여기에 보고된 감염한 세포의 전기 임피던스 에 대한 실시간 모니터링을 이용한 전염성 바이러스 입자의 정량화를 위한 프로토콜이 있다. 이 방법의 실용적인 적용은 환경 조건을 모방하는 다른 물리화학 적 매개 변수하에서 인플루엔자 A 바이러스 부패를 정량화하여 제시된다.
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이 논문에서
요약
초록
바이러스 입자 정량화에 대한 방법은 많은 바이러스학 연구의 중요한 측면을 나타냅니다. 몇 가지 신뢰할 수 있는 기술이 존재하지만 시간이 많이 걸리거나 작은 변형을 감지할 수 없습니다. 여기에 제출된 것은 감염된 세포의 전기임피던스 변이를 실시간으로 분석하여 바이러스 성 티터의 정확한 정량화를 위한 프로토콜이다. 세포 임피던스는 마이크로 플레이트의 세포 아래에 위치한 금 마이크로 전기 전전자 바이오 센서를 통해 측정되며, 크기는 세포의 수와 크기와 모양에 따라 달라집니다. 이 프로토콜을 사용하면 향상된 감도로 세포 증식, 생존 가능성, 형태 학 및 마이그레이션을 실시간으로 분석할 수 있습니다. 또한 시간이 지남에 따라 바이러스 감염에 영향을 미치는 다양한 물리화학 적 매개 변수 (즉, 온도, 염도 및 pH)에 제출 된 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)의 부패를 정량화하여 실용적인 응용 프로그램의 예가 제공됩니다. 이러한 응용 프로그램의 경우 프로토콜은 전염성 바이러스 입자의 정확한 정량화 데이터를 생성하는 동시에 필요한 워크로드를 줄입니다. 그것은 주어진 환경에서 지속 할 수있는 용량을 반영하는 다른 IAV 사이의 불활성화 슬로프의 비교를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고, 매우 재현 가능하며, 세포 배양에서 세포 병증 효과를 생성하는 모든 바이러스에 적용 될 수 있습니다.
서론
바이러스의 전송은 몇몇 요인의 조합에 의존합니다. 환경에서 분비된 바이러스의 경우, 전송은 호스트 외부의 조건에서 지속되는 능력에 따라 달라집니다. 일반적으로 바이러스 성 불활성화를 연구하는 것은, 그러므로, 국가 보건 당국과 정책 입안자가 통제 및 생물 안전 조치를 실행하는 것을 돕는 중요한 단계입니다.
자연 및 실험실 설정에서 바이러스 지속성에 대 한 지식은 지난 10 년 동안 상당히 증가 했다. 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 경우, 이들의 전송 경로는 광범위한 환경 조건에 바이러스 입자를 제출합니다. 구체적으로, 1) 배설구 경로를 통해 물(즉, 조류 바이러스) 또는 2) 오염된 포미트뿐만 아니라 에어로졸 및 호흡기 방울(즉, 가금류 및 포유류 바이러스)에 의한 직접 또는 간접 접촉을 통해 전달될 수 있다. 어쨌든, IAV는 다양한 물리화학적 매개변수(즉, pH, 염분, 온도 및 습도)에 제출되며, 이는 감염성에 다소 빠르게 영향을 미칩니다2,3,4,5,6,7,8,9.
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프로토콜
적절한 생체 안전 수준 요구 사항 (BSL-2 이상 하위 유형에 따라) 모든 인플루엔자 바이러스를 처리하십시오. 낮은 통로 기록 (MDCK 세포에 5 배 미만)을 가진 IAV 균주를 사용하여 실험 사이의 낮은 변화를 보장하십시오.
1. 시약 및 시작 재료의 준비
- MDCK 세포 및 멸균 세포 배양 배지의 준비
- 10% 열 불활성 태아 종아리 혈청(FCS) 및 항생제(100단위/mL 페니실린, 100 mg/mL 연쇄절제술)로 보충된 변형 독수리 의 매체(MEM)에서 Madin-Darby Canine 신장(MDCK) 세포를 육성합니다.
- 해동 후, MDCK 세포를 감염시키기 전에 적어도 2배 이상 완전한 회복을 보장합니다(그러나 세포 표현형의 드리프트를 피하기 위해 30개 미만의 통로).
- 종자 75cm2 조직 배양 플라스크(s)는 7.5 x 106 MDCK 세포와 함께 멸균 1x MEM30mL을 함유하고 가습 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
- 임피던스 모니터링 장비 준비
- 인큐베이터에 계측기를 35°C로 놓고 2시간 이상 따뜻하게 해보도록 합니다.
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결과
MDCK 세포의 상이한 농도를 가진 120시간 후에 얻어진 원시 데이터는, 15,000에서 120,000세포당, 도 1에 도시된다. 24시간 후, CI 측정은 30,000개의 세포로 시드된 우물의 세포가 여전히 기하급수적인 성장 단계에 있었으며, 이 세포 농도가 추가 실험을 위해 사용되었다는 것을 보여준다. 도 2 는 CIT50 값과 초기 감염 복합성 사이의 선형 상관관계를 보여 줍니다. MDCK 세포는 24시간 동안 배양된 다음 A/Paris/2590/2009 H1N1 바이러스 균주에 감염된 다른 복합성감염으로 감염됩니다. 초기 CI는 감염 후 5시간 측정됩니다.
도 3 은 실험(패널 A)에 사용되는 실험 절차를 보여 줍니다. 바이러스 유발 세포병증 효과로 인해 CI 감소를 나타내는 전형적인 결과는 .......
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토론
RTCA는 세포 준수, 증식, 마이그레이션 및 세포 독성과 같은 세포 특성의 실시간 모니터링에 점점 더 많이 사용되는 임피던스 기반 기술입니다. 이 연구에서는, 호스트 외부의 IAV 생존을 평가하는 이 기술의 능력은 바이러스 불활성화 경사를 측정하여 입증된다. TCID50 및 플라크 애세와 같은 까다로운 기술은 세포 생존가능성에 대한 객관적인 실시간 평가로 대체되므로 바이러스에 의해 유발된 세포병증 효과를 반영합니다. TCID50 또는 플라크 성형 유닛(pfu)과 유사하게, CIT50 은 또한 감염의 복합성(도 2)과 선형적으로 상관관계가 있다. 이 접근법의 한계 중, 이 방법은 비 세포 병원성 바이러스에 감염된 세포를 정확하게 감시하지 못합니다.
예를 들어, 바이러스 게놈으로 새로운 돌연변이의 도입은 바이러스를 강하게 감쇠시키고 그것의 세포 병원성 감소시킬 수 있습니.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 조직 배양 플라스크 | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 플레이트) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-플레이트는 다양한 패키징에서 사용할 수 있습니다 |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies(gibco) | 14040091 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Life technologies(gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence 실시간 세포 분석 기기 S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | xCELLigence RTCA S16 기기는 다양한 형식(16-well, 96-well, 단일 또는 다중 플레이트)으로 제공됩니다. |
참고문헌
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, Suppl 2 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (....
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재인쇄 및 허가
