감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.
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이 논문에서
요약
초록
바이러스 기반 마이크로RNA 침묵(VbMS)은 식물에서 microRNAs(miRNAs)의 기능적 특성화를 위한 신속하고 효율적인 도구입니다. VbMS 시스템은 니코티아나 벤타미안, 토마토, 아라비도시스, 면, 밀과 옥수수 와 같은 모노코트 식물 등 다양한 식물종에 개발 및 적용되었습니다. 여기에서는 PVX 기반 VbMS 벡터를 사용하여 감자내생 내성 miRNAs를 침묵시키기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 특정 miRNA의 발현을 무너뜨리기 위해, 관심 있는 miRNA의 표적 모방(TM) 분자는 설계되고, 식물 바이러스 벡터에 통합되고, Agrobacterium 침투에 의해 감자에 발현되어 내인성 miRNA에 직접 결합하고 그 기능을 차단한다.
서론
식물 microRNAs (miRNAs)는 20-24 뉴클레오티드 길이의 핵 으로 인코딩 된 규제 RNAs1로 특징 지어지며 성장 및 개발, 광합성 및 신진 대사4,5,6,7, 호르몬 합성 및 신호 8,9, 생물학적 반응 10, 생물학적 및 생물학적 반응을 포함하여 식물 생물학적 과정의 거의 모든 측면에서 근본적인 역할을합니다. 11,12,13, 영양 및 에너지 조절14,15. 식물 ....
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프로토콜
1. 감자 식물을 성장.
- 무라시게와 스쿠그(MS) 미디어와 감보르그 비타민(MS 기저염 혼합물, 감보리의 비타민, 30g/L 수당, 3.5g/L agar, pH = 5.7)을 함유한 배양 튜브(25 x 150mm)에 체외 감자 식물을 전파합니다. 20-22°C, 16h 라이트/8h 다크 포토기간, 빛 강도 120 μmol/m2∙s1 아래 성장실에 튜브를 놓습니다.
참고 : 새로운 싹과 뿌리는 일반적으로 식물에서 1-2 주에 개발됩니다. 매달 신선한 MS/감보르그의 비타민 미디어를 통해 식물을 전파합니다. - 4주 후, 체외 식물을 토양으로 이식하고 20-22°C, 16h 빛/8h 어두운 광기간, 빛 강도 120 μmol/m2∙s1 아래 온실에서 자랍니다.
참고: 새로 발달된 뿌리와 잎이 있는 식물은 이식에 적합합니다. 처음 3-4 일 동안 갓 이식 된 식물에 대한 수분을 유지합니다.
2. VbMS 벡터를 구성합니다.
- 짧은 탠덤 TM 분자(STTM, 도 1)22,53
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결과
도 2 는 정맥을 따라 잎 라미나의 축축측에서 잎 조직의 자궁 내성장을 가진 PVX-STTM165/166 감자 식물(Katahdin)을 나타낸다. 나팔 모양의 잎 형성과 같은 더 심각한 표현형도 관찰되었다. 대조적으로, PVX 대조공장에서는 현상이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 VbMS 시스템이 테트라클로드 감자 식물에서 내인성 miRNA 기능을 억제하는 데 효과적이었으며 PVX-VbMS 시스템은 특정 miRNA 또는 miRNA 제품군의 기능을 결정하는 견고한 유전 적 도구였다는 것을 보여준다.
도 3 은 정맥을 따라 잎 라미나의 축축측에서 자궁외 잎 조직 성장을 가진 PVX-STTM165/166 감자 식물(Russet Burbank)을 나타낸다. 이러한 결과는 PVX-VbMS 시스템이 주요 감자 품종을 포함한 다른 감자 종에 적용될 수 있음을 보여줍니다.
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토론
STTM 설계를 PVX 벡터에 통합하여 감자내성 miRNAs의 기능을 특성화하기 위해 PVX 기반 miRNA 침묵 시스템을 제시합니다. VbMS 시스템은 식물 종에 걸쳐 매우 보존 된 miRNA 가족인 감자에서 miRNA165/166을 침묵시키는 데 효과적이라는 것이 입증되었습니다.
