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방법 논문

골관절염에 대한 자가포식 조절제의 식별을 위한 플럭스 기반 분석

3.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61078

⸱

2020년 7월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, 2Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

이 논문에서

요약

이 논문은 세포 기반 이미징 스크리닝을 통해 새로운 분자를 식별하기 위한 자가포식 플럭스 모니터링에 대해 자세히 설명합니다.

초록

자가포식(autophagy)은 항상성을 조절하는 핵심 메커니즘입니다. 자가포식의 변화는 노화 관련 질병의 원인이 됩니다. 자가포식의 조절자를 확인하기 위한 표현형 방법은 새로운 치료법을 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 이 논문에서는 인간 연골세포에서 자가포식 플럭스(mCherry-EGFP-LC3B)의 리포터로 LC3를 사용하여 자가포식 플럭스를 모니터링하기 위해 개발된 세포 기반 이미징 스크리닝 워크플로우에 대해 설명합니다. 데이터 수집은 자동화된 High Content Imaging Screening System 현미경을 사용하여 수행됩니다. 자가포식 플럭스를 활성화하는 분자를 식별하기 위해 알고리즘 기반의 자동 이미지 분석 프로토콜이 개발되고 검증되었습니다. 중요한 단계, 설명 메모 및 현재 자가포식 모니터링 프로토콜에 대한 개선 사항이 보고됩니다. 노화의 특징을 표적으로 삼기 위한 생리학적으로 관련된 표현형 스크리닝 접근법은 노화 관련 근골격계 질환에 대한 보다 효과적인 약물 발견 전략을 촉진할 수 있습니다.

서론

많은 만성 질환이 노화의 특징과 관련이 있는데, 여기에는 자가포식 결함1이 포함됩니다. 골관절염(OA)은 가장 흔한 관절 질환으로 고령 인구의 일상 활동을 제한하는 데 큰 영향을 미치지만, 예방 조치나 질병 조절 치료법은 아직 이용 가능하지 않다2.

관절 노화와 골관절염은 자가포식 결함 및 노화를 포함하여 연골 퇴행의 진행을 정의하는 특징과 관련이 있습니다 3,4. 근골격계 조직에서 자가포식을 표적으로 삼는 것은 류마티스 질환에 대한 혁신적인 치료법을 찾는 데 도움이 될 수 있다 5,6. 자가포식의 약리학적 조절은 전임상 질환 모델에서 중재를 위한 유망하고 유의미한 메커니즘이다7. 골관절염에서는 관절 기능 장애를 예방하기 위해 자가포식 활성화가 사용되어 왔다8. 정량적 분석이 가능한 강력하고 재현성 있는 프로토콜을 기반으로 자가포식을 모니터링하는 방법을 사용하여 새로운 제제를 식별하고 질병 관련 노화 특징의 약리학적 표적화를 촉진할 수 있습니다.

자가포식 플럭스(autophagy flux)는 분해 활성을 반영하며 자가포식을 활성화하는 새로운 분자를 식별하기 위한 관련 측정입니다9. 본 연구는 인간 연골세포(TC28a2)에서 자가포식 리포터 세포주를 이용하여 자가포식 분해 활성을 측정하여 자가포식 플럭스를 결정하기 위해 개발된 방법을 설명하고 있다. mCherry-EGFP-LC3- 일시적 발현을 통해 살아있는 세포10의 리소좀에서 GFP와 mCherry LC3 신호 간의 pH 감도 차이를 정량화하여 자가분해체 형성 및 분해 이벤트를 동시에 모니터링할 수 있습니다.

이 유세포 분석 보고 방법을 살아있는 연골세포의 안정적인 발현 이미징 모니터링 시스템에 적용하면 연골 생물학의 맥락에서 자가포식 플럭스를 활성화하는 분자를 식별할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 불멸의 인간 연골 세포의 자가포식 리포터 세포주 생성

참고: 유세포 분석 정량 판독을 확립하여 pBABE-mCherry-GFP-LC3의 안정적인 transfection에 의한 자가포식 리포터 세포주의 생성은 앞서11번 설명되었습니다. 레트로바이러스 형질주입에는 두 개의 세포주가 사용되었는데, 공동형질주입 과정에서는 HEK 293-T17, 감염 단계에서는 T/C28a2가 사용되었습니다.

