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방법 논문

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

7.3K 조회수

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DOI:

10.3791/61046

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2020년 6월 14일

 ,  ,  , 
1Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnología y Biomedicina (ERI BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universidad de Valencia

이 논문에서

요약

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

초록

자궁에서 전기화는 포유류 코르티코발생의 근본적인 분자 및 세포 메커니즘을 연구하기 위해 광범위하게 사용되는 생체 내 DNA 전달 기술이다. 이 절차는 관심있는 DNA의 도입을 허용하기 위해 뇌 심실을 활용하고 심실, 신경 줄기 세포를 안대기 세포로 유전 물질의 입구를 지시하기 위해 전극의 쌍을 사용합니다. 이 방법은 연구원이 원하는 세포를 표지하고/또는 그 세포에 있는 관심있는 유전자의 발현을 조작하는 것을 허용합니다. 그것은 여러 응용 프로그램이, 신경 마이그레이션을 대상으로 하는 애서를 포함 하 여, 혈통 추적, 그리고 축 하 경로 찾는. 이 방법의 중요한 특징은 배아 치사 또는 특정 CRE 드라이버 마우스의 부족과 관련된 잠재적 인 문제의 우회를 허용, 그것의 시간 적 및 지역 제어입니다. 이 기술의 또 다른 관련 측면은 다른 발달 나이에 두뇌의 먼 지역에서 유래하는 세포 모형 사이 상호 작용의 연구 결과에서 특히 중요하게 되는 새로운 마우스 선의 생성을 관련시키는 경제 및 측두적인 한계를 상당히 감소시키는 것을 돕습니다. 여기서우리는 공간적으로 그리고 현세적으로 분리되는 세포 집단의 타겟팅을 가능하게 하는 이중 전기화 전략을 설명합니다. 이 접근법으로 우리는 선택된 형광 단백질을 가진 다른 위치에 있는 세포의 다른 특수형을 그(것)들을 시각화하기 위하여, 및/또는 우리는 적당한 시간에 이 다른 세포에 의해 표현된 관심의 유전자를 조작할 수 있습니다. 이 전략은 자궁 전기화의 잠재력을 향상시키고 가까운 접촉을 확립하기 위해 이동하는 시간적이고 공간적으로 분리 된 세포 집단의 행동과 축축한 예측을 통한 장거리 상호 작용의 행동을 연구하여 시간적 및 경제적 비용을 줄이는 강력한 도구를 제공합니다.

서론

대뇌 피질은 매우 복잡하고 복잡하게 구성된 구조입니다. 이러한 정도의 조직을 달성하기 위해, 피질 프로젝션 뉴런은 측두생성을 필요로 하는 복잡한 발달 과정을 거치며, 피질 판의 최종 목적지로의 마이그레이션, 단거리 및 장거리 연결1,,2의확립을 통해 진행된다. 오랜 시간 동안, 코르티코 발생을 연구하는 고전적인 방법은 관심의 유전자의 녹아웃 또는 노크 에 뮤린 모델의 사용에 기초했다. 그러나, 이 전략, 특히 조건부 녹아웃 마우스의 사용은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며, 때로는 유전 적 중복의 존재 또는 특정 CRE 드라이버의 부족에 관한 추가 문제를 제시합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 발생 하는 접근 중 하나는 그 피 질 개발을 연구 하기 위해 요즘 광범위 하 게 사용 된다3,,4. 자궁 에서 전기 화는 신경 줄기 세포와 그들의 자손의 생체 표적을 허용, 체세포 전염에 사용되는 기술이다. 본 방법은 형광 단백질55, 6,6생체 내 유전자 조작을 위해 세포를 라벨링하는 데 사용할 수 있다 (즉, 기능 분석의 이득 또는 손실)7,,8,,9,시험관 내의 전기 폴화 코르티스를 분리하고 세포8,,10을배양하는 데 사용할 수 있다. 더욱이, 자궁 전기기화는 표적 영역의 시간적 및 지역 적 제어를 허용한다. 이 기술은 수많은 응용 프로그램을 가지고 널리 뉴런 마이그레이션을 연구하는 데 사용되어왔다, 줄기 세포 분열, 신경 연결, 및 기타 과목8,,9,,11,,12.

