마우스에서 완전한 Transection 형 척수 손상의 유도

요약

이 프로토콜은 척수 손상 연구에 대한 최소한의 부수적 손상과 함께 마우스 모델에서 안정적인 횡부 형 척수 손상을 유도하기위한 정확한 라미네절절제술을 만드는 방법을 설명합니다.

초록

척수 손상 (SCI)은 주로 외상의 결과로 돌이킬 수없는 영구적 인 기능 상실로 이어집니다. 세포 이식 방법과 같은 몇몇 처리 선택권은 SCI에서 생기는 쇠약하게 하는 무력을 극복하기 위하여 연구되고 있습니다. 대부분의 임상 전 동물 실험은 SCI의 설치류 모델에서 수행됩니다. SCI의 쥐 모델은 널리 사용되는 동안, 마우스 모델은 쥐 모델보다 상당한 장점을 가질 수 있지만, 덜 관심을 받고있다. 마우스의 작은 크기는 쥐에 대 한 보다 낮은 동물 유지 보수 비용에 동일시, 수많은 형질 전환 마우스 모델의 가용성연구의 많은 유형에 대 한 유리. 동물에서 반복 가능하고 정확한 부상을 유도하는 것은 SCI 연구의 주요 과제이며, 작은 설치류에서는 고정밀 수술이 필요합니다. transection 형 상해 모형은 이식 기지를 둔 치료 연구를 위한 마지막 10년간 일반적으로 이용된 상해 모형이었습니다, 그러나 마우스에 있는 완전한 transection 모형 상해를 유도하기 위한 표준화된 방법은 존재하지 않습니다. 우리는 흉부 척추 수준 10 (T10)에서 C57BL/6 마우스에서 완전한 흉부 유형 상해를 유도하기위한 수술 프로토콜을 개발했습니다. 절차는 정확하게 라미나를 제거하기 위해 rongeurs 대신 작은 팁 드릴을 사용, 그 후 둥근 절삭날이 있는 얇은 블레이드척수 편절을 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 최소한의 부수적인 근육과 뼈 손상을 가진 작은 설치류에 있는 재현가능한 편부 모형 상해로 이끌어 내고 그러므로 행동 기능 결과가 분석되는 경우에 특히 혼란 요인을 극소화합니다.

서론

척수 손상 (SCI)은 건강과 라이프 스타일에 급격한 변화를 초래하는 복잡한 의료 문제입니다. SCI에 대한 치료법은 없으며 SCI의 병리학은 철저히 이해되지 않습니다. 동물 SCI 모델, 특히 설치류 모델은 새로운 치료법을 시험하기 위한 귀중한 도구를 제공하며 수십 년 동안 SCI를 탐구하는 데 사용되어 왔습니다. 현재까지, 전임상 SCI 연구의 72% 이상은^쥐1을 사용한 단지 16%에 비해 쥐 모형을 채택했습니다. 비록 쥐, 그들의 더 큰 크기와 인간 SC와 유사한 충 치 형성 하는 경향, 전통적으로 새로운 치료 접근 을 공부 하기 위한 선호 하는 모델 동물 되었습니다., 쥐 (많은 형질 전환 마우스 모델을 포함 하 여) 지금 SCI^2의세포 및 분자 메커니즘을 공부 하기 위해 더 자주 사용 되 고 있다. 마우스 모델은 쥐보다 취급이 용이하고 생식 속도가 빨라지고 비용이 절감되는 측면에서 추가적인 이점을 제공합니다. 마우스는 또한 인간^1,2,3과게놈 유사성의 높은 정도를 나타낸다. 마우스 모델의 주요 단점은 척수 손상을 생성하고 치료하기위한 외과 적 개입에 대한 도전을 만드는 상당히 작은 크기로 확인되었습니다^4,5.

마우스 모델에서 안정적인 SCI를 유도하기 위한 견고하고 재현 가능한 수술 프로토콜의 필요성을 강조하는 기존 문헌에는 격차가 있습니다. 따라서 이러한 한계를 극복하기 위해 이 프로토콜에서 참신하고 정확한 수술 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 마우스에서 황부 형 상해를 유도하기 위한 심층 지침을 제공하며, 이 부상 유형은 부상^6,신경 가소성, 신경 회로 및 조직 공학 접근법^7에따른 재생 및 퇴행성 변화를 연구하는 데 가장 적합한 것으로 인식되고 있다. 우리는 흉부 수준 SCI가 문헌^1에서가장 일반적으로 사용되기 때문에, 낮은 흉부 영역에서 부상을 유도하기로 결정했다.

프로토콜

모든 절차는 그리피스 대학 동물 윤리위원회 (ESK/04/16 AEC 및 MSC/04/18 AEC)의 승인으로 수행되었습니다.