  1. Cotransfection 공정
    1. HEK 293-T17 세포에 대한 성장 배지를 준비합니다: Eagle의 최소 필수 배지(EMEM) 500mL, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S). 성장 배지를 4 °C에서 보관하고 매번 사용하기 전에 37 °C로 데우십시오.
    2. 웰당 1 x 106 HEK 293-T17 세포를 100mm 세포 배양 플레이트에 시딩하고, 37°C 및 5% CO2에서 배양하고, cotransfection 프로세스를 시작하기 전에 ~75% confluence에 있는지 확인합니다.
    3. 배양 배지를 제거하고 Hank's balanced salt solution(HBSS)으로 헹구고 2% FBS 및 1% P/S가 포함된 EMEM 8mL를 추가합니다.
    4. 원뿔형 튜브에 10μg, 3μg 및 7μg의 pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV를 추가합니다. G 및 pCL-Eco 플라스미드가 각각 있습니다. 그런 다음 200μL의 1x 환원 혈청 배지를 추가합니다(재료 표). transfection 시약(Table of Materials)을 지질의 비리포솜 혼합물로 추가하여 1:3 비율(1 μg DNA: 3 μg transfection 시약, 최종 부피 = 60 μL)을 갖습니다.
      참고: 형질주입할 각 10cm 세포 플레이트에 대해 총 20μg의 혼합물을 준비합니다.
    5. 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 트랜스펙션 혼합물을 HEK 293-T17 패키징 셀에 적반하여 조심스럽게 옮깁니다. 형광 현미경으로 녹색 및 적색 단백질 발현을 확인하기 전에 최소 48시간 동안 37°C 및 5% CO2 에서 세포를 배양합니다.
      참고: 이러한 조건에서 세포의 75% 이상이 형광에 양성이어야 합니다. transfection 효율이 높은지 확인합니다(예: 세포의 75% 이상이 양성임). 고품질 플라스미드 DNA(예: 주로 초코일형이며 게놈 DNA, RNA 및 단백질이 없음, 고농축, 내독소 및 염이 없음)와 고품질 세포 배양(예: 균질, 낮은 계대, 단층, 기하급수적 성장 단계에서 transfection, 마이코플라스마 없음)을 사용합니다.
  2. cotransfection 당일에 T/C28a2 연골세포를 준비합니다.
    1. T/C28a2 세포 성장 배지 준비: Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 500mL, 10% 태아 송아지 혈청(FCS) 및 1% P/S. 성장 배지를 4°C에서 보관하고 매번 사용하기 전에 37°C로 따뜻하게 합니다.
    2. 2 x 105 T/C28a2 연골 세포를 2개의 6웰 멀티플레이트에 파종하고 37°C 및 5% CO2에서 48시간 동안 배양합니다.
  3. 레트로바이러스 감염 과정
    1. 1.1.5단계에서 얻은 HEK 293-T17 레트로바이러스 패키징 셀에서 배양 배지를 흡인합니다. HBSS 4mL로 1회 헹구고 HBSS를 흡인합니다.
    2. 트립신 2mL를 넣고 37°C에서 2분 동안 기다립니다. 6mL의 HEK 293-T17 배양 배지 및 트랜스퍼 세포 및 배지를 15mL 원뿔형 튜브에 첨가하여 트립신을 중화합니다.
    3. 400 x g 에서 5분 동안 원심분리기 셀 0.45μm 멤브레인을 통해 상층액을 멸균 필터로 전달합니다.
    4. 6웰 멀티플레이트에서 T/C28a2 연골세포 배양 배지를 흡인합니다. 6웰 멀티플레이트에 웰당 2mL의 바이러스 현탁액(단계 1.3.3)을 추가하여 T/C28a2 세포를 감염시킵니다. 바이러스 현탁액 대신 2mL의 T/C28a2 세포 성장 배지를 추가하여 제어용(즉, transfection되지 않은 세포) 하나의 웰을 사용합니다.
    5. 37 ° C 및 5 % CO2에서 48 시간 동안 배양합니다.
