방법 논문

유동 세포형을 사용하여 개발 중인 제브라피시에서 변경된 혈액 형성을 감지하고 양량화합니다.

DOI:

10.3791/61035

⸱

2021년 4월 29일

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 분석법은 배아 제브라피시를 개발하는 데 혈토포이성 세포를 양수화하는 간단한 방법입니다. 해리된 제브라피시로부터의 혈액세포는 혈류 세포측정 분석을 받게 된다. 이것은 돌연변이 동물및 유전 수정 후에 혈액 결점의 검출을 허용합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

척추 동물에서 성숙한 혈액을 포함하는 세포 혈통의 다양성은 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 분화에서 발생합니다. 이것은 유기체의 수명 내내 생기는 중요한 프로세스이고, 배아 발생 도중 관련시킨 분자 통로의 중단은 치명적인 장기 결과를 가질 수 있습니다. 여러 가지 이유로, 제브라피쉬(다리오레리오)는조혈을 연구하는 모델 유기체가 되었습니다. Zebrafish 배아는 외부적으로 발전하고, 7일 후에 풍부하게함 (dpf)까지 그들의 일생을 위해 지속될 결정적인 혈액 세포의 대부분의 특수형을 생성했습니다. 조혈 세포의 수를 평가하는 분석이 개발되었으며, 주로 특정 조직학적 얼룩, 시상 혼성화 기술 및 형광 단백질의 발현을 유도하는 혈액 세포 별 프로모터를 활용하는 형질 세포 특이적 프로모터를 활용하는 형질 동물의 현미경 검사를 활용하고 있다. 그러나, 대부분의 염색 된 애법과 현장에서 혼성화 기술은 정확하게 존재하는 혈액 세포의 수를 양량하지 않습니다; 셀 수의 큰 차이만 쉽게 시각화할 수 있습니다. 형질 또는 공초점 현미경 검사를 가진 개별을 분석하는 것은 수행될 수 있습니다, 그러나 이 분석의 양은 수동으로 계산하거나 고가의 화상 진찰 소프트웨어를 이용에 의존합니다, 둘 다 오류를 만들 수 있습니다. 혈액 세포 수를 평가하는 추가 방법의 개발은 경제적일 것이고, 더 빨리, 심지어 CRISPR 매개 유전자 수정의 효력, 모르폴리노 중재한 성적증명서 감소 및 대규모에 조혈증에 영향을 미치는 약 화합물의 효력을 신속하게 평가하기 위하여 자동화될 수 있었습니다. 혈액 세포를 양화하는 이 새로운 분석은 전체 제브라피시 배아를 해리하고 존재하는 형광표 혈액 세포의 양을 분석해서 수행됩니다. 이 분석서는 혈액 세포 생성, 확장 및 태아 발생 도중 규칙에 책임 있는 분자 통로의 elucidation를 허용해야 합니다, 이는 연구원이 혈액 질병 도중 변경된 새로운 요인을 추가로 발견할 수 있을 것입니다, 뿐만 아니라 척추 동물 조혈의 진화 도중 필수적인 통로.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

혈액 생산 (혈종)은 초기 배아에서 처음 시작되는 필수적인 발달 과정입니다. 이 과정은 원시적 적혈구와 대식세포를 중구로부터 직접 생성하여 시작하여 나중에 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 생산으로 전환합니다. 다능성 인 이 줄기 세포는 유기체에서 성숙한 혈액 세포의 모든 종류를 생성합니다. 자체 갱신이 가능한 이 시스템은 이러한 HSPC를 통해 지속적으로 보충됩니다. 이 과정은 개발 초기에 시작되는 동안, 혈액 조혈은 동물의 생명을 위해 계속, 신체의 먼 사이트에 산소를 수송 하는 기능을 제공, 부상 후 출혈을 중지, 감염에서 시체를 보호. 이 복잡한 시스템의 발달은 발달 도중 시간적으로 그리고 공간적으로 통제되고 혈액 세포 생산에 있는 어떤 동요든지 유기체를 위한 치명적일 수 있습니다, 빈혈, 혈소판감소증, 백혈병 및 백혈병의 결과로.

조혈 연구에 사용되는 인기있는 동물 모델은 인간과 비교할 때 혈액 발달이 유사하기 때문에 제브라피시(Danio rerio)입니다. 사실, 조혈 중에 사용된 많은 유전자와 분자 통로는 척추 동물 진화 전반에 걸쳐 보존되어 제브라피시를 연구하여 인간 유전자에 대해 배울 수 있게 합니다. 중요한 것은, 제브라피시 배아는 바디 외부에서 발전하고 7 일 안에 가장 성숙한 혈액 세포 모형을 생성했....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

캘리포니아 주립 대학 치코의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문위원회는 아래에 설명 된 모든 방법을 승인했습니다.