현재 원고는 자궁 전기 기형에서 이중이라고 불리는 자궁 전기 기형의 사용을 설명하며, 대뇌 피질에서 세포의 상호 작용을 서로 다른 측두및 공간 기원으로 분석합니다. 이러한 연구는 여러 형질 전환선의 결합 된 사용을 필요로하기 때문에 뮤린 모델을 사용할 때 완료하는 것은 매우 복잡합니다. 이 논문에 설명된 프로토콜의 응용 프로그램 중 일부는 이웃 세포 간의 긴밀한 상호 작용의 연구뿐만 아니라 장거리 투영을 통해 먼 세포 사이의 상호 작용을 포함한다. 이 방법은 관심의 다른 세포 집단을 표적으로 하기 위하여 동일한 배아에, 측면및 공간적으로 분리된 자궁 전기기 수술에서 2개의 독립적인 능력을 발휘하는 것을 요구합니다. 이 접근법의 장점은 야생 형 동물을 사용하여 뉴런의 하나 또는 둘 다 모형에서 유전자 기능을 조작의 가능성입니다. 또한, 이러한 기능적 실험은 심토플라스믹 또는 멤브레인 태그형 형광 단백질의 발현과 결합하여 물병막 및 축축을 포함한 표적 세포의 미세한 형태를 시각화하고, 대조군(즉, 형광 단백질로만 표지된 세포)과 비교하여 세포 상호 작용의 가능한 차이를 분석할 수 있다.

여기서 묘사된 프로토콜은 신피질 내부의 세포 상호 작용연구에 초점을 맞추고 있지만, 이 전략은 또한 소반15와같은 다른 구조물에서 피판또는 시상13,,14,또는 세포 세포 상호 작용과 같은 자궁 전기포레이션에서 표적화될 수 있는 외피 영역과의 상호 작용을 검사하는 데 사용될 수 있다. 다른 영역의 표적화는 전극의 방향과 DNA가 주입되는 심실 (측면, 세 번째 또는 네 번째)에 기초한다. 여기에 설명된 전략으로, 우리는 기능 실험에서 연결 / 내면의 일반적인 변화를 평가하는 데 유용한 셀의 상당수를 레이블수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 연결의 미세한 변화를 연구하기 위해, 하나는 스파저 라벨링을 얻고 단일세포(16)를식별하기 위해 자궁 전기화에서 수정된 버전을 사용할 수 있다. 요약하자면, 자궁 전기기의 이중은 일시적이고 공간적으로 분리된 세포 집단을 표적으로 하고 통제 조건에서 또는 기능 실험과 결합하여 현세및 경제적 비용을 상당히 줄이는 다목적 방법입니다.

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프로토콜

본 명세서에서 설명된 절차는 실험, 유니버시다드 드 발렌시아의 동물 복지, 컨셀러디아 드 아그리컬투라를 담당하는 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 데사롤로 농촌, 이머젠시아 클리마티카 y 트랜스시시온 에콜로기카 코무니다드 발렌시아나, 스페인 법안의 실제 Decreto 53/2013에서 검토 된 실험실 동물 과학국제위원회 (ICLAS)의 지침을 준수하고 유럽 의회의 지침 2010/63 / EU.

참고: 이 프로토콜은 두 가지 목적을 포함: 1) 첫 번째 연구, 라고 "전략 A", Cajal-Retzius 세포 사이의 상호 작용의 분석을 허용 (CR 세포) 그리고 같은 뇌 반구 내에서 초기 태어난 피질 프로젝션 뉴런; 2) 두 번째 연구, "전략 B", 네오피질의 모순측에 상층 캘러솔 프로젝션 뉴런의 내면을 검사하기 위해 수행된다.