  4. 선별 프로세스를 수행하려면 형질주입된 세포에서 항생제 선별을 사용하여 형질주입되지 않은 세포를 제거하고 균질한 세포 집단을 얻습니다.
    참고: pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B 레트로바이러스 벡터는 퓨로마이신에 대한 포유류 항생제 내성을 제공하여 바이러스 transfection 후 안정적인 세포 배양을 선택할 수 있습니다. T/C28a2 연골세포의 최적 퓨로마이신 농도를 위한 사멸 곡선(kill curve)을 미리 설정하여 높은 발현 수준을 가진 전이유전자를 운반하는 세포 클론을 선택하기 위한 적절한 조건을 확립해야 합니다.
    1. T/C28A2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B 안정 세포주 성장 배지(DMEM 500mL, 10% FCS, 1% P/S 및 2.5μL/mL 퓨로마이신)를 준비합니다. 배지는 4 °C에서 보관하고 매번 사용하기 전에 37 °C로 데우십시오.
    2. 매체를 변경합니다. 각 6웰 멀티플레이트에 대해 배양 배지를 흡인하고 HBSS 2mL로 1x를 헹구고 흡인합니다. 배지 2mL를 추가하고 37°C 및 5% CO2에서 배양합니다. 이것이 선택 과정의 시작입니다.
    3. 2일마다 배지를 교체하고 죽은 세포와 퓨로마이신 내성 세포 집단을 관찰합니다. 결과를 퓨로마이신에 내성이 없고 사멸하는 transfection되지 않은 대조 세포와 비교합니다.
  5. 클론 선택을 시작하려면 단클론 집단이 증가했는지 확인하십시오. 각 6웰 멀티플레이트에 대해:
    1. 웰당 200μL의 배지를 96웰 멀티플레이트에 추가합니다.
      참고: 6웰 멀티플레이트에서 선택한 각 단일 셀은 96웰 멀티플레이트의 개별 웰에 도금됩니다.
    2. 현미경을 사용하여 6개의 웰 멀티플레이트에서 각 단클론 집단을 식별합니다. 단일 세포로 형성된 집락이 관찰될 수 있습니다.
    3. 6웰 멀티플레이트에서 배양 배지를 흡입하고 HBSS 2mL로 1x를 헹구고 HBSS를 흡인합니다.
    4. 각 단클론 집단에 10μL의 트립신을 추가하여 단일 세포를 96웰 멀티플레이트의 각 웰로 전달합니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 48 시간 동안 배양합니다.
  6. 48시간 후 배지를 웰당 100μL의 새 배지로 교체합니다. 단일 세포의 확장으로 인해 집락이 형성될 때까지 이 절차를 반복합니다.
  7. 단일 세포가 well이 확장되면 24 well, 6 well 및 100 mm cell culture plate의 개별 well에 각 단클론 집단을 플레이트화합니다.
  8. 단일 세포 분류 방법을 사용하여 안정적인 단클론 세포주를 생성합니다.
    1. 100mm 세포 배양 플레이트에서 배양 배지를 흡입합니다. HBSS 8mL로 1x를 헹구고 흡인합니다.
    2. 각 플레이트에 트립신 2mL를 추가하고 37°C에서 2분 동안 배양합니다. 8mL의 배양 배지를 첨가하여 트립신을 중화합니다.
    3. 252 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 버립니다. 각 세포 펠릿에 HBSS 4mL를 첨가하고 조심스럽게 재현탁한 다음 세포분석 튜브로 옮깁니다.
    4. 세포 분류 기술을 사용하여 각 세포 시료를 유세포 분석기(Table of Materials)에 주입하고 녹색 및 적색 형광이 높은 세포를 분리합니다.
    5. 선택한 세포를 252 x g 에서 5분 동안 15mL 코니컬 튜브와 원심분리 세포로 이송합니다. 9mL의 안정적인 세포주 성장 배지가 있는 T-25 플라스크에 세포 펠렛을 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 배양하십시오.
      참고: 세포 분류 후 3개의 단클론 집단(표 1)을 얻어야 합니다.
  9. 24시간 후 배지를 제거하고 새 배지 8mL를 추가합니다. 세포가 합류점에 도달할 때까지 2일마다 이 절차를 반복합니다.
