바이러스 유발 신경 염증 반응을 연구하는 마우스 풋패드 접종 모델

요약

풋패드 접종 모델은 생체 내에서 바이러스 유발 신경 염증 반응을 특성화하는 데 중요한 도구입니다. 특히, 말초 신경계에서 시작된 바이러스 운동 및 관련 면역 병리학 적 과정에 대한 명확한 평가를 제공한다.

초록

이 프로토콜은 마우스에 있는 alphaherpesvirus 감염 도중 신경 선동적인 반응의 개시 그리고 발달을 연구하기 위하여 이용된 발판 접종 모형을 기술합니다. 알파헤르페스바이러스는 말초 신경계(PNS)의 주요 침략자이기 때문에, 이 모델은 바이러스 복제의 운동, PNS에서 CNS로의 확산, 관련 신경염증 반응을 특성화하는 데 적합합니다. 풋패드 접종 모델은 바이러스 입자가 발바닥 표피의 1차 감염 부위에서 표피, 땀샘 및 진피를 내면화하는 감각및 교감 신경 섬유로 확산될 수 있게 합니다. 감염은 등대 근간 (DRG)에 상반신 신경을 통해 궁극적으로 뇌에 척수를 통해 퍼짐. 여기서, 마우스 풋패드는 포진 심플렉스 바이러스(HSV) 및 수두-동물 바이러스(VZV)와 밀접한 관련이 있는 알파헤르페스 바이러스인 의사 바이러스(PRV)로 접종된다. 이 모델은 PRV 감염이 풋패드와 DRG에 호중구 침투를 특징으로 하는 심각한 염증을 유발한다는 것을 보여줍니다. 염증성 사이토카인의 고농도는 ELISA에 의해 균질화 된 조직에서 이후에 검출됩니다. 또한, DRG에서 PRV 유전자와 단백질 발현(qPCR 및 IF 염색을 통해) 및 프로 염증성 사이토카인의 생산 사이에 강한 상관관계가 관찰된다. 따라서, 풋패드 접종 모델은 알파헤르페스바이러스 유도 신경병증의 근본적인 과정을 더 잘 이해하고 혁신적인 치료 전략의 개발로 이어질 수 있다. 또한, 모델은 다발성 경화증 및 PNS에 대한 바이러스 유발 손상과 같은 말초 신경병증에 대한 연구를 안내할 수 있다. 궁극적으로, 그것은 약물 개발을 위한 생체 내 공구에서 비용 효과적인 역할을 할 수 있습니다.

서론

이 연구는 PNS에서 CNS 및 관련 신경 염증 반응에 바이러스의 복제 및 확산을 조사하기 위하여 발판 접종 모형을 기술합니다. 풋패드 접종 모델은 뉴런^{,1,2,23에서}알파헤르페스바이러스 감염을 연구하는 데 집중적으로 사용되어 왔다. 이 모델의 주요 목적은 신경 tropic 바이러스 CNS에 도달 하기 전에 PNS를 통해 최대 거리를 여행 할 수 있도록 하는 것입니다. 여기서, 이 모형은 의사 바이러스 (PRV)에 감염된 마우스에 있는 특정 신경병증 (신경병성 가려움)의 발달에 있는 새로운 통찰력을 얻기 위하여 이용됩니다.

PRV는 감기 염증, 생식기 병변 및 수두를 유발하는 몇 가지 잘 알려진 병원체(즉, 헤르페스 심플렉스 타입 1 및 2 [HSV1 및 HSV2] 및 수두-동물 바이러스 [VZV]와 관련된 알파헤르페스바이러스로, 각각^4. 이 바이러스는 모두 pantropic 및 특정 조직 유형에 대 한 친화성을 표시 하지 않고 많은 다른 세포 유형을 감염시킬 수. 그러나, 그들은 모두 PNS를 침범 하 여 특징적인 신경 tropism전시 (그리고 때때로, CNS) 호스트 종의. 자연 호스트는 돼지, 하지만 PRV 대부분의 포유류를 감염시킬 수 있습니다. 이러한 비자연적인 숙주에서 PRV는 PNS를 감염시키고 "미친 가려움증"이라고 불리는 심한 소양증을 유도하고, 그 다음에 는 과급성 사망^5,,6을유도한다. PRV 감염의 임상 결과 및 병인에 있는 신경 면역 반응의 역할은 제대로 이해되지 않았습니다.