1. 수술 전 준비

  1. DNA 제제
    1. 화학적으로 또는 전기 유능한 대장균 DH5α 세포를 관심 있는 플라스미드로 변환하고, 적절한 항생제로 LB 천막판에 판상화하고, 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
      참고: 여기에 사용되는 모든 플라스미드는 형광 기자 단백질(전략 A 및 CAG-BFP 및 CAG-nEGFP-2A-mtdTomato 전략 B용 CAG-mCherry 및 CAG-EGFP)의 발현을 구동하는 닭 β-actin(CAG)에 대한 일반 프로모터를 함유하고 있다. 그들 모두는 암피실린 (AMP)에 대한 내성을 함유하고 있습니다.
    2. 각 플라스미드 변환에서 개별 식민지를 선택하고 활발한 흔들림 (200 rpm)에서 3-4 시간 동안 세균 배양 튜브에서 루리아 국물 + 암피실린 (LB + AMP)의 2 mL에서 스타터 액체 문화를 시작합니다. 후, 500 mL Erlenmeyer 플라스크에 더 큰 세균 문화를 설정 LB +AMP의 200 mL및 스타터 문화의 1 mL을 추가. 200 rpm에서 궤도 셰이커에서 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
    3. 액체 배양으로부터 순수하고 농축된 플라스미드 DNA를 얻기 위해제조업체의지시에 따라 내독소가 없는 맥시 준비 키트(재료 표)를 사용하십시오. DNA를 ~50-100 μL의 내독소가 없는 Tris-EDTA(TE) 버퍼에서 재생하여 최소 5μg/μL의 농도를 얻습니다.
    4. 각 수술에 대해, 빠른 녹색 염료1 μL을 포함하는 10 μL의 최종 부피, 각 플라스미드에 대한 1 μg/μL의 최종 농도에 대한 관심있는 플라스미드 DNA 용액, 및 내독신이없는 TE 버퍼로 용액을 준비한다. 예를 들어, 빠른 녹색 염료 1 μL, 5 μg/μL 플라스미드 DNA 용액의 2 μL 및 TE 버퍼7 μL을 혼합합니다.
  2. 파이펫 당기
    1. 팁이 1-1.5cm의 길이에 도달 할 때까지 수직 마이크로 피펫 풀러에 유리 모세 혈관 (1/0.58mm 외부 / 내지름)을 당겨 해부 범위에서 약 30 ° 각도로 해부 포셉을 사용하여 손질하십시오.
  3. 수술실 설정
    1. 모든 장비를 수술대에 놓습니다(예: 핀셋, 가위, 집게, 마이크로피펫, 바늘 및 바늘 홀더). 가열 패드를 켜고 멸균 수술 흡수 패드로 덮습니다. 흡입 마취를 위한 기계에 있는 저수지가 이소플루란으로 채워지고, 산소 탱크는 충분한 산소를 포함하고, 시스템이 제대로 작동하는지 확인합니다.
      참고: 수술실과 내성 물질은 가능한 한 멸균상태로 유지해야 합니다(즉, 모든 재료는 수술 전에 자동 으로 보관되어야 하며 표면은 70%의 에탄올로 소독되어야 함). 백금 전극은 수술 전에 70%의 에탄올로 먼저 생식기용 비누로 먼저, 둘째를 신중하게 소독해야 합니다.
    2. 페니실린-연쇄상 구균 1:100을 함유한 멸균 식염수 용액 100mL를 준비하여 10cm 페트리 접시를 채웁니다. 가열 패드 위에 접시를 올려 놓고 용액을 따뜻하게 합니다.
    3. 진통제 용액의 150 μL (예 : 0.1 mg / kg buprenorphine)로 1 mL 주사기를 채웁니다.
    4. 당겨진 파이펫을 1.1.4 단계로 제조한 최종 플라스미드 DNA 용액의 5μL로 적재한다. 모세관을 입으로 조절하는 흡인관 튜브에 연결합니다.