    참고: 자가포식 플럭스를 연구하기 위해 두 가지 대조군을 사용할 수 있습니다: 높은 자가포식 플럭스 신호 참조인 라파마이신과 낮은 자가포식 플럭스 신호 참조로 클로로퀸. 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 10mM 라파마이신 원액을 준비하고H2O에 30mM 클로로퀸 원액을 준비하여 -20°C에서 보관합니다. mCherry 및 GFP 발현을 테스트하여 최상의 단클론 모집단을 선택하기 위해 유세포 분석(1.10단계) 또는 고함량 형광 이미지 분석(1.11단계)의 두 가지 방법을 사용할 수 있습니다.
  10. 유세포 분석
    1. 12개의 웰 플레이트에 각 단클론 집단의 웰당2.5 x 10 5개의 세포를 1mL의 안정한 세포주 성장 배지 1mL에서 처리 최소 24시간 전에 시딩하고 37°C 및 5%CO2에서 배양합니다.
    2. 치료 당일, 배지를 제거하고 웰당 2% FCS가 보충된 1mL의 안정적인 세포주 성장 배지를 추가합니다. 10μM 라파마이신 및 30μM 클로로퀸을 2% FCS로 안정적인 세포주 성장 배지에 추가하고 37°C 및 5%CO2에서 16시간 동안 배양합니다.
    3. 배지를 제거하고 웰당 HBSS 1mL로 헹구고 흡인합니다.
    4. 각 웰에 500 μL의 트립신을 첨가하고 37 °C에서 1분 동안 배양한 후 500 μL의 배양 배지를 첨가하여 반응을 중화합니다. 세포를 긁어내어 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
    5. 252 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 세포 펠릿을 500μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹굽니다. 252 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
    6. 500μL의 PBS를 추가하고, 세포를 세포분석 튜브로 전달하고, 각 샘플을 세포분석 장비에 주입합니다. 각 조건에 대해 10,000개의 이벤트를 수집합니다.
    7. 유세포 분석으로 단클론 집단을 선택하려면 488nm 레이저를 사용하여 EGFP를 여기시키고 633nm 레이저를 mCherry에 사용합니다. 그런 다음 mCherry 및 EGFP 형광의 비율을 설정하여 자가포식 플럭스가 높거나 낮은 세포 집단을 선택합니다.
  11. 고함량 형광 이미지 분석
    1. 10% FCS, 1% P/S 및 2.5μL/mL 퓨로마이신이 보충된 성장 배지에서 384개의 웰 플레이트(검은색 벽/투명한 바닥)에 웰당 각 단클론 집단의 4 x 103 개 세포를 파종합니다. 처리 전 24시간 동안 37°C 및 5% CO2 에서 배양합니다.
    2. 배지를 제거하고 웰당 2% FCS가 보충된 50μL의 안정적인 세포주 성장 배지에 10μM 라파마이신과 30μM 클로로퀸을 첨가합니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 16 시간 동안 배양하십시오.
    3. 배지를 제거하고 웰당 50μL의 HBSS로 헹구고 흡인합니다. 4% 파라포름알데히드(PFA)로 37°C에서 10분 동안 세포를 고정합니다. PFA를 제거하고 웰당 50μL의 HBSS로 헹굽니다.
    4. 세포핵을 식별하기 위해 37°C에서 10분 동안 Hoechst 33342(2.5μg/mL)로 염색합니다. Hoechst 33342 염료를 흡입하고, 웰당 50μL의 HBSS로 헹구고, 웰당 50μL의 PBS를 추가합니다.
    5. 섹션 3에 설명된 대로 HTS 플랫폼에서 얻은 자가포식 플럭스의 데이터 수집 및 분석을 수행합니다.
      참고: 단클론 집단을 선택하는 기준은 자가포식 플럭스가 라파마이신 또는 클로로퀸으로 각각 증가 또는 감소했는지 여부를 기반으로 합니다(표 1). mCherry 및 GFP 발현 수준이 높은 클론은 자가포식 플럭스의 정확한 고함량 형광 이미지 분석 정량화에 더 적합합니다.

