Method Article

호스트 범위 및 시각적 선택을 사용하여 신속하고 원활한 재조합 Poxviruses 생성

DOI:

10.3791/61049

⸱

May 24th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medial Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of California Davis, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch at Galveston

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이는 재조합 바이러스의 호스트 범위 선택 및 시각적 식별을 사용하여 "무소" 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법이다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

백시니아 바이러스 (VACV)는 자연에서 천연두의 원인 인 바리올라 바이러스 (VARV)를 근절하는 데 중요한 역할을했습니다. 백신으로 처음 사용된 이후, VACV는 치료 백신및 온용해 바이러스의 벡터로 개발되었습니다. 이러한 응용 분야는 VACV의 쉽게 조작할 수 있는 게놈 및 광범위한 숙주 범위를 다양한 치료 응용 분야와 함께 재조합 바이러스를 생성하는 뛰어난 플랫폼으로 활용합니다. 마커 선택 방법 및 과도 지배적 선택을 포함하여 재조합 VACV를 생성하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 여기서, 재조합 바이러스의 시각적 식별과 결합된 숙주 범위 선택 방법의 구체화를 제시한다. 우리의 방법은 mCherry 태그E3L를 발현하는 형광 융합 유전자와 결합된 숙주 항바이러스 단백질 키나제 R(PKR)에 의해 생성된 선택적 압력을 활용하며, 두 개의 VACV PKR 길항제 중 하나이다. 관심 있는 유전자 및 mCherry-E3L 융합을 포함하는 카세트는 VACV 게놈으로부터 유래된 서열에 의해 측면화된다. 관심 유전자와 mCherry-E3L 사이에는 3' 암의 제1~150뉴클레오티드와 동일한 더 작은 영역이며, 선택 후 mCherry-E3L 유전자의 상동성 재조합 및 손실을 촉진한다. 당사는 이 방법이 돌연변이 바이러스에 대한 약물 선택 또는 광범위한 스크리닝을 요구하지 않고 다양한 세포 유형에서 효율적이고 원활한 rVACV 생성을 허용한다는 것을 입증합니다.

Introduction

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백시니아 바이러스 (VACV)는 자연에서 인간 병원균, 바리올라 바이러스 (VARV)의 첫 번째 성공적인 박멸을위한 도구였다. 바리올라 바이러스의 박멸 이후, VACV를 포함한 백스바이러스는 인간 및 동물 의학 모두에 유용한 치료 바이러스로 계속 되어 왔습니다. 예를 들어, VACV 기반 광견병 바이러스 백신은 유럽1 및 미국2에서실바틱 광견병의 전염을 방지하는 데 매우 효과적이었다. 보다 최근에는 다양한 항종양 분자(예를 들어, 단일 사슬 항체 또는 인간 에리스로포이에틴)를 발현하는 재조합 백혈바이러스가 종양용해제3,,4,,5로서의욕적인 성공을 보이고 있다. VACV는 유전자 조작에 용이하게 순종할 수 있고, 광범위한 숙주 범위를 보유하며, 다양한 조건하에서 안정되어, 현장에서 의 수송 및 백신 생존이 용이하기 때문에 벡터로서 특히 매력적이다6,,7. 실험실 실험 및 백신 생성을 위한 재조합 VACV를 생성하기 위하여 다중 기술이 개발된....

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Protocol

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1. 재조합 벡터 생성

  1. 선택 카세트를 생성하도록 프라이머를 디자인합니다. 여러 온라인 프라이머 설계 도구를 사용하여 Gibson 어셈블리라고도 하는 DNA 분자의 등온 효소 어셈블리를 용이하게 하기 위해 인접한 앰플리카 및 벡터와 겹치는 서열로 각 개별 앰플리클을 설계합니다.
    참고: 이 프로토콜은 기존의 제한 endonuclease 기반 복제 방법을 사용하여 완료할 수도 있습니다. 이 경우 겹치는 시퀀스가 아닌 적절한 제한 사이트를 사용하여 프라이머를 디자인합니다.
  2. 1.1단계에서 설계된 프라이머를 사용하여, PCR은 5'에서 3'까지의 순서대로 다음 원소를증폭(그림 1):5'의 VACV 게놈 영역의 ~500뉴클레오티드E3'의 E3L(5' 암), EGFP 또는 관심 유전자, ~150 VACV 게놈 영역에서 즉시 3' E3L(short 3' arm), 합성 조기/후기 수프바이러스 프로모터25,mCherry-E3L 융합 유전자, 및 짧은 3' 암(long 3' arm)을 포함하는 E3L의 VACV 게놈 영역 으로부터의 ~500 뉴클레오티드.
    1. PCR 튜브에, 각 앰플리코에 대해 다음 순서로 시약을 추가하십시오: DNase 자유물 17 μL, 각 프라....