2. 자궁 전기 기공 수술에서 첫 번째

  1. E11.5(전략 A) 또는 E13.5(전략 B) C57BL/6 임신 마우스를 폐쇄 유도 챔버 내부에 2.5% (v/v) 이소플루란을 0.8 L/min에 배치하고 마취될 때까지 기다린다. 가열 패드에 마우스를 전송하고 이소플루란의 지속적인 배달을 위해 마스크에 코를 넣어. 적절한 마취의 지표로 페달 반사의 부재를 확인합니다.
    참고: Embryonic 나이는 질 플러그가 관찰되는 날에 따라 결정됩니다(E0.5).
  2. 진통제 용액 (0.1 mg / kg buprenorphine)을 피하로 임신 한 여성을 주입하십시오. 시술 중에 눈이 건조되는 것을 방지하기 위해 면 봉면을 사용하여 각 눈에 눈 연고 한 방울을 바르십시오.
  3. 전기 면도기로 마우스 복부 부위를 면도하고 70 % (v / v) 에탄올 물티슈로 2배, 요오드 물티슈로 한 번, 마지막으로 에탄올 와이프로 세척합니다.
  4. 가위를 사용하여 동물의 오른쪽 피부를 통해 30mm 길이의 절개를 하고 인접한 피부를 무딘 주걱으로 근육과 조심스럽게 분리합니다. 그 후, 복 벽에 두 번째 절개를합니다.
  5. 이전에 그 중심에 40mm 긴 슬릿을 포함하는 70% 에탄올에 소독된 접힌 티슈 페이퍼 조각으로 복부를 덮습니다. 조심스럽게 반지 집게와 복강에서 자궁을 당깁니다.
    참고: 자궁은 전체 절차 동안 1.3.2 단계에서 준비된 따뜻한 식염수 용액으로 젖게 유지되어야 합니다.
  6. 1.1.4 단계에서 준비된 DNA 용액으로 끌어당겨진 파이펫을 미리 로드합니다. 빠른 녹색 염료가 심실 내부에서 눈에 띄는 때까지 입 제어 흡인관 튜브를 사용하여 선택된 반구의 측면 심실에 배아 당 DNA 용액의 ~0.5 μL을 주입한다.
  7. 주입된 배아의 머리 주위에 집게형 백금 전극을 측면으로 놓습니다(도 1A 및 도 2A에도시된 바와 같이). 원하는 뇌 영역을 대상으로 전극을 지향한다. 양극을 내측 벽쪽으로 지시하여 피질 옷자락(strategy A)을 전극화하거나 측면 피질(strategy B)을 향해 해당 영역에서 생성된 세포에 라벨을 부착합니다.
    참고: 모든 경우에, 심혼및 태반은 배아 생존을 지키기 위하여 피해야 합니다.
  8. 표 1에 표시된 표시에 따라 제곱파 전기포레이터로 전기 펄스의 특정 순서를 적용합니다 (전략 A E11.5 배아: 25 V와 40 ms의 4 개의 펄스, 950 ms 간격으로 분리; 전략 B E13.5 배아: 35 V와 60 ms의 5 펄스, 950 ms 간격).
  9. 조심스럽게 자궁을 집게로 다시 복강으로 놓고 따뜻한 식염수 용액으로 채우고 바늘 6-0 봉합사로 복벽을 닫습니다. 바늘 6-0 봉합사 또는 봉합사 클립을 사용하여 피부에 만든 초기 절개의 양면에 가입하십시오.
  10. 가열 패드에 동물을 유지하고 마취에서 회복 될 때까지 모니터링합니다.  홈 케이지에 배치된 하이드로겔 용액에 추가 용량의 진통(150 μL)을 제공합니다.
  11. 수술 후 24시간, 진통증(150 μL)의 추가 투여를 한다. 가능한 고통과 고통을 위해 육안 검사를 통해 매일 모니터링을 계속하십시오. 동물의 행동을 관찰하고, 정상적인 뒷다리 반사 신경을 테스트하고, 상처를 핥거나 긁는 것으로 인한 손상의 가능한 징후를 검사하십시오.