2. 살아있는 연골세포의 이미지 기반 자가포식 플럭스 분석

참고: 클론을 선택한 후 자가포식 플럭스를 정량화하기 위한 분석을 시작합니다.

  1. 휴대용 전자 384 채널 피펫을 사용하여 웰당 10% FCS, 1% P/S 및 2.5μL/mL 퓨로마이신이 보충된 50μL의 안정적인 세포주 성장 배지에 있는 384웰 플레이트(검은색 벽/투명 바닥)에 웰당 선택한 클론의 4 x 103 개 세포를 시드합니다. 처리 전 24시간 동안 37°C 및 5% CO2 에서 배양합니다.
  2. 실험 당일, 화합물 첨가를 위한 인터벌 플레이트를 준비합니다.
    1. Acoustic Liquid Handling 기술과 전자 384 채널 피펫을 사용하여 각 화합물/대조군 및 안정적인 세포주 성장 배지를 각각 간격 플레이트에 추가하여 간격 농도를 얻습니다.
      참고: 이 분석의 대조군에는 2% FCS, 30μM 클로로퀸 및 10μM 라파마이신이 보충된 안정적인 세포주 성장 배지가 포함되었습니다. 간격 농도는 원하는 최종 농도에 따라 달라집니다. 예를 들어, 본 분석법에서, 클로로퀸 및 라파마이신을 웰당 50μL의 안정한 세포주 성장 배지에 첨가하여 각각 300μM 및 100μM의 간격 농도를 얻었다.
    2. 마이크로플레이트 워셔 로봇을 사용하여 자동 방식으로 세포 플레이트에서 배지를 흡인하고 웰당 2% FCS가 보충된 45μL의 안정적인 세포주 성장 배지를 추가합니다.
    3. 그런 다음 간격 플레이트에서 분석 플레이트로 웰당 5μL를 전달하여 다른 자동 액체 처리기 워크스테이션을 사용하여 최종 농도를 얻습니다.
  3. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 16 시간 동안 배양합니다. 마이크로플레이트 세척기 로봇을 사용하여 매체를 흡입합니다.
  4. 37°C에서 10분 동안 웰당 50μL의 4% PFA로 셀을 고정합니다. 웰당 50μL의 HBSS로 세척합니다.
  5. Hoechst 33342(2.5μg/mL)로 37°C에서 10분 동안 핵을 염색합니다. Hoechst 33342를 흡입하고 웰당 50μL의 HBSS로 헹굽니다.
  6. 웰당 50μL의 PBS를 추가합니다. 이제 플레이트를 판독, 데이터 수집 및 후속 분석을 수행할 준비가 되었습니다.
    참고: 이 프로토콜은 고처리량 스크리닝(HTS)에 대해 설명됩니다. 그러나 사용되는 화합물이 거의 없는 경우 자동 기기 없이 수동으로 추가할 수 있습니다. 보정된 액체 처리 기기 및/또는 전자 피펫을 사용하여 세포 및 상층액을 최소한으로 조작하면 고함량 형광 이미지 분석을 통해 자가포식 플럭스를 정량화하기 위한 세포 배양 단층을 성공적으로 준비할 수 있습니다.

