방법 논문

초파리의 수상돌기 및 신경근 접합부에서 시냅스 미세소관 역학의 비침습적 생체 내 분석을 위한 3D 입자 추적

DOI:

10.3791/61159

⸱

2020년 5월 12일

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1Blavatnik Institute of Cell Biology and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, 2DRVision Technologies LLC

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 초파리의 감각 수상돌기와 신경근 접합부의 생체 내 미세소관(MT) 플러스 엔드 역학에 대한 자동화되고 편향되지 않은 추적 및 분석을 달성하기 위한 새로운 소프트웨어 전략과 결합된 비침습적 생체 내 신경 세포 이미징 전략을 제시합니다.

초록

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미세소관(MTs)은 신경 발달에 중요한 역할을 하지만, 미세소관의 조절과 기능의 분자 메커니즘에 대해서는 많은 의문이 남아 있습니다. 더욱이, 시냅스후 MT에 대한 이해의 진전에도 불구하고, 시냅스후 MTs가 뉴런 형태형성에 기여하는 바에 대해서는 알려진 바가 훨씬 적습니다. 특히, 초파리 감각 수상돌기의 생체 내 MT 역학에 대한 연구는 폴리머 수준의 거동에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다. 그러나 파리 신경근 접합부(NMJ)의 실시간 이미징과 관련된 기술적 및 분석적 과제로 인해 시냅스 전 MT 역학에 대한 비교 가능한 연구는 제한적이었습니다. 또한, in vitro 및 ex vivo의 MT 역학 자동 분석을 위한 매우 효과적인 소프트웨어 전략이 많이 있지만, 이미지의 신호 대 잡음비가 본질적으로 열등하고 복잡한 세포 형태학으로 인해 in vivo 데이터를 사용하려면 상당한 작업자 입력 또는 완전한 수동 분석이 필요한 경우가 많습니다.  이 문제를 해결하기 위해 이 연구는 자동화되고 편향되지 않은 생체 내 입자 검출을 위한 새로운 소프트웨어 플랫폼을 최적화했습니다. EB1-GFP로 표지된 MT의 실시간 타임랩스 컨포칼 이미지에 대한 다중파라미터 분석은 초파리 유충의 수상돌기와 NMJ 모두에서 수행되었으며 MT 거동에서 현저한 차이를 발견했습니다. 또한 초파리 시냅스 발달의 핵심 조절자인 MT 관련 단백질(MAP) dTACC의 녹다운 후 MT 역학을 분석하고 야생형과 비교하여 MT 역학에서 통계적으로 유의미한 변화를 확인했습니다. 이러한 결과는 폴리머 수준에서 시냅스 전후 MT 역학의 자동화된 다중 매개변수 분석을 위한 이 새로운 전략이 human-in-the-loop 기준을 크게 줄인다는 것을 보여줍니다. 또한 이 연구는 dTACC-knockdown 시 뚜렷한 MT 거동을 감지하는 데 있어 이 방법의 유용성을 보여주며, 이는 생체 내에서 MT 역학을 조절하는 요인의 기능 스크리닝에 대한 향후 적용 가능성을 나타냅니다. 이 방법의 향후 응용 분야는 세포 유형 및/또는 구획별 MT 거동을 밝히고 EB1-GFP와 다른 관심 세포 및 세포 내 마커를 함께 다색 상관 이미징하는 데 중점을 둘 수 있습니다.

서론

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세포는 형태 형성을 통한 세포 내 및 세포 간 변화의 조정을 통해 기능적 구조를 형성하기 위해 조직됩니다. 형태 형성(morphogenesis)의 주목할 만한 예는 고도로 전문화된 신경 세포(neuronal structure)의 발달이다. 뉴런은 구조적으로나 기능적으로 구별되는 두 가지 유형의 돌기, 즉 수상돌기(dendrites)와 축삭돌기(axons)1를 확장하는데, 이는 엄청난 길이를 달성할 수 있다. 뉴런 발달의 복잡성은 수상돌기와 축삭돌기의 순전한 크기뿐만 아니라 복잡하게 분지된 기하학적 구조를 형성하는 것의 어려움에서 비롯됩니다 2,3. 뉴런 형태 형성(neuronal morphogenesis)과 뉴런 형태 형성(neuronal morphogenesis)이 학습 및 기억에 미치는 영향4은 뉴런의 유전적 통제와 기저에 있는 세포의 생물학적 메커니즘에 대한 지속적인 조사에 동기를 부여한다. 이러한 메커니즘에는 세포 내 막 수송 및 신경 세포 형태학의 변화에 필요한 많은 세포골격 재배열이 포함되지만 이에 국한되지 않습니다 1,2,3.