풋패드 접종 모델은 PRV가 풋패드의 표피 세포에서 감염을 개시할 수 있게 한다. 그런 다음, 감염은 표피, 땀샘 및 진피를 내면화하는 감각과 교감 신경 섬유로 퍼집니다. 감염은 약 60 시간 안에 DRG에 상골 신경을 통해 이동하는 바이러스 입자에 의해 퍼짐. 감염은 척수를 통해 퍼집니다, 동물이 moribund될 때 궁극적으로 힌뇌에 도달 (82 시간 감염 후). 이 기간 동안, 조직 샘플은 면역 반응의 바이러스 복제 및 마커를 위해 수집, 처리 및 분석될 수 있다. 예를 들어, 조직학적 검사 및 바이러스 부하 정량화는 PRV 병인의 임상, 바이러스학 및 신경 염증 과정의 개시 및 개발 사이의 상관 관계를 확립하기 위해 다른 조직에서 수행 될 수있다.

발패드 접종 모델을 사용하여, 마우스에서 PRV 유도 소양증의 세포 및 분자 메커니즘을 조사 할 수있다. 더욱이, 이 모형은 헤르페스 바이러스 감염 도중 바이러스 유도한 신경염증의 개시 그리고 발달에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 알파헤르페스바이러스 유도 신경병증의 근본적인 과정에 대한 더 나은 이해는 혁신적인 치료 전략의 개발로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 이 모델은 헤르페스 후 병변 (예를 들어, 헤르페스 조스터, 대상 포진)을 가진 환자에서 신경 병증 가려움증의 메커니즘을 조사하고 해당 인간 질병에 대한 마우스에서 새로운 치료 표적을 테스트하는 데 유용합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 프린스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토 및 승인 된 프로토콜 (번호 2083-16 및 2083-19)에 따라 수행되었습니다. 이 작업은 엄격하게 생물 안전 수준 2 (BSL-2) 요구 사항을 따라 수행되었다, 우리는 프린스턴 대학 생물 안전위원회에 의해 승인 된 완비 된 실험실이있는. 마우스 풋패드 마모, 바이러스 접종, 마우스 해부 및 조직 수집을 포함한 절차는 프린스턴 대학 생물 봉쇄 동물 시설 실의 생물학적 안전 캐비닛(BSC)에서 수행되었다. 시술을 수행하는 사람들은 일회용 가운, 머리 덮개, 눈 보호, 멸균 장갑, 수술 용 마스크 및 신발 커버를 착용했습니다.

1. 마우스 풋패드 마모

1. C57BL/6 마우스(5-7주 전)를 이소플루란 가스 마취제로 마취 시스템(chamber)을 통해 3%의 투여량으로 전달한다.
   1. 접종 전에 마취의 수술 평면에 마우스를 뒷발에 놓습니다. 다이어프램(동물의 총구에 맞게 충분히 크기가 충분한 슬릿)을 가진 코 콘을 마우스에 부착하고 1.5%-2.0%의 일정한 투여량으로 이소플루란 가스 마취제를 전달한다.
   2. 마우스를 면밀히 모니터링하여 발가락을 강제로 집게하여 생성한 고통스러운 자극에 대한 반응을 제공합니다.
2. 평평한 집게로 뒷발 패드 하나를 가볍게 잡습니다.
   1. 힐과 워킹 패드 사이에 약 20배 의 뒷발 패드의 글라브로우스 피부를 부드럽게 연마하고 에머리 보드 (100-180 모래)를 사용합니다. 너무 자주 마모하거나 너무 많은 압력을 가하여 출혈을 유도하지 마십시오.
   2. 미세 한 집게를 사용 하 여, 천천히 지층 바살레를 노출 하는 마모에 의해 분리 된 지층 각막을 벗겨.