1. 수술에 대한 동물 설정 절차

1. 동물을 마취하고 안정화시하십시오.
   1. 8-10 주 된 여성 C57BL/6 마우스를 사용 하십시오. 마취유도를 위해 L/min 산소 1에 5%의 이소플루란을 사용하십시오. 마취의 유지 보수를 위해 1 L /min 산소에 1.5-2 %의 이소플루란을 사용하십시오. 꼬리와 뒷발에 통증 반사의 부족을 설정하여 적절한 마취를 확인합니다.
2. 항생제 커버를 위해 부프레노르핀(0.03 mg/kg 체중)을 항생제 커버용으로 투여하여 체중에 따라 피하합니다. 멜록시캄 (2 mg/kg 체중) 필요한 경우 장기 진통제에 대 한 주어질 수 있습니다.
3. 가열 패드로 동물의 체온을 37 °C에서 안정적으로 유지하십시오.
   1. 등뼈 척추 위에 수술 부위를 노출시키기 위해 뒤쪽 털을 면도합니다. 절개 부위를 살균하기 전에 수술 부위에서 면도 된 모피를 제거하십시오. 포비도요오드 살균 액자와 외과 정신에 담근 멸균 면 봉면으로 면도 부위를 살균하십시오.
4. 마우스의 발을 수술 부위에 테이프로 테이프로 사용하여 동물을 안정시합니다(도1A). 마우스 위에 타원형 창 드레이프를 놓습니다(그림1B).

2. 라미네절제술

1. 외과 메스를 사용하여 T10 척추 수준에서 수직 중간 선 절개를 합니다.
   1. Laminectomy의 사이트를 결정하기 위해 T10 척추의 가시 공정을 찾습니다. 척추의 본체는 가시 공정^8의 끝에 약간 두개골이 있습니다(그림 2참조). 팁은 T11 척추^8의중간점에 대략 받침대가 놓습니다.
   2. 절개 ~2.5 cm 길이를 만드시면 T10 척추의 척추가 절개 길이의 중간에 약 되도록 합니다.
2. 피부를 반사하고 리트랙터로 후퇴합니다.
   1. 직선 집게를 사용하여 기본 근막에서 피부를 들어 올립니다. 이렇게 하면 리트랙터가 배치될 수 있는 공간이 생성됩니다. 이들은 수술 장을 열어 둘 것입니다.
3. 피하 조직 및 근막의 무딘 해부를 수행하여 가시 적 과정을 노출시하십시오.
   1. 메스의 무딘 가장자리를 사용하여 피하 조직및 기본 근막에서 작은 중간 선 절개를 하여 T9-T11 척추의 척추를 노출시하십시오. 미세 팁 집게(비날카로운)를 사용하여 무딘 해부를 수행하고 근막을 반사합니다.
4. 파라 스핀근육을 분할하고 분리하여 라미네를 노출시합니다.
   1. 메스의 무딘 끝을 사용하여 등쪽 트렁크 근육과 T9-T11 척추의 척추를 따라 파라 가시 근육을 분할합니다. 무딘 미세 팁 집게를 사용하여 근육의 무딘 해부를 레이어에 넣고 척추의 라미네를 노출시하십시오. 이것은 어떤 출혈든지 최소화해야 합니다.
      참고: 출혈이 있는 경우, 온수염(37°C)의 관개와 면봉을 사용하여 이를 제어하고 수술장에서 혈액을 맑게 합니다.
   2. 동일한 포셉을 사용하여 T10 척추의 횡방향 공정 주위에 작은 주머니를 만듭니다. 곡선 된 집게를 사용하여 생성된 포켓(도 1C)에서횡방향 프로세스 에서 프롱을 연결하여 T10 척추 본체를 안정화시하십시오.
   3. T10 라미네를 따뜻한 식염수로 철저히 헹구고 면 봉면으로 깨끗하게 닦아 뼈 표면을 명확하게 시각화합니다. 근육/인대 부착이 양측 의면을 따라 남아 있지 않도록 하십시오.
5. 미세 팁(직경 0.55mm, 길이 7mm)이 있는 드릴을 사용하여 라미네를 양측으로 분해합니다.
   1. 드릴의 끝을 사용하여 드릴을 켜지 않고 T9-T10 연골 공간에서 T10-T11 상호 부간 공간으로 수직 경로를 추적합니다. 이것은 드릴 비트가 어떤 조직(도 1D)을잡지 않도록하기 위한 것입니다.
   2. 이제 드릴을 켜고 T10 척추의 오른쪽 라미나에 수직 트렌치를 천천히 조심스럽게 파고 들수 있습니다. 라미네절 절제술의이 부분은 직선 수직 선에서 뼈의 두께에 걸쳐 정확한 수술 결함을 만들어야한다. 척추를 안정적으로 유지하기 위해 구부러진 집게로 그립을 유지합니다.
6. 드릴 끝이 뼈를 관통하지 않고 척수를 손상시키지 않도록하십시오. 라미나 왼쪽에서 동일한 프로세스를 반복하여 구부러진 포셉으로 척추를 안정적으로 유지합니다. 따뜻한 식염수로 관전하여 남은 뼈 조각을 씻어내도록 합니다.
7. 신경 아치의 후방 부분을 들어 올리고제거합니다(도 1F).
   1. 각진 미세 팁 집게를 사용하여 가시 공정을 잡고 양자 드릴링으로 분리된 라미네의 전체 등등 세그먼트를 제거합니다. 출혈이 있는 경우 다시 면봉하고, 라미네절제술창(그림 1E)에노출된 척수를 명확하게 시각화한다.