신경 세포 형태 형성에 대한 연구는 다양한 고급 시각화 기술을 만들어 냈습니다. 전자 현미경 또는 고정 프로브의 형광 현미경과 같은 정적 방법은 고해상도 형태학적 및 구조 분석을 수행하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 모든 보존 방법에서 불가피한 인공물 외에도 정적 시각화는 형태 발생을 뒷받침하는 동적 변화를 포착할 수 없습니다. 따라서 많은 중추적인 통찰력이 살아있는 조직의 타임 랩스 형광 현미경 검사에서 비롯되었습니다. Lichtman과 동료들의 초기 연구는 5,6,7 축삭돌기 재생/퇴화, 시냅스 구성 요소 구성 및 장거리 축삭 수송을 조사하기 위해 포유류 신경계의 생체 내 이미징을 활용했습니다. 또한, 원발성 신경 외식에 대한 정액 연구는 축삭 신장 및 운동성에 대한 미세소관(MT) 역학의 중요성을 확립하는 데 중요했습니다 8,9. 결정적으로, 초기 신경 세포 이식 연구에서는 개별 MT 폴리머 수준에서 뉴런을 발달시키는 데 있어 MT 플러스 말단 역학에 대한 귀중한 통찰력을 얻기 위해 형광 태그가 지정된 말단 결합 가족 단백질(EB)의 사용을 확립했습니다10. 이러한 연구는 EB 패밀리 구성원인 EB1이 S. cerevisiae12 및 배양된 세포13에서 MT 플러스 말단11에 우선적으로 국한된다는 관찰에서 비롯되었습니다. 그 이후로, EB1 및 기타 플러스 팁 추적 단백질(+TIPs)14,15은 뉴런 발달17의 맥락을 포함하여 MT 동적 불안정성16에 대한 생체 내 연구에서 널리 사용되었습니다.

초파리(Drosophila)는 파리 연구에 사용할 수 있는 방대한 유전 및 이미징 도구18,19 뿐만 아니라 초파리와 척추동물뉴런 1 사이의 구조와 기능의 유사성으로 인해 뉴런 발달 중 MT 역학의 생체 내 이미징 연구를 위한 강력한 모델입니다. 초파리 유충의 신경근 접합부(NMJ)에 대한 주요 초기 연구에서는 시냅스 전 말단 형태형성을 문서화하기 위해 온전한 동물의 반투명 표피를 통해 형광막 마커의 반복적인 비침습적 이미징을 수행했습니다20. 살아있는 초파리 유충 전체를 이미지화하기 위한 유사한 방법을 사용하여 축삭에서 모터 화물의 진행적 이동에 대한 세포 내 입자 수준 분석의 초기 시연이 제공되었습니다21. 보다 최근에는 Rolls와 동료들이 온전한 초파리 유충 22,23,24,25,26,27의 감각 수상돌기에 대한 세심한 연구를 통해 녹색 형광 단백질(GFP) 태그가 지정된 EB1의 입자 추적 및 분석을 수행하여 시냅스후 MT 플러스 엔드 역학을 특성화했습니다. 초파리(Drosophila) 22,23,24,25,26,27 및 기타 시스템(28,29,30,31,32)에 대한 이러한 연구는 발달 중인 뉴런33의 수상돌기에서 MT 플러스 말단의 단일 중합체 거동에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다.

시냅스후 MT 역학 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31에 대한 인상적인 생체 내 연구에도 불구하고 발달 중인 축삭 말단에서 시냅스전 MT 역학에 대한 비교 가능한 연구는 훨씬 적었습니다. Drosophila 유충 NMJ의 MT 역학은 형광 반점 현미경(FSM)과 광표백 후 형광 회수(FRAP)를 사용하여 연구되었습니다34. 이러한 기법은 전체 튜불린 동역학을 평가하지만 개별 MT 플러스 말단의 거동은 평가하지 않습니다. 이 글을 쓰는 시점에서, Drosophila NMJ에서 개별 MT 플러스 엔드에 대한 단일 조사가 한 번 있었습니다: 이 연구는 실시간 타임랩스 이미징과 카이모그래프의 수동 분석을 결합하여 안정화된 MT의 더 넓은 모집단과 구별되는 "선구적인 MT"로 표시된 동적 EB1-GFP 집단을 특성화했습니다35. 시냅스전 MT 역학에 대한 이러한 연구가 부족한 것은 적어도 부분적으로는 해부학적 구조에 기인할 수 있습니다: 유충 표피에 근접하기 때문에 수상돌기의 이미지를 얻는 것은 비교적 간단하지만, NMJ는 다른 조직에 의해 방해를 받기 때문에 입자 수준 분석을 위한 충분한 신호 대 잡음비를 가진 이미지를 획득하기가 어렵습니다. 그럼에도 불구하고, 시냅스 형태형성 및 안정화에 대한 시냅스전 MT의 중요성이 잘 확립되어 있다는 점과36 신경발달 및 신경퇴행성 장애37와의 연관성을 감안할 때, 시냅스전과 시냅스후 MT에 대한 이해 사이의 이러한 격차를 해소하는 것은 귀중한 통찰력을 얻을 수 있을 것입니다.