2. PRV 풋패드 접종

1. 2% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/연쇄절제술(재료표)을 함유한 DMEM 매체에서 원하는 티터에 희석된 바이러스 접종을준비한다.
   1. PK15 세포에 바이러스 주식에 플라크 형성 단위(PFU)의 수를 양량화하여 바이러스 용량을 계산 및 표준화하고 그에 따라 바이러스 접종을 희석시.
      참고 : 이 연구에서 PRV (PRV-Becker)의 악성 변형은 8 x 10⁶ PFU의 용량으로 사용되었습니다. 이 복용량은 모든 접종 동물82 h 접종 후 (hpi)에서 임상 증상을 보였다 는 것을 확인하기 위해 이전 예비 실험에 최적화되었다.
   2. 바이러스 접종을 얼음에 보관하고 사용하기 전에 부드럽게 섞습니다.
2. 아브라드 풋패드(국소 투여)에 바이러스 접종(8 x 10⁶ PFU)의 20 μL 액적을 추가합니다. 모의 접종(중간 값만)을 병렬로 수행합니다.
3. 부드럽게 바이러스의 흡착을 용이하게바늘의 샤프트와 함께 10x를 문질러. 바늘 포인트로 긁히지 마십시오. 이 단계를 10분마다 반복합니다.
4. 쥐를 마취 하에 30 분 동안 유지하십시오.
5. 마취를 중지 한 후, 그것은 흉골 recumncy를 유지하고 임상 후속 및 샘플링을위한 개별 케이지에 배치 할 때까지 마우스를 모니터링.

3. 마우스 해부 및 조직 수집

1. 감염 후 적절한 시간에, 질식 방법 (CO_2)에의해 마우스를안락사.
   참고: 이 연구에서는 PRV-Becker 감염된 마우스에 대한 인도적 끝점(동물이 말기 증상을 나타내기 시작할 때)은 82마피로. 제어 동물을 병렬로 안락사시합니다.
2. 바늘/ 핀을 사용하여 수술 매트에 마우스 복부 면을 향합니다. 수술 폼 보드에 핀으로 마우스의 사지를 고정합니다. 모피 오염을 최소화하기 위해 마우스의 복부 면을 70% 에탄올로 적시십시오.
3. 포셉을 사용하여 모피와 피부의 외부 층을 꼬집고 요도 개구부 근처의 미세 한 가위를 사용하여 작은 초기 절개를합니다.
   1. 이 개구부에서 중간 복부 쪽에서 턱까지 절개를 계속합니다.
   2. 앞다리와 뒷다리의 사지쪽으로 두 개의 측면 절개를 확장합니다.
   3. 기본 근육 층에서 피부를 분리 하 고 측면에 핀.
   4. 복강을 열고 흉부 의 기지까지 절개. 두 개의 대반 절개를 만들어 복강의 개구부를 완료합니다.
   5. 양쪽 의 횡격막과 갈비뼈를 절단하여 흉부 구멍을 엽니 다.
      참고: 흉곽의 측면을 절단하면 심장이 절단될 위험이 있습니다.
   6. 1.5 mL 마이크로튜브에서 심장, 폐, 비장, 췌장, 간, 신장 및 방광을 포함한 노출된 장기를 수집합니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
   7. 발 뒤꿈치와 보행 패드 사이에 마모 된 풋 패드를 잘라 단계 3.3.6에 설명 된 바와 같이 튜브에 조직의 조각을 배치합니다.
4. 마우스 등쪽을 위로 놓고 70% 에탄올로 털을 적시습니다. 척추 컬럼을 노출하기 위해 피부 층을 잘라냅니다.
   1. 골반 의 영역에서 작은 절개를합니다. 뒷다리에서 머리쪽으로 피부를 제거합니다.
   2. 양쪽의 척추와 평행하고 가까운 가위로 절단하여 다리와 팔을 제거합니다.
   3. 두개골 (C1-C2 수준)의 기지에서 머리를 잘라.
   4. 앞면 의 매그넘에서 정면 뼈에 가위로 두개골을 열어 잘라.
   5. 집게를 사용하여 측면 방향으로 두개골을 엽니다.
   6. 집게를 사용하여 뇌를 부드럽게 떠서 3.3.6 단계에서 설명한 대로 진행합니다.
5. 구부러진 가위를 사용하여 근육, 지방 및 연조직을 절단하여 척추를 청소하십시오. 꼬리를 잘라. 멸균 얼음-차가운 인산염 완충식식염(PBS)을 포함하는 15mL 튜브에 그대로 척추를 놓습니다. 척수와 DRG의 추가 해부때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