3. 자가포식 플럭스(autophagic flux)의 데이터 수집 및 분석

  1. 데이터 수집을 위해 HCS(High Content Screening System)와 자동 현미경을 사용하여 이미지 처리 알고리즘을 통해 자동으로 이미지 획득 및 분석할 수 있습니다.
  2. 획득 프로토콜을 개발하려면 여러 채널과 노출 시간(표 2)을 선택하여 자가포식 플럭스 이벤트 동안 핵과 자가포식소체 및 자가분해소좀의 형성을 식별합니다.
  3. 각 웰에 대해 웰 표면을 덮고 있는 4개의 필드와 0.2μm의 작동 거리로 분리된 8μm부터 시작하는 4개의 스택에서 이미지를 수집합니다. 상세한 세포 이미징을 위해 60x 대물렌즈를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
  4. HCS 현미경에서 제공하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 자가포식 플럭스 모니터링을 위한 강력한 분석 프로토콜 알고리즘을 개발하려면 자동화된 세포 이미지 분할과 LC3 활성화에 해당하는 스페클을 구체적으로 검출하는 데 가장 적합한 방법을 선택하십시오. 아래 설명된 대로 Method, Cell Segmentation 단계 및 정량화 지침을 추가하여 최종 분석 순서를 수행합니다.
    1. Find Nuclei 빌딩 블록을 클릭하고 핵 염료 채널 Hoechst 33342를 선택합니다. 방법을 선택하고 출력 모단 핵을 선택합니다.
    2. Find Cytoplasm(세포질 찾기) 빌딩 블록을 클릭하고 세포질 염료 채널 Fluorescein을 선택합니다. 방법 선택 | 개별 임계값.
    3. Find Cytoplasm (2) 빌딩 블록을 클릭하고 세포질 염료 채널 RFP를 선택합니다. 방법 선택 | 개별 임계값.
    4. Population 빌딩 블록을 클릭하고 연구 population Nuclei를 선택합니다. Common filters (Remove border objects) 방법을 선택하고 출력 모집단 Nuclei Inside Borders를 선택합니다.
    5. Find Spots 빌딩 블록을 클릭하고 특정 마커 채널 Fluorescein을 선택합니다. 연구 모집단 Nuclei Inside borders를 선택하고 연구 영역 Cytoplasm을 선택합니다. 방법을 선택하고 출력 모집단 Spots Inside Borders를 선택합니다.
    6. Find Spot(스폿 찾기)(2) 빌딩 블록을 클릭하고 특정 마커 채널 RFP를 선택합니다. 연구 모집단 Nuclei Inside borders를 선택하고 연구 영역 Cytoplasm (2)을 선택합니다. Method를 선택하고 출력 모집단 Spots (2) Inside Borders를 선택합니다.
    7. Calculate Intensity Properties 빌딩 블록을 클릭하고 특정 마커 채널 Fluorescein을 선택합니다. 연구 모집단 Nuclei Inside Borders를 선택하고 연구 영역 Spot을 선택합니다. Method를 선택하고 출력 속성인 Intensity Spot Fluorescein Inside Borders를 선택합니다.
    8. Calculate Intensity Properties 빌딩 블록을 클릭하고 특정 마커 채널 RFP를 선택합니다. 연구 모집단 Nuclei Inside Borders를 선택하고 연구 영역 Spot (2)를 선택합니다. 방법을 선택하고 출력 속성인 Intensity Spot (2) RFP Inside Borders를 선택합니다.
    9. Define Results 빌딩 블록을 클릭하고, population Nuclei Inside Borders를 선택하고, Number of Objects of Nuclei (Mean)를 선택하고, Relative Intensity Spots Fluorescein – mean per well을 선택하고, Relative Intensity Spots (2) – RFP – mean per well을 선택합니다.
  5. 자가포식 플럭스를 정량화하려면 유세포 분석11에 대해 앞서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하십시오. 상대 강도 스폿의 mCherry/EGFP 비율을 설정합니다.
    참고: 플럭스가 높은 세포는 녹색이 적어 세포의 mCherry/EGFP 비율이 증가합니다. 세포 내 자가포식 플럭스 이벤트에서 발생하는 의미 있는 수의 관련 신호를 식별하고 정확하게 정량화하는 것은 통계적으로 유의미한 차이를 확립하는 데 매우 중요합니다.