3. 자궁 전기 기화에서 두 번째

  1. 초기 수술 이틀 후, 2.1-2.3 단계를 반복합니다. 수술 후 임신 한 여성의 회복은 매우 좋지만, 두 번째 수술을 수행하기 전에 정상적인 행동을 보이고 통증이나 고통의 징후가 없는지 확인하십시오 (전략 A용 배아 및 전략 B용 E15.5).
  2. 2.4 단계와 복벽에서의 두 번째 절개와 같이 피부를 통해 30mm 길이의 절개를 하십시오. 2.5 단계에서 설명된 바와 같이 소독된 조직의 위에 자궁을 조심스럽게 노출시합니다.
    참고: 이전에 다른 쪽에서 절개를 방해하지 않도록 주의하십시오.
  3. 전략 A의 경우 이전에 전포된 반구의 측면 뇌 심실로 DNA 용액의 배아당 약 0.5 μL을 주입하고 전략 B를 위한 반구의 측면 뇌 심실에서.
    참고: 정상적인 발달과 재흡수 의 징후가 없는 배아만 사용하십시오.
  4. 2.7단계에서 설명된 바와 같이 배아의 머리 주위에 전극을 놓고, 측면 피질을 향해 양극을 지시하고 표 1에 표시된 표시에 따라 적절한 펄스를 적용합니다(전략 A E13.5 배아: 35V의 5펄스 및 60ms 의 5개의 펄스는 950ms 간격으로 분리됨; 전략 B E15.5 배아: 50 ms 간격의 5개의 펄스: 50ms 의 5개의 펄스)
  5. 단계 2.8-2.10에 설명 된 대로 수술을 계속하고 완료하십시오.