in vitro 또는 ex vivo 분석과 달리 일반적으로 in vivo MT 역학 분석에 대한 또 다른 과제는 in vivo 데이터에서 역학 매개변수를 추출할 수 있는 자동화된 소프트웨어 도구가 제한적이라는 것입니다. 현재 +TIP 라벨링된 MT 플러스 엔드 분석을 위한 가장 인기 있고 강력한 기법 중 하나는 여러 동역학 매개변수의 자동 추적 및 분석을 가능하게 하는 MATLAB 기반 소프트웨어인 plusTipTracker38,39입니다. 특히 plusTipTracker는 MT 성장뿐만 아니라 수축 및 구조도 측정합니다: EB1-GFP와 같은 +TIP 라벨은 성장 플러스 말단에만 연관되어 있는 반면, plusTipTracker는 수축률을 알고리즘적으로 추론하고 이벤트를 구출할 수 있습니다. 그러나 plusTripTracker는 초파리 S2 세포40의 생체 외 MT 역학에 대한 이전의 다중 매개 변수 분석을 포함하여 많은 컨텍스트에 매우 성공적으로 적용되었지만 plusTipTracker는 신호 대 잡음비가 낮기 때문에 생체 내 데이터 분석에 적합하지 않습니다. 그 결과, 수상돌기 22,23,24,25,26,27 및 초파리의 NMJ35에서 플러스 엔드 역학에 대한 생체 내 연구는 ImageJ41과 같은 소프트웨어를 사용한 카이모그래프의 수동 생성 및 분석 또는 수많은 human-in-the-loop 구성 요소를 포함하는 반자동 전략에 의존했습니다.

이 연구는 Drosophila third-instar 유충의 감각 수상돌기와 운동 축삭 말단 모두에서 시냅스 전 MT 역학에 대한 비침습적 고분자 수준 분석을 수행하는 데 필요한 실험 및 분석 워크플로를 줄이는 실험 및 분석 워크플로우를 제시합니다. 이 프로토콜은 움직이지 않고 손상되지 않은 유충을 활용하므로 스트레스 반응을 유발하는 것으로 알려진 부상뿐만 아니라 생체 내 MT 역학을 교란할 수 있는 기타 비생리학적 상태를 방지합니다. 동적 MT 플러스-엔드를 라벨링하기 위해 EB1-GFP는 Gal4/UAS 시스템42를 사용하여 범신경 발현되어 단일 드라이버로 수상돌기와 NMJ 모두에서 MT를 시각화할 수 있습니다. 동물 표본 선택 및 이미지화할 영역 식별과 같은 일부 초기 단계는 불가피하게 인간의 의사 결정에 종속되지만, 데이터 수집 이후의 단계는 대부분 자동화되어 있습니다. 결정적으로, 새로운 소프트웨어의 최적화를 통해 최소한의 인간 입력이 필요한 자동화된 편향되지 않은 분석이 가능해졌습니다. 다른 입자 추적 방법을 사용할 수 있지만43,44,45 이 연구는 이 특정 데이터 세트의 특정 문제를 해결하는 데 알고리즘적으로 적합하기 때문에 독점 소프트웨어를 사용합니다. 이 소프트웨어는 이제 다양한 응용 프로그램에서 사용할 수 있습니다. 특히, 일관성을 향상시키는 확산 필터링(46)의 사용은 자동화된 분할 및 배경 제거에 필수적이며, 입자 검출 및 추적을 자동화하기 위해 특별히 맞춤형 알고리즘이 구현됩니다. 이 전략은 이 연구의 데이터에 내재된 낮은 신호 대 잡음비뿐만 아니라 다른 초점면을 통한 EB1-GFP 혜성의 이동과 같은 다른 문제를 효과적으로 처리할 수 있습니다. 다른 모든 입자 분석 소프트웨어에 대해 이 소프트웨어의 성능을 철저하게 테스트하는 것은 불가능하지만, 현재 전략의 성능은 표준 인간 성능과 동등하거나 이에 근접했습니다. 더욱이, 저자가 아는 한, 감각 수상돌기와 시냅스전 말단의 생체 내 데이터에 대해 특별히 훈련된 다른 소프트웨어는 없었습니다. 이미지 분석 알고리즘의 성능이 설계된 데이터에 매우 특이한 경우가 많고 일반화된 컴퓨터 비전이 아직 불가능하다는 점을 감안할 때, 설명된 소프트웨어를 관심 있는 특정 생체 내 데이터에 맞게 훈련하는 것이 가장 알고리즘적으로 건전한 접근 방식일 것으로 예상됩니다.

