이 방법은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) RNA 샘플로부터 얻을 수 있는 서열 데이터의 질 및 양을 개선하는 단계를 설명한다. 우리는 FFPE-RNA 샘플의 품질을 보다 정확하게 평가하고, 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, FFPE-RNA 샘플의 데이터를 분석하는 방법론을 설명합니다.
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방법 논문
저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
RNA 시퀀싱(RNA-seq)에 의한 유전자 발현 분석은 잠재적으로 저항 및/또는 감수성 메커니즘뿐만 아니라 다양한 질병의 기초에 대한 기계적 이해로 이어질 수 있는 임상 샘플에 대한 고유한 통찰력을 가능하게 합니다. 그러나, 임상 견본에 있는 조직 형태를 보존하기 위한 일반적인 방법을 나타내는 FFPE 조직은, 유전자 발현 프로파일링 분석을 위한 제일 근원이 아닙니다. 이러한 샘플에서 얻은 RNA는 종종 분해, 단편화 및 화학적으로 변형되어 최적이 아닌 시퀀싱 라이브러리로 이어집니다. 차례로, 이들은 유전자 발현 분석 및 돌연변이 발견을 위해 믿을 수 없을 지도 모르다 나쁜 질 순서 데이터를 생성합니다. FFPE 샘플을 최대한 활용하고 품질이 낮은 샘플에서 최상의 데이터를 얻으려면 실험 설계를 계획하고 시퀀싱 라이브러리를 준비하며 데이터 분석 중에 특정 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다. 여기에는 정밀한 시료 품질 관리(QC)에 적합한 메트릭의 사용, 시퀀싱 라이브러리 생성 동안 다양한 단계에 가장 적합한 방법 식별, 신중한 라이브러리 QC 등이 포함됩니다. 또한 RNA-seq 데이터에서 아티팩트를 식별하고, 오염 및 낮은 품질 판독을 필터링하고, 유전자 커버리지의 균일성을 평가하고, 생물학적 복제물 중 유전자 발현 프로필의 재현성을 측정하기 위해서는 서열 데이터 분석을 위한 올바른 소프트웨어 도구 및 매개 변수를 적용하는 것이 중요합니다. 이러한 단계는 매우 이질적인 RNA 샘플의 프로파일링을 위한 높은 정확도와 재현성을 보장할 수 있습니다. 여기에서 우리는 FFPE RNA 조직에서 얻은 것과 같은 낮은 품질의 RNA로부터 얻은 유용한 데이터의 양을 증가시키는 데 도움이 될 수 있는 샘플 QC, 라이브러리 준비 및 QC, 시퀀싱 및 데이터 분석을 위한 다양한 단계를 설명합니다.
서론
차세대 염기서열 분석 방식을 사용하여 다양한 유형의 샘플에서 풍부한 정보를 얻을 수 있었습니다. 그러나 오래되고 잘 보존되지 않은 샘플은 시퀀스 데이터를 생성하는 일반적으로 사용되는 방법에 대해 작동하지 않으며 종종 잘 설정된 프로토콜을 수정해야 합니다. FFPE 조직은 임상 시편1,2,3에,3널리 활용되어 온 이러한 샘플 유형을 나타낸다. FFPE 보존은 조직 형태를 유지하는 동안, FFPE 조직에 있는 핵산은 일반적으로 각종 무질서의 밑에 분자 기계장치에 관하여 중요한 통찰력으로 이끌어 낼 수 있는 게놈 정보를 검색하는 것을 어렵게 만드는 손상 및 분해의 넓은 범위를 전시합니다.
RNA 염기서열 분석에 의해 생성된 유전자 발현 데이터는 종종 질병 및 저항 메커니즘을 연구하는 데 중요한 역할을 하며 DNA 돌연변이 분석을 보완합니다. 그러나, RNA는 FFPE 조직에서 정확한 유전자 발현 데이터를 생성하는 것이 더 도전적이기 때문에 분해에 더 취약합니다. 더욱이, 시퀀싱의 광범위한 가용성 및 경제성이 비교적 최근이기 때문에, 오래된 표본은 종종 RNA 무결성을 보존하는 데 필....
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프로토콜
1. RNA 수량 및 품질 평가
- 미리 정의된 기준에 따라 FFPE 샘플을 선택하고 적절한 방법(예를 들어, FFPE-핵산 추출 키트, 재료 표)을사용하여 RNA를 추출한다.
참고 : FFPE-RNA 추출에 사용할 수있는 몇 가지 다른 방법이 있으며, 아주 적은 조직으로 작동하고 양질의 RNA12,13,,14를추출 할 수있는 새로운 미세 해부 방법을 포함합니다. - 모든 단계에서 RNA의 무결성을 보존하기 위해 최대한주의를 기울여야합니다. 여기에는 RNase 무료 탈이온수 작업, RNase 무료 플라스틱 제품 사용, RNase 오염 제거 시약으로 FFPE 블록과 접촉하는 모든 기기 청소 등이 포함됩니다.
- RNA는 취급하는 동안 열화를 최소화하기 위해 달리 명시되지 않는 한 항상 신중하게 취급하고 얼음에 보관해야 합니다.