4. 조직 수확 및 단면

  1. 전략 A
    1. 제2 전기기(E17.5) 4일 후, 임산부의 자궁경부 탈구를 수행하고 척추 위치에 놓는다.
    2. 가위를 사용하여, 자궁 뿔을 추출하는 복부 절개를하고 집게와 함께 얼음에 배치 1x 인산 완충 식염수 (PBS)로 채워진 페트리 접시에 배치합니다.
      참고: 저온으로 인해 배아의 마취가 가능합니다.
    3. 핀셋을 사용하여 양수 낭에서 배아를 추출하고 모독으로 담금질범위 하에서 새로운 PBS가 채워진 페트리 접시로 옮습니다. 조심스럽게 집게를 사용하여 배아의 머리를 잡고 먼저 머리와 두개골을 통해 피부를 제거하기 위해 핀셋과 뇌 해부를 실시합니다. 주걱을 사용하여 노출된 뇌를 꺼냅니다.
    4. 숟가락으로 뇌를 수집하고 고정 용액으로 채워진 48 개의 우물 접시에 보관하십시오 (4 % [w / v] 파라 포름알데히드 [PFA] 1 x PBS). 예를 들어 반전된 피성 성현미경을 사용하여 뇌를 검사하여 두 전기기의 성공적인 결과를 즉시 테스트합니다.
    5. 궤도 셰이커에서 4°C에서 하룻밤 사이에 배아 뇌를 고정시하십시오. PFA의 흔적을 제거하기 위해 1 배 PBS로 세척하십시오. 그런 다음 항진균 방부제 (1 x PBS-0.05 % (w / v) 나트륨 아지드로 PBS로 전송합니다.
      주의: PFA와 아지드 나트륨은 사용률 동안 특별한 예방 조치를 필요로 하는 세포 독성 화합물입니다.
    6. 고정된 뇌를 4% (w/v) 낮은 융점 아가로즈를 1x PBS에 포함하고 고화될 때까지 ~10분 기다립니다. 관상 섹션을 얻기 위해 위쪽으로 향하는 후각 전구와 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 진동 조직 홀더에 붙입니다.
    7. 진동을 시작하고 원하는 매개 변수를 선택하십시오: 100 μm 폭, 0.60 μm/s 속도, 진폭 0.60mm.
    8. 진동 용기 내부의 뇌를 확보하고, 1배 PBS 용액으로 채우고, 1x PBS-0.05%(w/v) 나트륨 아지드로 채워진 48개의 웰 플레이트에서 브러시의 도움으로 관상 연쇄 섹션을 수집하여 뇌의 완전한 묘사(예: 잘 섹션 당 약 7개, 배아당 6개)를 수집합니다.
    9. 미세 브러시를 사용하여 현미경 유리 슬라이드에 원하는 섹션을 마운트합니다. 유리 커버립으로 덮습니다. 장기 보관을 위해 광표백 및 광광산화를 방지하는 마운팅 매체를 추가합니다. 수직 성피 형광 현미경의 밑에 슬라이드를 관찰하여 전기 기화 효능을 평가합니다.
  2. 전략 B
    1. 이전에 E13.5 및 E15.5에서 전기포게 된 새끼를 태어나P15까지 기다려 4.1.4 단계에서 사용되는 동일한 고정 용액을 사용하여 경전 관류를 수행하십시오.
    2. 관류 직전에, 인트라피톤으로 75/1 mg/kg 케타민/메데토미딘의 복용량을 투여합니다. 페달 반사가 손실되면 마우스를 supine 위치에 고정하고 가위를 사용하여 중간 선에 따라 복부 절개를 하여 갈비뼈 케이지와 다이어프램을 모두 노출시합니다.
    3. 다이어프램을 자르고 흉곽을 열어 심장에 접근할 수 있습니다. 헤스타트(hemostat)를 사용하여 흉곽을 잡고 오른쪽 아트리움에 미세한 가위로 절개를 합니다.
    4. 유연한 튜브와 연동 성 관펌프에 바늘로 왼쪽 심실을 관통한다. 5.5mL/min(총 시간 ~5분)의 일정한 플럭스에서 4% PFA의 최소 25mL를 전달하여 경질 관류를 시작합니다.
    5. 인퓨전된 동물의 뇌를 해부한다. 먼저 가위와 집게로 머리 위로 피부를 제거합니다. 가위를 사용하여 두개골을 자르기 시작하고 두개골 뼈가 완전히 제거 될 때까지 조심스럽게 두개골 뼈의 부분을 제거하십시오. 마지막으로, 주걱의 도움으로 뇌를 추출합니다.
    6. 뇌를 24개의 웰 플레이트로 옮기고 궤도 셰이커에서 4°C에서 하룻밤 사이에 4% PFA로 고정합니다. PBS에서 PFA를 0.05%(w/v) 나트륨 아지드로 교체하여 고정을 중지합니다.
      참고: 4.1.5 단계에서 표시된 바와 같이, 1배 PBS로 중간 세척을 수행하는 것이 좋습니다.
    7. 반복 단계 4.1.6-4.1.9, 산후 뇌에 대한 진동 파라미터를 변경 (40 μm 폭, 1.20 μm / s 속도, 진폭0.5 mm).
      참고: 면역히스토케 또는 면역형광은 특정 세포 마커를 검출하거나 전기기화에 사용되는 형광 단백질의 신호를 향상시키기 위해 수행될 수 있다.

5. 공초점 형광 이미징 및 분석

  1. 공초점 현미경을 켜고, 장착 된 뇌 섹션을 포함하는 현미경 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 배치하고 형광 이미지가 촬영될 채널을 선택하십시오 (즉, BFP의 경우 420-460 nm, GFP용 490-540 nm, GFP용 490-620 nm 및 570-620 nm).
  2. 샘플 스캐닝을 수행하여 두 개의 서로 다른 파장에서 각 뇌 섹션의 맵 이미지를 얻어 이중 전기기 출력의 일반적인 뷰를 확인합니다. 완료되면 10x 렌즈와 다중 영역-Z 스택-타임랩스 관찰 모드를 선택합니다. 이를 통해 뇌 섹션 내의 다양한 XYZ 국소화에서 형광 이미지의 자동 획득을 할 수 있습니다.
  3. 선택된 각 영역(XY)에서 적절한 이미징 파라미터(즉, 레이저 강도, 광증 감도 및 최소 해상도 1,024 x 1,024)를 설정하고 형광이 보이는 샘플의 평면에 따라 스캐닝(Z)의 깊이를 설정한다.
  4. 선택한 모든 영역의 낮은 배율(10배) 이미지를 얻고 현미경 뷰어 소프트웨어를 사용하여 OIF에서 TIFF 형식으로 내보냅니다.
  5. 60x 렌즈로 변경하고, 5.3단계를 반복하고, 높은 배율 영상을 캡처하여 세포-세포 상호 작용을 보다 상세한 방식으로 관찰한다. 5.4 단계에서 표시된 대로 내보냅니다.
  6. 추가 분석을 위해 모든 이미징 소프트웨어(예: 피지)로 획득한 이미지를 엽니다.