참고: 1페닐 2-티오레아(PTU)로 배아를 치료하는 것이 좋습니다. 표 1) 24시간 후유증(hpf)에서 유동 세포측정에 의한 형광 차별에 부정적인 영향을 미치는 색소 침착을 방지한다. 아래에 나열된 모든 절차는 유동 세포 측정 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 허용됩니다. 그러나 FACS 후 조혈 세포를 배양하는 것이 목표라면 샘플을 처리 할 때 멸균 관행을 준수하십시오. 멸균 방식으로 배아 샘플을 표백 및 준비하기 위한 프로토콜은 이전에12에기술되었다.

1. 48 hpf 제브라피시 배아의 반향

  1. 10cm 플라스틱 페트리 접시에 배아(최소 5개, 배아 200개 이상)를 사용하면 배아가 바닥 가장자리로 가라앉도록 접시를 기울입니다.
    참고 : 뚜껑을 제거하고 페트리 접시의 한 가장자리 아래에 뚜껑을 배치하여 접시를 기울이기 쉽습니다.
  2. 제거 및 가능한 한 많은 E3 매체(표 1)를폐기하고 불반향 protease (10 m....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

배아 제브라피시에서 적혈구를 열거하기 위해 lcr:GFP16 배아는 PBS, 7.0 ng/nL ism1 MO, 또는 7.0 ng/nL ism1 MO를 가진 1세포 단계에서 7.0 ng ism1 mRNA12를주입하였다. 48 hpf에서 그들은 소화되었고 혈류 세포 측정 분석을 실시하였다. 각 샘플에서 GFP+ 적혈구의 백분율을 분석한 후(각 샘플은 5개의 무작위로 선택된 배아; 도 1A)모든 대조군의 평균이 계산되었다. 이 평균은 1로설정되었으며 모든 백분율은 해당 참조점에서 계산되었습니다. 이러한 데이터는 특정 MO를 사용하여 ism1 성적증명서를 감소시켜 48hpf 배아에 존재하는 GFP+

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish는 원시적이고 확실한 척추동물 조혈을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 지난 수십 년 동안 여러 분석이 개발되고 정제되어 제브라피쉬가 약물 검사, 유전 돌연변이 생성 및 테스트, 전체적으로 조혈에 필수적인 분자 경로를 분석할 수 있도록 하는 빠르고 경제적인 모델이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 빠른 데이터 수집, 성인 동물보다 적은 물리적 공간의 사용, 대규모 화학 스크린에 대한 적은 약물의 사용을 허용하는 배아 얼룩말 피시를 사용합니다. 또한 mRNA의 과발현, CRISPR 돌연변이체 생성 및 MO 유도 된 성적 증명서 감소 후 의 양을 허용하여 초기 배아 발달 중에 발생하는 특정 유전 경로를 변경합니다. 중요한 것은, 그것은 현장 혼성화 또는 조직학적 염색 기술에서 할 어려운 혈액 세포의 민감하고 강력한 양을 허용합니다.

이 분석은 유연하며 많은 연구 질문에 대답하도록 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜의 1개의 수정은 동물의 발달 단계가 다른 혈액 세포.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.L.S.는 과학 컨설턴트이며 핀리스 푸드, Inc.와 Xytogen 생명 공학, Inc.K.F.R.로부터 보상을 받았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기금은 국립 보건원 (NIH: R15 DK14732-01에서 D.L.S.), 국립 과학 재단 (NSF: MRI 1626406에서 D.L.S.까지), 캘리포니아 주립 대학 치코 (K.F.R.에)의 명예 프로그램에서 제공되었습니다. 저자는 실험실 관리에 대한 벳시 타미에티와 행정 지원을 캐시 존스 감사합니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5ml MCF 튜브FisherBrand05-408-129
10mm 폴리스티렌 easygrip 페트리 접시Corning Falcon351008
셀 스트레이너 캡이 있는 5ml 폴리스티렌 원형 바닥 튜브Corning Falcon352235
BD FACSAria Fusion 유세포 분석기BD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich
646563 DPBS(10x) with Ca2+ and Mg2+Life Technologies14080-055
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
LibreaseRoche Sigma-Aldrich5401119001dissociation protease
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001디코리온네이션 프로테아제
SYTOX 레드 데드 셀 염색Invitrogen S34859

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  2. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. , 303-309 (1996).
  3. Ransom, D. G., et al.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문