4. 척수 및 DRG 추출

참고: 마우스 해부 바로 다음 척추 기둥에서 척수와 DRG를 추출합니다. 척수 및 DRG 추출 프로토콜은 이전 간행물^7에서채택되었습니다.

1. 얼음 차가운 PBS 튜브에서 척추 컬럼을 제거하고 냉장 후 쉽게 되는 남은 연조직을 제거합니다.
2. 면도날을 사용하여 척추(T1, L1 및 S2 수준)를 통해 컬럼에 세 개의 횡반 컷을 만듭니다. 멸균 얼음 차가운 PBS가 들어있는 15mm 페트리 접시에 세 조각을 놓습니다. 이후 분석을 위해 세그먼트의 원점을 추적하고 표시합니다.
3. 하나의 세그먼트를 가지고 위를 향하고 있는 집게, 등쪽 측 사이에 고정하십시오. 면도날을 사용하여 중간선을 잘라내고 컬럼을 두 개의 동일한 반으로 분할합니다.
4. 두 반쪽을 새로운 멸균 얼음-차가운 PBS가 들어 있는 새로운 페트리 접시에 담는다. 세그먼트의 올바른 방향이 왼쪽과 오른쪽 면을 구별할 수 있는지 확인합니다.
5. 해부 현미경에서 척수를 각 반쪽에서 미세 한 집게를 사용하여 caudal 방향으로 부드럽게 껍질을 벗깁니다.
6. 멸균 얼음 감기 PBS의 500 μL을 포함하는 1.5 mL 마이크로 튜브에서 두 척수를 모두 수집합니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
7. 척추의 한쪽에서 다른 쪽으로 수막을 부드럽게 제거하여 DRG를 노출시십시오.
8. 노출된 척추 신경을 움켜쥐어 각 DRG를 개별적으로 제거하고 척추에서 부드럽게 당깁니다. 수집된 DRG를 얼음차가운 PBS가 들어있는 15mm 페트리 접시에 넣습니다. 모든 ipsilateral 및 contralateral DRG를 척추 기둥 세그먼트와 별도로 수확하고 4.5 단계에서 설명된 대로 진행합니다.
   참고: DRG는 백색 척추 신경을 따라 둥근 투명한 구조로 볼 수 있습니다.
9. 30-45분 이내에 두 개의 다른 척추 기둥 세그먼트를 사용하여 4.3-4.7 단계를 반복하십시오.
10. 원심 분리기는 4 °C에서 3 분 동안 고속 (17,900 x g)의모든 튜브입니다.
11. 액체 질소에 슈퍼 내열및 플래시 동결 튜브를 흡인. 추가 조직 균질화를 위해 -80 °C에 튜브를 저장합니다.
12. 대안적으로, 4.9단계 이후 조직병리학적 분석 및/또는 면역형광 염색을 위해 세척된 DRG 및 기타 마우스 조직을 수정및 절제한다.