3화 트란섹션

1. 블레이드의 단일 조각으로 노출된 코드의 횡부에 의해 척수 손상을 유도합니다.
   1. 라미네절제술 창 중앙에 코드를 슬라이스하기 위해 좁고 둥근 절단 가장자리 블레이드를 사용합니다. 척추의 측면 오목이 완전한 횡부 손상을 유도하도록 하십시오(도1G).
2. 무딘 미세 팁 집게를 사용하여 횡부 부상의 완전성을 확인하고 트랜섹션 부위의 나머지 연결을 제거합니다.
3. 수술 층을 닫기 전에 출혈을 제어하십시오.
4. 따뜻한 식염수에 사용하여 간질 된 코드 그루터기에서 발생하는 출혈을 관개하고 취소하십시오. 면 봉봉을 사용하여 필요한 경우 hemostasis를 달성하기 위해 부드러운 압력을 가하십시오. 척수를 압축하지 않도록주의하십시오.

4. 폐쇄 및 즉시 수술 후 치료

1. 근육을 함께 가지고 근육을 레이어에 봉합사.
   1. 트란섹션 부위에서 헤모스타증이 발생하면 T10 척추에 곡면 집게 그립을 놓습니다. 좋은 정점을 달성하기 위해 중간선을 따라 해부 된 근육의 가장자리를 함께 가져.
   2. 5-0 폴리글락틴 910 흡수성 봉합사를 사용하여 층의 근육을 봉합합니다. 척추의 자연적인 곡률이 봉합사 선에서 긴장을 일으키지 않거나 봉합사를 열어 라미네절제술 부위를 노출시키지 않도록 하십시오.
2. 피하 조직과 피부를 닫습니다.
   1. 5-0 흡수성이 없는 실크 봉합사를 사용하여 피부 절개를 닫습니다. 폐쇄하기 전에 피부 밑에 출혈, 혈전 또는 파편이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 이 단계에서는 따뜻한 식염수로 최종 관개가 필요할 수 있습니다.
3. 마취를 중지합니다. 동물이 회복될 때까지 10-30분 동안 관찰하십시오. 이 기간 동안 동물은 가열 패드에 남아 있어야합니다. 케이지에 물 젤과 수화 음식을 제공합니다.
4. 수술 후 치료를 위해, 처음 이틀 동안 부프레노르핀 (매일 두 번), enrofloxacin (매일 한 번)을 포함한다. 또한, 동물 윤리위원회의 지침을 준수, 수동으로 적어도 매일 두 번 방광을 비웁다.
   참고 : 이 실험에서 동물은 지속적인 통증 (부프레노르핀의 추가 복용량을 제공하기 위해) 또는 감염 (추가 엔로플로록사신), 영양 및 수분 상태 (탈수 된 경우 주 사용 가능한 유체) 및 자동 절제술의 징후 (경미한 자가 절제술의 경우 상처 치료를 제공)에 대한 검사를 포함, 그들의 일반적인 건강과 웰빙을 위해 매일 두 번 평가되었다. 안락사 결정을 포함한 수술 후 치료의 이러한 측면은 기관 동물 윤리위원회의 지도하에 결정되어야합니다.