TM 접근법은 표적 miRNA의 격리 및 그 활동의 체포를 초래하는 miRNA 보충 서열 내의 예상 분열 부위에서 불일치 루프를 생성하도록 설계된 인공 miRNA 표적 모방에 기초하여 miRNAs의 발현을 방해하기 위해 개발되었습니다22,35,78,79 . TM 분자와 표적 miRNAs 사이의 페어링은 표적 mRNAs의 상향 조절으로 이어지는 특정 miRNA 또는 miRNA.......
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감사의 글
우리는 PVX-LIC 벡터를 제공한 칭화 대학의 율류 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 텍사스 A&M 농업 연구및 미국 농무부(USDA) 국립 식품 농업 연구소에서 JS에 이르기까지 해치 프로젝트 TEX0-1-9675의 스타트업 펀드에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100 &마이크로; M dATP 및 100 & 마이크로; M dTTP | Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, 미국 | TQAC136 | |
| 3M 아세트산나트륨, pH 4.0. | Teknova, Hollister, CA 95023, USA | ||
| Acetosyringone | TCI America, Portland, OR 97203, USA | D2666-25G | |
| Agrobacterium tumefaciens 균주: GV3101, GV2260 또는 EHA105. | |||
| 클로로포름 | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, 미국 | VWRV0757-950ML | |
| 디메틸 설폭사이드, DMSO | TCI America, Portland, OR 97203, USA | D0798-25G | |
| DTT | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA | VWRV0281-25G | |
| 대장균 DB3.1 | ccdB 유전자를 포함하는 PVX-LIC 및 pTRV2e 유지 관리 | ||
| 대장균 DH5α | 의해 생성된 목적지 구성 | ||
| : Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed | ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA | G99260 | |
| 고충실도 PCR 시약: dNTP를 사용한 KAPA HiFi DNA 중합효소 | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA | 7958960001 | |
| 이소아밀 알코올 | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, 미국 | VWRV0944-1L | |
| Koptec 순수 에탄올 – 200 Proof | Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA | V1005M | |
| MES | TCI America, Portland, OR 97203, USA | M0606-250G | |
| MgCl2 | ThermoFisher, Waltham, MA 02451 | MFCD00149781 | |
| M-MuLV 역전사효소 | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0253L | |
| 나노 드롭 분광계: NanoDrop OneC Wi-Fi 기능이 있는 Microvolume UV-Vis 분광 광도계 | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA | ND-ONEC-W | |
| PCR 기계: Bio-Rad MyCycler PCR 시스템 | Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA | 170-9703 | |
| PCR 기계: Eppendorf Mastercycler pro | Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA | 950030010 | |
| pH 측정기 | Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, 미국 | 벤치탑 pH/mV 측정기 - 860031 | |
| 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1), pH 6.7/8.0. | VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, 미국 | VWRV0883-400ML | |
| 피타젤: Gellan Gum | Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA | J63423-A1 | |
| PVX VIGS 벡터: PVX-LIC | Zhao et al., 2016 | ||
| Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA | 4485697 | |
| Real-time PCR 시약: KAPA SYBR® FAST qPCR 마스터 믹스(2x) 키트 | Roche 염기서열분석 및 생명 과학, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA | 7959389001 | |
| 제한 효소: SmaI | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | R0141S | |
| 역전사 시약: qScript cDNA SuperMix | Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, USA | 95107-100 | |
| RNA 추출 키트: E.Z.N.A. 식물 RNA Kit | Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA | SKU: D3485-01 | |
| RNase Inhibitor Murine | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0314L | |
| RNAzol RT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA | R4533 | |
| 토양: Metro-Mix 360 | Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA | Metro-Mix 360 | |
| T4 DNA 중합효소 및 완충 | New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA | M0203S |
참고문헌
- Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
- Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology....
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