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결과

자가포식 플럭스는 약리학적 조절 또는 세포 스트레스 반응에 의해 세포에서 모니터링할 수 있습니다. 자가포식을 위한 형광 리포터(mCherry-EGFP-LC3B)로 LC3를 사용하여 자가포식 리포터 세포주를 개발하기 위해 Inmortalized Human Chondrocytes(T/C28a2)를 사용했습니다. 그림 1 은 인간 연골세포(mCherry-EGFP-LC3-T/C28a2)에서 자가포식 리포터 세포주(autophagy reporter cell line)의 개발부터 약리학적 조절에 의한 자가포식 플럭스(autophagic flux)의 유도 또는 억제, 그리고 High Content Imaging Microscope로 수행된 데이터 분석에 이르기까지 스크리닝 분석의 개략적인 워크플로우를 보여줍니다. 그림 2 는 자가포식 플럭스를 모니터링하여 자가포식 조절자를 식별하기 위한 세포 기반 이미징 분석의 개략도를 보여줍니다. 이...

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토론

결함이 있는 자가포식은 노화와 관련된 관절 변성의 중요한 특징이지만, 연골 변성에는 자가포식을 목표로 하는 예방적 치료법이나 질병 조절 치료법이 아직 없다2. 자가포식의 관련성과 임상적 의미를 감안할 때 자가포식은 약물 발견 및 개발의 관심 대상이 되었지만, 이 주요 항상성 메커니즘의 변화를 직접 모니터링하는 방법은 어려운 것으로 입증되었습니다.