5. 부상 모델 평가

1. 모터 기능의 손실을 확립.
   1. 부상당한 마우스에 대한 모터 거동을 평가하여 2, 7, 14, 21 및 28일 동안 바소 마우스 스케일(BMS)을 이용하여 오픈 필드에서 부상 후 9(도 3C-E)의손실을 결정한다.
2. 상해의 조직학적 확인
   1. 안락사 후 척추 컬럼으로 부상당한 척수를 수확하십시오 (동물 윤리위원회의 승인을 받은 대로 이 실험에서 이산화탄소로 행해짐).
   2. 4% 파라포름알데히드에서 하룻밤 잠수에 의해 조직을 수정하고 3주 동안 20% 에틸렌 디아민 테트라아세산(EDTA)으로 치료를 통해 뼈를 탈칼시화하여 48h마다 신선한 EDTA를 대체합니다.
   3. 저온 단면에 대한 탈화 된 척추를 준비하고 30 μm 두께의 섹션으로 잘라.
   4. 젤라틴 코팅 유리 슬라이드에 섹션을 마운트하여 안티 GFAP 항체 및 Hoechst 33342로 면역 염색을 합니다.
   5. 형광현미경(도 3A)에슬라이드를 이미지하고 이미지 분석 소프트웨어(예: 니콘 분석 소프트웨어- NIS Elements[도 3B])를사용하여 부상 크기의 측정을 수행한다.

결과

도 1에묘사된 결과 방법은 마우스(도1A)의적절한 안정화와 척추 및 기생충 조직의 양호한 시각화(도1B)를포함한다. 척추 과정과 라미나는 최소한의 근육 해부 및 혈액 손실(도 1C,강조 영역)으로 명확하게 시각화 될 수 있습니다. 미세 팁 드릴링은 도 1D에도시된 대로 수행되어 사각형에 표시된 대로 라미네절제술 창을 만듭니다. 생성된 라미케절제술 창은 명확하며 척수에 직접 시각화하고 접근할 수 있게합니다(그림 1E,강조 표시된 영역). 이 프로세스의 회로도 개념은 도 1F에설명되어 있습니다. 좁은 편두 블레이드는 이산 절근...

토론

이 방법은 마우스의 T10 척추 수준에서 완전한 트란섹션 유형 부상을 유도하여 동물의 완전한 하반신 마비를 발생시며 부상 수준 보다 낮습니다. 전반적으로,이 방법은 최소한의 출혈, 무시할 수있는 부수적 인 손상 및 안정적이고 재현 가능한 부상을 초래합니다. ^{라미네절제술(10)이}없는 이전에 발표된 트랜섹션 방법과 비교하여, 이 방법은 척추의 곡률을 조작하지 않고 직접 시각화, 부상의 완전성을 더 잘 제어하며 출혈을 제어하고 hemostasis를 달성하는 향상된 기능을 제공합니다. 이 방법의 장점은 프로토콜이 T10 이외의 다른 척추 수준에서 사용하기 위해 수정할 수 있을 뿐만 아니라 헤미 섹션, 부분 등쪽 흉부, 등쪽 루트 avulsions, 호감 및 타박상과 같은 다른 부상 유형을 수행할 수 있다는 것입니다.

이 프로토콜의 주요 구성 요소는 미세 팁 드릴을 사용한다는 것입니다. 드릴의 사용은 높은 기술 수준과 더 광범위한 훈련을 필요로 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Baytril 주사 가능한 50 mg/mL, 50 mL	Provet	BAYT I	수술 후 관리 약물
Betadine 500 mL	Provet	BETA AS	소모품
Castroviejo 바늘 홀더, 잠금	ProSciTech	T149C	재사용 가능
세라믹 지르코니아 블레이드, 날카로운 면이 있는 원형, 단일 모서리, 각진	ProSciTech	TXD101A-X	재사용 가능한
면봉( 5pcs)	Multigate	21-893	소모품
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	무선 회전 도구
드레싱 펜치 파인	Multigate	06-306	일회용
일회용 드릴 비트	Kemmer Prä zision	SM 32 M 0550 070	재사용 가능한
Dumont #7b 집게	Fine Science Tools	11270-20	재사용 가능한
Dumont 핀셋, 스타일 5	ProSciTech	T05-822	재사용 가능한
모피 트리머	WAHL	WAHL WA9884-312	제로 오버랩 헤어 트리머
아이리스 가위, Ti, 날카로운 팁, 직선, 90mm	ProSciTech	TY-3032	재사용 가능
Isoflurane isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	마취제
Colibri 견인기 - 4cm	Fine Science Tools	17000-04	재사용 가능한
메스 핸들	ProSciTech	T133	재사용 가능한
시그니처 라텍스 수술 장갑 크기 7.5	Medline	MSG5475	소모품
염화나트륨 0.9%	STS	PHA19042005	소모품
멸균 드레싱 팩	Multigate	08-709	일회용
일회용 멸균 유체 불침투성 드레이프 60x60 cm	Multigate	29-220	일회용
수술 정신 100 mL	Provet	# SURG SP	소모품
봉합사 재료 - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	실크 봉합
봉합사 재료 - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug)	Provet	TEMG I	수술 후 케어 약물

사