 게이트와 형광소 음성 및 양성 세포를 검사. 양수 세포 주위에 게이트를 그립니다.
      참고: 이 계층적 게이팅 전략은 세포 게이트에 있는 살아있는 세포 게이트에 있는 단 하나 형광구+ 세포를 검사합니다. 게이트를 올바르게 설정하십시오. 이러한 게이트는 실험에 따라 사용자 지정할 수 있습니다.
    6. 각 샘플을 실행하여 적어도 25,000개의 라이브 셀 이벤트를 수집합니다.
    7. 종료 절차를 따라 유체를 끕니다. 칼집 탱크를 리필하고 폐기물 탱크를 비웁니다.
      참고: 단백질 발현이 낮거나 세포 집단이 드물때 형광+ 세포를 시각화하는 것은 종종 어렵습니다. 파라미터가 제대로 설정되도록 하기 위해, 플루오로포레- 형제 배아는 제대로 게이트를 그리고 레이저 전압을 조정하기 위하여 함께 준비되어야 합니다(보충 도 2). 대상 세포 집단이 드문 경우 25,000개 이상의 이벤트를 수집합니다. 5-10 소화 된 동물, 하나는 이벤트의 수백만을 수집 할 수 있어야합니다. 불소공포증+ 세포의 총 수는 또한 이 데이터로 얻을 수 있다. 단순히 혈류계와 샘플에서 세포의 총 수를 계산하고 물고기 당 형광요법+ 세포의 절대 수를 얻기 위해 형광 + 세포의 비율을 곱합니다.

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결과

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배아 제브라피시에서 적혈구를 열거하기 위해 lcr:GFP16 배아는 PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, 또는 7.0 ng/nL ism1 MO를 가진 1세포 단계에서 7.0 ng ism1 mRNA12를주입하였다. 48 hpf에서 그들은 소화되었고 혈류 세포 측정 분석을 실시하였다. 각 샘플에서 GFP+ 적혈구의 백분율을 분석한 후(각 샘플은 5개의 무작위로 선택된 배아; 도 1A)모든 대조군의 평균이 계산되었다. 이 평균은 1로설정되었으며 모든 백분율은 해당 참조점에서 계산되었습니다. 이러한 데이터는 특정 MO를 사용하여 ism1 성적증명서를 감소시켜 48hpf 배아에 존재하는 GFP+

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토론

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Zebrafish는 원시적이고 확실한 척추동물 조혈을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 지난 수십 년 동안 여러 분석이 개발되고 정제되어 제브라피쉬가 약물 검사, 유전 돌연변이 생성 및 테스트, 전체적으로 조혈에 필수적인 분자 경로를 분석할 수 있도록 하는 빠르고 경제적인 모델이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 빠른 데이터 수집, 성인 동물보다 적은 물리적 공간의 사용, 대규모 화학 스크린에 대한 적은 약물의 사용을 허용하는 배아 얼룩말 피시를 사용합니다. 또한 mRNA의 과발현, CRISPR 돌연변이체 생성 및 MO 유도 된 성적 증명서 감소 후 의 양을 허용하여 초기 배아 발달 중에 발생하는 특정 유전 경로를 변경합니다. 중요한 것은, 그것은 현장 혼성화 또는 조직학적 염색 기술에서 할 어려운 혈액 세포의 민감하고 강력한 양을 허용합니다.

이 분석은 유연하며 많은 연구 질문에 대답하도록 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜의 1개의 수정은 동물의 발달 단계가 다른 혈액 세포...

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공개 사항

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D.L.S.는 과학 컨설턴트이며 핀리스 푸드, Inc.와 Xytogen 생명 공학, Inc.K.F.R.로부터 보상을 받았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기금은 국립 보건원 (NIH: R15 DK14732-01에서 D.L.S.), 국립 과학 재단 (NSF: MRI 1626406에서 D.L.S.까지), 캘리포니아 주립 대학 치코 (K.F.R.에)의 명예 프로그램에서 제공되었습니다. 저자는 실험실 관리에 대한 벳시 타미에티와 행정 지원을 캐시 존스 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5ml MCF 튜브FisherBrand05-408-129
10mm 폴리스티렌 easygrip 페트리 접시Corning Falcon351008
셀 스트레이너 캡이 있는 5ml 폴리스티렌 원형 바닥 튜브Corning Falcon352235
BD FACSAria Fusion 유세포 분석기BD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich
646563 DPBS(10x) with Ca2+ and Mg2+Life Technologies14080-055
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
LibreaseRoche Sigma-Aldrich5401119001dissociation protease
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001디코리온네이션 프로테아제
SYTOX 레드 데드 셀 염색Invitrogen S34859

참고문헌

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