5. 조직 균질화

1. 얼음에 얼어 붙은 조직 샘플을 포함하는 튜브를 해동.
2. 100 mg의 조직을 계량하고 멸균 강철 비드와 0.5 M EDTA (pH = 8.0), 1 M Tris-HCl (pH = 8.0), 5 M NaCl, 10 % SDS 및 프로테이즈 칵테일을 포함하는 2 mL 마이크로 센트리시드 분리기 튜브에 배치하십시오.
3. 실온(RT)에서 균질화제를 사용하여 2분 동안 20사이클/s로 조직을 방해하고, 대기 기간이 1분, 20사이클/s는 2분 동안 발생합니다.
4. RT에서 10 분 동안 고속 (17,900 x g)에서튜브를 원심 분리합니다.
5. 새로운 튜브에서 상체(500 μL)를 수집하고 ELISA 및 qPCR을 수행하여 염증 성 마커및 바이러스 부하를 각각 정량화할 때까지 -20 °C에 저장하십시오.
   참고: qPCR의 경우 RNase 가없는 재료 (즉, 구슬, 튜브 등)로 모든 샘플을 수집하고 1 % 베타 메메르 카포에탄올(재료 표)을포함하는 RNA 용해 완충제로 조직을 방해합니다.

6. 냉동 DRG 섹션의 제제 및 면역 형광 염색

1. 조직 처리
   1. 해부 및 청소 된 DRG를 RT에서 2 시간 동안 1 % 파라 포름알데히드 (PFA)로 수정합니다.
   2. PBS에서 10% 자당으로 조직을 15mL 튜브로 옮기. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
   3. PBS에서 20%의 자당으로 조직을 15mL 튜브로 옮기. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
   4. PBS에서 30%의 자당으로 조직을 15mL 튜브로 옮기. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
   5. 10월에 는 극저온을 사용하여 조직을 포함하고 빠른 동결을 위해 드라이 아이스에 블록을 배치합니다.
   6. 사용 전까지 샘플을 -80°C에 저장합니다.
2. 냉동 절제 준비
   1. -80°C에서 냉동 블록을 제거하고 30 분 동안 극저온 챔버 온도에서 평형 할 수 있습니다.
   2. 15 μm의 두께로 DRG를 저온하고 슬라이드에 섹션을 장착합니다.
   3. 펜을 사용하여 슬라이드 장착 조직 주위에 소수성 원을 그립니다.
   4. 슬라이드를 염색할 때까지 4°C로 유지합니다.
3. 면역형광 염색
   1. RT에서 10 분 동안 PBS에서 DRG 섹션 3배를 세척하십시오.
   2. 37°C에서 1h에 원하는 1차 항체(예를 들어, PRV 당단백질 B에 대한 마우스 항체)의 100 μL로 단면을 배양한다. 10% 음의 염소 세럼을 함유하는 PBS의 1차 항체를 희석시.
   3. 6.3.1 단계를 반복합니다.
   4. 37°C에서 50분 동안 원하는 이차 항체(염소 항마우스 알렉사 플루어 488)의 100 μL로 섹션을 배양한다. PBS에서만 이차 항체를 희석시다.
   5. 섹션에 PBS에서 희석 된 DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) 염료 100 μL을 추가합니다. 추가 37 °C에서 10 분 샘플을 배양.
   6. 6.3.1 단계를 반복합니다.
   7. 유리 슬라이드에 형광 장착 매체를 사용하여 샘플을 마운트하고 커버 슬립으로 고정및 덮습니다.