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결과

인접한 세포 간의 상호 작용은 탈구 장소와 다른 시간에 유래: 카잘-레치우스 세포 (CR 세포) 및 초기 마이그레이션 피질 프로젝션 뉴런 (전략 A)

CR 세포와 초기 피질 프로젝션 뉴런의 상호 작용은 이전에 이중 전기 기화 전략8을사용하여 nectin 및 cadherin 접착 분자를 통해 소피 전이를 조절하는 데 필요한 것으로 설명되었다. CR 세포는 칼륨의 가장자리에서 신경 피상에서 유래하고 피질의 가장 피상적 인 부분을 채우기 위해 접선으로 이동, 한계 영역17,,18,,19,피질 프로젝션 뉴런은 대뇌 피질의 증식 영역에서 생성되고 비천성20으로라디로 이동. 두 가지 유형의 세포의 생성에는 현세...

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토론

대뇌 피질 같이 높은 세포 밀도를 가진 지구에 있는 세포 세포 상호 작용의 연구 결과는 복잡한 작업입니다. 중성염을 표지하기 위해 항체의 사용을 포함하는 전통적인 접근은 다른 세포 집단을 위한 특정 마커의 부족 때문에 적합하지 않습니다. 특정 세포 유형이 형광성 단백질을 표현하는 형질 전환 기 의 뮤린 모델의 사용은 뉴런 프로세스를 시각화하는 데 유용하지만, 이것은 그러한 모델의 가용성에 달려 있습니다. 이 작업은 관심있는 유전자의 교란시 두 특정 세포 유형 사이의 상호 작용에 가능한 차이를 시각화하려고 할 때 더욱 복잡합니다. 이러한 모든 문제는 경제적 및 현세적 비용으로 인해 과거에 이러한 연구를 복잡하게 만들었습니다.

자궁 전기 기화와 같은 생체 내 체세포 전이를 허용하는 새로운 기술의 출현은 결합 된 기자와 녹아웃 동물의 사용 또는 생성을 우회하는이 프로토콜에 설명 된 것과 같은 전략을 설계 할 수있는 가능성을 제공하여 이러한 유형의 실험을 보다 실현 가능하게 만듭니다. ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