- 충분한 물질을 사용할 수 있는 경우, 가능한 한 많은 샘플에서 생물학적 복제를 생성하기 위해 FFPE 블록의 하나 이상의 영역에서 RNA를 추출합니다. 충분한 RNA 수율을 가진 몇몇 견본을 위해, 기술적인 복....
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결과
위에서 설명한 방법론은 7-32년 동안 다양한 조건하에서 저장된 67개의 FFPE 샘플에 적용하였다(중앙값 시료 저장 시간은 17.5년이었다). 여기에 제시된 데이터 집합 및 분석 결과는 Zhao 등11에이전에 기술되고 출판되었습니다. 앞에서 설명한 바와 같이 샘플 품질을 검사할 때(즉, 도 2의예시 트레이스), DV100은 고열RNA 샘플에 대한 더 작은 단편 크기의 비율을 정확하게 측정하는 것이 더 민감하기 때문에 DV200보다 더 유용한 것으로 나타났다.
주어진 샘플 세트에서, Illumina34에서권장하는 대로 샘플의 10% 미만(67개 중 7개)은 DV 200컷컷30%보다 높았습니다.200 샘플의 약 26%(67개 중 19개)는 DV100 > 60%(.......
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토론
여기에 설명된 방법은 FFPE-RNA 샘플에서 양호한 서열 데이터를 얻는 데 필요한 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 방법으로 고려해야 할 주요 사항은 다음과 같습니다: (1) 샘플 취급 및 동결 및 해동 주기를 최소화하여 추출 후 RNA가 가능한 한 잘 보존되도록 하십시오. 별도의 QC aliquots는 매우 유용합니다. (2) 지정된 샘플 세트에 가장 적합한 QC 메트릭을 사용합니다. RIN 값 및 DV200은 종종 열화된 샘플에 유용하지 않으며, DV100은 주어진 샘플 세트에서 품질을 평가하기 위한 선택의 메트릭일 수 있다. (3) 더 저하된 샘플의 경우 높은 샘플 입력을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 입력량이 높을수록 최종 라이브러리의 다양성이 향상되고 중복이 낮아지므로 데이터 품질이 향상됩니다. FFPE-RNA 샘플의 모든 RNA가 효소 과정에 대한 높은 분해 및 내화성으로 인해 사용할 수 있는 것은 아니기 때문에 이러한 효과는 신선한 냉동 RNA에 비해 FFPE-RNA에서 .......
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공개 사항
이 작품은 국립 암 연구소에 의해 투자 되었다 (NCI), 건강의 국가 학회 (NIH). Leidos 생물 의학 연구, Inc.는 NIH에 의해 완전히 투자되는 암 연구를 위한 프레드릭 국립 연구소를 위한 운영 및 기술 지원 계약자입니다. 몇몇 저자 (YZ, MM, KT, YL, JS, BT)는 Leidos 생물 의학 연구, Inc.와 제휴하고 있습니다, 그러나 저자의 모든 저자는 저자의 급여 및 연구 자료를 포함하여 국립 암 학회에 의해 완전히 투자됩니다. Leidos Biomedical Research, Inc.는 저자(YZ, MM, KT, YL, JS, BT) 또는 연구 용 자료에 대한 급여를 제공하지 않았으며, 연구 설계, 데이터 수집, 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 어떠한 역할도 하지 않았습니다.
감사의 글
우리는 다니엘 캐릭 박사에게 감사드립니다 (암 통제 및 인구 과학의 부, 국립 암 연구소) 지속적인 도움, 특히이 연구를 시작하고, 샘플을 제공하고, 데이터 분석 중에 유용한 제안을 위해. 우리는 진심으로 샘플 준비 및 시퀀싱 동안 자신의 도움을 위해 암 연구를위한 프레드릭 국립 연구소의 CCR 시퀀싱 시설의 모든 구성원에게 감사드립니다, 샘플 QC에 도움을 특히 브렌다 호, 도서관 QC에 대한 옥사나 독일어, 시퀀서를 실행하기위한 타티아나 스미르노바. 우리는 또한 데이터 분석 및 RNA-seq 파이프라인 구현을 돕는 시퀀싱 시설 생물 정보학 그룹의 Tsai-wei Shen및 애슐리 월튼에게 감사드립니다. 또한 RNaseq 분석 파이프라인 및 모범 사례 개발에 대한 지원을 위해 CCBR 및 NCBR에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Agilent DNA 7500 Kit | Agilent | 5067-1506 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 터치 시스템 | Bio-Rad | 1855195 | |
| Library Quantification kit v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) | New England Biolabs | E6310L | |
| NextSeq 500 염기서열분석 시스템 | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 시스템 가이드: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | ||
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| Rotator Multimixer | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
| 염기서열분석 시약 키트 | Illumina | 20024907 | |
| 플로우 셀 패키지 | Illumina | 20024907 | |
| 버퍼 카트리지 및 시약 카트리지 | Illumina | 20024907 | |
| 수산화나트륨 용액 (0.2N) | Millipore Sigma | SX0607D-6 | |
| TRIS-HCL 버퍼 1.0M, pH 7.0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |
참고문헌
- Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).
- Hedegaard, J., et al.
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재인쇄 및 허가