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Results

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그림 1에서 다이어그램으로 된 절차를 사용하여 이미 K3L(vP872)에 대해 삭제된 바이러스에서 E3L을 EGFP로 대체하여 PKR 길항제 E3L및 K3L이 결여된 VACV를 생성했습니다. 도 2는 MCherry-E3L의 바이러스 발현을 나타내는 PKR 유능한 RK13 세포에서 적색 형광 플라크뿐만 아니라 RK13+E3L+K3L 세포에서 발현된 EGFP를 나타내며, mCherry-E3L 선택 마커의 붕괴 및 E3L의 붕괴를 확인하였다. 도 3은 이러한 재조합 바이러스, VC-R4, PKR 길항제가 모두 결여되어 있는 PKR 유능한 RK13 세포에서 복제할 수 없음을 확인하되, 부모 바이러스인 vP872는 E3L을 발현하는 동안, 복제능력이 있다. RK13 세포에서 복제할 수 없는 것이 E3L의 손실 때문이었음이 확인되도록 VC-R4의 EGFP를 E3L로 대체하여 동일한.......

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Discussion

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여기서 우리는 최종 재조합 바이러스에서 외래 DNA를 유지하지 않고 재조합 백시니아 바이러스를 생성하기 위한 과도 마커 선택 전략(32)의 변이를 제시한다. 우리의 전략은 항생제와 같은 선택적 압력의 그밖 양식 보다는 오히려 호스트 항바이러스 단백질 PKR에 의해 중재된 선택적인 압력을 이용합니다. 숙주 항 바이러스 유전자의 사용은 세포에 화학적으로 유도 된 현상형 변화의 가능성을 제거, 또는 선택 약물로 인한 돌연변이의 위험 증가. 더욱이, 약물 선택과는 달리, PKR은 모든 세포에서 구성적으로 발현되기 때문에 우리의 접근법에 대한 지연 단계가 없다. mCherry 발현에 기초한 이차 적인 시각적 선택은 또한 이식유전자를 발현하는 플라크만이 제1 단계 도중 선택된다는 것을 보장함으로써 이 방법의 특이성을 향상시키고, mCherry-E3L 유전자를 분실한 성숙한 재조합 바이러스를 선택하면서 음성 선택마커로서 동등하게 효율적이다.

이러한 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로젝트는 SR에 국립 보건원 (AI114851)에 의해 투자되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2X-Q5 마스터 믹스NEBM0492LPCR에 사용되는 고충실도 중합효소
암피실린ThermoFisher Scientific 11593027세균 선택성 제제
일회용 세포 스크레이퍼ThermoFisher Scientific08-100-242감염된 세포 채취를 위한 세포 스크레이퍼
EVOS FL Auto 2 세포 이미징 시스템ThermoFisher ScientificAMAFD2000형광 현미경
EVOS Light Cube, GFPThermoFisherAMEP4651GFP Cube
EVOS Light Cube, RFPThermoFisherAMEP4652RFP Cube
GenJetSignaGen LaboratoriesSL100489Transfection 시약
Luria Bertani (LB) BrothGibco10855021Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kitNEBT1020L앰플리콘 및 선형화된 벡터를 정제하는 데 사용되는 겔 정제 키트
Monarch Plasmid Miniprep 키트NEBT1010L플라스미드 정제를 위한 Miniprep 키트
NanoDrop OneRNA 및 DNA 농도 측정에 사용되는ThermoFisher ScientificND-ONE-W
NEBuilder Master MixNEBE2621L재조합 벡터를 생성하는 데 사용되는 등온 효소 어셈블리 키트:
Q500 Sonicator, QsonicaQ500-110바이러스 용해용 Sonicator
RK13 세포ATCC,CCL-37토끼 신장 세포
VWR, 멀티웰 세포 배양 플레이트VWR10062-892세포 배양 플레이트
분광 광도계, , , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
  2. Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and ....

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Recombinant Vaccinia VirusHost Range SelectionFluorescent Marker SelectionHomologous RecombinationmCherry E3L FusionPKR Competent CellsPlaque PurificationFluorescence MicroscopyPoxvirus ModificationVaccine Production

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