저자들은 크리스티나 안드레스 카보넬과 유니버시다드 드 발렌시아의 동물 관리 시설 회원들에게 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 시약과 우리와 함께 장비를 공유 이사벨 파리냐스와 새크라멘토 R. 페론에 감사드립니다. I.M.W는 콘셀러티아 드 에두카시온 드 발렌시아 (GJIDI/2018/A/221)의 가란시아 주베닐 계약에 의해 지원되며, D.dA.D는 장관 드 시엔시아, 이유니베르시다데스(MICINN) (FPI-PRE2018-08)의 자금을 지원받습니다. C.Gil-Sanz는 스페인 장관 인 이엔시아, 이노바시온 y 유니버시다데스 (MICINN)에서 라몬 y 카잘 그랜트 (RYC-2015-19058)를 보유하고 있습니다. 이 작품은 RYC-2015-19058 및 SAF2017-82880-R (MICINN)에 자금을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
암피실린 나트륨 염Sigma-AldrichA9518-25G
흡인기 튜브Sigma-AldrichA5177-5EA
베이비 믹스터 지혈제(관류)Fine Science Tools(FST)13013-14
붕규산 유리 모세관WPI1B100-6
부프레노르핀(BUPREX 0,3 mg/ml)Rb Pharmaceuticals Limited
CAG-BFP 플라스미드U.Mü에서 친절하게 제공합니다. ller Lab
CAG-EGFP 플라스미드U.Mü에서 친절하게 제공; ller Lab
CAG-mCherry 플라스미드U.Mü에서 친절하게 제공; ller Lab
CAG-mtdTomato-2A-nGFP 플라스미드U.Mü에서 친절하게 제공; ller Lab
컨포칼 현미경OlympusFV10i
면봉BFHCVDF
시아노아크릴레이트 접착제B. Braun 수술1050044
해부 범위Zeissstemi 305
Dumont 집게 #5 미세 집게미세 과학 도구(FST)11254-20
ECM830 광장 Wave ElectroporatorBTX45-0052
전기 면도기Oster76998
내독소가 없는 TE 완충액QIAGEN1018499
에탄올 물티슈BFHCVDF
Extra Fine Graefe ForcepsFine Science Tools(FST)11150-10
눈 연고Alcon682542.6
빠른 녹색 염료Sigma-AldrichF7252-5G
미세 가위Fine Science Tools (FST)14069-09
형광 LEDCoolLEDpE-300-W
Genopure 플라스미드 맥시 키트Roche3143422001
Halsted-Mosquito 지혈 (봉합사)Fine Science Tools (FST)91308-12
가열 패드UFESAAL5514
반전 에피 형광 현미경NikonEclipse TE2000-S
요오드 와이프Lorsoul
Isofluorane 기화기유량계A15B5001
IsofluraneKarizoo 586259
케타민 (Anastemine)Fatro Ibé rica SL583889-2
Kimtech 정밀 물티슈Kimberly-Clark7252
LB (Lennox) AgarGEN LabkemAGLB-00P-500
LB (Lennox) 육수 GENLabkemLBBR-00P-500
저융점 아가로스Fisher ScientificBP165-25
메데토미딘(진정제)Dechra573749.2
현미경 커버 슬립Menel-Gl Ä ser15747592
Microscope SlidesLabboxSLIB-F10-050
마운팅 매체전자 현미경 과학17984-25
Mutiwell plates (24)SPL Life Sciences32024
Mutiwell plates (48)SPL Life Sciences32048
NaCl (for saline solution)Fisher Scientific10112640
바늘 25 G (BD Microlance 3)Becton, Dickinson and Company300600
궤도 인큐베이터 S150스튜어트 사이언티픽5133
P Selecta 인큐베이터JP Selecta, s.a.
파라포름알데히드PanReac AppliedChemA3813
페니실린-스트렙토마이신시그마 -AldrichP4333
연동 관류 펌프Cole-ParmerEW-07522-30
플래티넘 핀셋, 5mm 직경Btx45-0489
반사 피부 폐쇄 시스템 - 7mm 클립, 100AgnThos203-1000
Reflex 피부 폐쇄 시스템 - 클립 적용기, 7mmAgnThos204-1000
링 집게Fine Science Tools (FST)11103-09
아지드화나트륨PanReac AppliedChem122712-1608
수술용 흡수 패드(스테릴)HK SurgicalPD-M
봉합사(Surgicryl PGA 6-0)SMI 봉합사 재료
주사기 1ml (BD plastipak)Becton, Dickinson and Company303172
조직 배양 접시 100 x 20 mmFalcon353003
수직 마이크로 피펫 풀러Sutter Instrument CoP-30
수직 현미경NikonEclipse Ni
VibratomeLeicaVT1200S
9214250485472 상자BYD11071512

참고문헌

  1. Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102(2017).
  2. Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
  7. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  8. Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
  9. Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
  10. Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
  11. Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
  12. Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
  13. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
  14. Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
  15. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
  16. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139(2017).
  17. Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
  18. Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
  19. Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
  20. Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
  21. Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
  22. Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
  23. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
  24. Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
  25. Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
  26. Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
  27. Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36(2017).
  28. DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).
  29. Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).

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