여기에서는 살아있는 인간 연골 세포에서 자가포식 플럭스를 결정하기 위한 세포 기반 표현형 분석법이 설명됩니다. 자가포식 활성화의 이중 리포터인 mCherry-EGFP-LC3를 포함하는 플라스미드는 유세포분석법 11에 의한 살아있는 세포에서 GFP 및 mCherry 신호의 pH 민감도 차이로 인한 자가분해소좀 형성 및 분해 이벤트를 동시에 모니터링하는 데 사용됩니다. mCherry-EGFP-LC...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Instituto de Salud Carlos III- Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spain, Plan Estatal 2013-2016 및 Fondo Europeo de Desarrollo Regional(FEDER), "Una manera de hacer Europa", PI14/01324 및 PI17/02059의 지원을 받았으며, 전임상 단계에 대한 표적 검증 및 약물 후보 물질 발견에 적용되는 Innopharma Pharmacogenomics 플랫폼, Ministerio de Economía y Competitividad의 지원을 받았습니다. 또한 류마티스학연구재단(FOREUM)의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100mm 세포 배양 플레이트Corning430167세포 배양 플레이트
12웰 멀티플레이트Corning353043세포 배양 플레이트
15mL 원심분리기 원추형 튜브, Falcon-Corning352095원추형 튜브
24웰 멀티플레이트Corning351147세포 배양 플레이트
25cm2 세포 배양 플라스크Falcon-Corning353014세포 배양 플라스크
384-well multiplate Cell CarrierPerkin Elmer6007550Cell culture plate
6-wellmultiplate Corning351146Cell culture plate
96-wellmultiplate Corning353077Cell culture plate
Acoustic liquid handling technologyLabcyte−https://www.labcyte.com
클로로퀸Sigma-AldrichC6628자가포식 플럭스 억제제
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOD2650Disolvent
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Lonza, Basel, SwitzerlandBE-604FT/C28A2 성장 배지
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC30– 2003HEK 293-T17 성장 매체
FACScalibur cytometerBecton Dickinson, CA−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
소태아 세럼 (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOF9665HEK 293-T17 세럼
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco by Life Technologies, CA26010– 074Serum
FuGenePromegaE2691자가포식 보고 세포주를 생성하기 위한 플라스미드 전달 방법으로서의 지질의 비리포솜 혼합물
휴대용 전자 384 채널 피펫Integra−https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma-AldrichH6648버퍼
HEK 293-T17ATCCCRL-11268신장 세포주. 세포는 레트로바이러스 포장을 용이하게 하기 위해 사용되었으며
High Content Screening System:Perkin, Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249DNA 염색
이미지 분석 소프트웨어Perkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
액체 처리기 워크스테이션Perkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
마이크로플레이트 세척기 로봇Biotek−https://go.biotek.com/405tradein
옵티-MEM® (1배)Thermo Fisher Scientific11058트랜스펙션 배지
파라포름알데히드(PFA)시그마-알드리치158127해결사
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3BAddgene, Cambridge, MA22418플라스미드
pCL-EcoAddgene, Cambridge, MA12371플라스미드
페니실린-스트렙토마이신(P/S)시그마-알드리치P0781항생제
인산염 완충 식염수(PBS)MP Biomedicals2810305완충액
PuromycinSigma-Aldrich, St. Louis, MOP8833항생제
라파마이신Calbiochem, 독일5053210자가포식 플럭스 활성제
소프트웨어 CellQuestProBecton Dickinson−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
주사기 필터 0.45 μ m코닝CLS431220멸균 필터
T/C28a2&마이너스;&빼기;인간 연골 세포 세포주
Life Technologies, CA의 Trypsin Gibco15400054T/C28a2 세포와 함께 사용되는 Trypsin
Sigma-Aldrich, St. Louis, MOHEK 293-T17 세포 VSV와 함께 사용되는SM-2002-C
. GAddgene, 케임브리지, MA14888플라스미드
, , , , , , ,, Trypsin

참고문헌

  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Lotz, M. K., Carames, B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nature Reviews Rheumatology. 7 (10), 579-587 (2011).
  3. Carames, B., Taniguchi, N., Otsuki, S., Blanco, F. J., Lotz, M. Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage, and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 62 (3), 791-801 (2010).
  4. Carames, B., Olmer, M., Kiosses, W. B., Lotz, M. K. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis & Rheumatology. 67 (6), 1568-1576 (2015).
  5. Kroemer, G. Autophagy: a druggable process that is deregulated in aging and human disease. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 1-4 (2015).
  6. Leidal, A. M., Levine, B., Debnath, J. Autophagy and the cell biology of age-related disease. Nature Cell Biology. 20 (12), 1338-1348 (2018).
  7. Maiuri, M. C., Kroemer, G. Therapeutic modulation of autophagy: which disease comes first. Cell Death & Differentiation. 26 (4), 680-689 (2019).
  8. Vinatier, C., Dominguez, E., Guicheux, J., Carames, B. Role of the inflammation- autophagy-senescence integrative network in osteoarthritis. Frontiers in Physiology. 9, 706(2018).
  9. du Toit, A., Hofmeyr, J. S., Gniadek, T. J., Loos, B. Measuring autophagosome flux. Autophagy. 14 (6), 1060-1071 (2018).
  10. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO Reports. 10 (2), 173-179 (2009).
  11. Gump, J. M., Thorburn, A. Sorting cells for basal and induced autophagic flux by quantitative ratiometric flow cytometry. Autophagy. 10 (7), 1327-1334 (2014).
  12. Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and Measuring Autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).
  13. Nogueira-Recalde, U., et al. Fibrates as drugs with senolytic and autophagic activity for osteoarthritis therapy. EBioMedicine. 45, 588-605 (2019).

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