7. 파라핀 임베디드 조직 섹션의 준비 및 H&E 염색

1. 4°C에서 24시간 동안 10% 포르말린으로 조직을 고정한다.
2. 고정 조직의 파라핀 포함 및 단면에 대한 표준 처리 일정을 수행합니다. 고정 된 조직을 70 % 에탄올로 옮기고 업그레이드 된 알코올을 통해 자일렌으로 처리하고 파라핀이 8로^{나타났다.}
   참고: 폴리에스테르 스폰지를 사용하여 DRG와 같은 작은 조직 샘플을 카세트 내부에 보관하십시오.
3. 이전에 설명한 바와 같이 조직 섹션의 H&E 염색 다음에 표준 비파라피화를^{수행합니다.}

결과

마우스 풋패드 접종 모델은 생체 내에서 알파헤르페스바이러스 감염의 면역병증의 특성화를 허용하며, 이는 접종된 풋패드에서 신경계로의 감염의 복제 및 확산을 포함하고 특정 신경염증 반응의 유도를 포함한다.

이 연구에서는 마우스 뒷발패드를 먼저 밟고 모의 접종을 하거나 PRV(PRV-Becker)의 악성 균주로 아브라드 부위를 접종했습니다. 마모 부위는 제어 풋패드에 표시되었습니다. 치유 과정의 일환으로 찰과 부위에 지각이 형성되었다(도1,검은 화살). 대조적으로, PRV로 접종된 마우스는 풋패드의 붓기와 발적을 특징으로 하는 인도적 종점(82hpi)에서 심한 염증을 보였다.

악성 PRV-베커 균주를 가진 발판 접종에 따라, 마우스는 접종된 발판의 팽윤 및 점점 더 빈번한 떨림을 특징으로 하는 72 hpi에서 임상 표시를 보여주기 시작했습니다. 82마피로, PRV-베커 감염된 마우스...

토론

여기에 설명된 풋패드 접종 모델은 알파헤르페스바이러스 감염 시 신경염증 반응의 개시 및 발달을 조사하는 데 유용하다. 더욱이, 이 생체 내 모델은 PNS에서 CNS로 알파헤르페스바이러스의 복제 및 확산의 역학을 확립하는 데 사용된다. 이는 깊은 진피^{스크래치(13)}또는 CNS^14,,15,16에바이러스를 직접 도입하는 두개내 경로에 의존하는 측면 피부 접종^모델과같은 다른 접종 모델과 대체이다. 그 결과, 풋패드 모델을 통해,^{신경계(11,,12)에서}관련 국소 및 먼 면역병리학적 과정과 함께 복제및 확산의 바이러스 역학에 대한 보다 상세한 평가를 얻을 수 있다.

이 프로토콜에...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항체 항 PRV gB	실험실		1/500 희석
Aqua-hold2 pap pen red	Fisher scientific	2886909
Compact emery boards -24 count (100/180 grit nail files)	Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001
C57BL / 6 마우스 (5-7 주)	The Jackson 실험실
DAPI 용액 (1mg/ml)	Fisher scientific	62248	1/1000 희석
일회용 멸균 폴리스티렌 페트리 접시 100 x 15 mm	시그마-알드리치	P5731500
둘베코의 변성 이글 배지(DMEM)	하이클론, GE 헬스케어 생명과학	SH30022
둘베코의 인산염 완충액 식염수(PBS) 용액	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30028
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30088
Fine curved scissors stainless steel	FST	14095-11
Fluoromount-G mounting media	Fisher scientific	0100-01
포르말린 용액, 중성 완충 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Isothesia Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
마이크로 원심분리기 튜브 2ml	Denville Scientific	1000945
마이크로튜브 1.5ml	SARSTEDT	72692005
음성 염소 혈청	Vector	S-1000
페니실린/스트렙토마이신	Gibco	154022
정밀 글라이드 바늘 18G	BD	305196
면도날 스틸 백	Personna	9412071
RNA 용해 완충액 (RLT)	Qiagen	79216
스테인레스 스틸 비드, 5mm	Qiagen	69989
Superfrost / plus microscopic slides	Fisher scientific	12-550-15
Tissue lyser LT	Qiagen	69980
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
488 (염소 안티 마우스)	Life Technologies	A11029	1/2000 희석