수지상MTs 22,23,24,25,26,27에 대한 광범위한 작업과 이 시스템에서 획득할 수 있는 일관된 데이터 품질을 감안할 때 이미지 획득 및 소프트웨어 분석 전략은 초파리 감각 수상돌기에서 먼저 검증되었습니다. 중요한 것은 수상돌기에서 다른 뉴런 Gal4 드라이버를 사용하면 동일한 야생형 배경에서도 유전적 배경의 차이로 인해 EB1-GFP 역학에 상당한 차이가 발생한다는 사실이 발견되었으며, 일관된 결과를 위해 단일 Gal4 드라이버를 사용하는 것이 중요하다는 점을 강조했습니다. 이 전략은 NMJ의 시냅스전 말단에서 EB1-GFP 동역학의 다중 매개변수 분석에 다음으로 사용되었습니다. 이 방법의 조사 가치를 더 자세히 설명하기 위해, 이 이미징 및 소프트웨어 전략을 사용하여 고도로 보존된 TACC(변형 산성 코일 코일) 계열의 초파리 상동체인 dTACC의 녹다운 후 시냅스 전 및 시냅스 후 EB1-GFP 역학을 모두 평가했습니다47,48. 초파리 S2 세포(40)에 대한 이전 연구와 제노푸스 성장 원뿔 49,50,51에 대한 Lowery와 동료들의 연구는 TACC 패밀리 구성원이 MT 플러스 엔드 역학을 조절한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 최근 보고된 컨포칼 및 초고해상도 면역형광 이미징의 증거에 따르면 dTACC가 뉴런 형태형성52 중 시냅스전 MT의 핵심 조절자임을 보여주어 dTACC가 실시간 MT 역학을 조절하는지에 대한 의문을 제기했습니다. 이 보고서는 dTACC knockdown 시 실시간 MT 동작의 차이를 실제로 감지할 수 있는 방법을 보여줍니다. 따라서 이 연구는 발달 중인 뉴런 내에서, 특히 시냅스전 구획에서 MT 역학의 주요 조절자를 효과적으로 식별하고 특성화할 수 있는 생체 내 방법을 제시합니다.

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프로토콜

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1. 초파리 표본의 생성

  1. 적합한 MT 플러스-엔드 마커를 선택합니다. 이 연구는 강하고 명확한 신호를 가진 잘 특성화된 플러스 엔드 마커인 GFP 태그가 지정된 EB1을 사용했습니다11,12. 대안으로는 EB310,13, 걸쇠/궤도53 및 CLIP-17054와 같은 다른 +TIP가 있습니다.
  2. UAS 프로모터(예: UAS-EB1-GFP)의 제어 하에 MT 마커를 사용하여 파리를 획득하거나 생성합니다.
  3. 적절한 조직별 Gal4 드라이버를 선택합니다. 이 연구는 감각 수상돌기와 NMJ 모두에서 발현을 유도하기 위해 범신경 드라이버 elaV-Gal458,59를 사용했으며 수상돌기 특이적 발현을 위해 221-Gal4 60,61을 사용했습니다.
  4. 표준 파리 사육 기술을 사용하여 파리를 기른다 55,56. 최적의 Gal4/UAS 발현을 위해 파리를 25°C의 가습 인큐베이터에 보관하는 것이 좋습니다.
  5. 표준 파리 유전 기법55,56을 사용하여 원하는 세포/조직에서 MT 플러스 엔드 마커를 발현하기 위해 파리를 생성하는 교배를 수행합니다.
    참고: 모든 Gal4-driver 및 -transgene 조합의 경우, 실험 설계에는 시스템을 특성화하고 과발현으로 인한 아티팩트를 방지하기 위한 개념 증명 및 검증 실험이 포함되어야 합니다.

2. 장비 설정

  1. 파리, 마취 시약, 슬라이드 건축 자재, 실체 현미경 및 조명 소스를 포함한 워크스테이션을 컨포칼 현미경에 가깝게(즉, 같은 방에) 설정하여 샘플 준비와 이미징 사이에 소요되는 시간을 최소화하여 유충의 건강과 생존력을 연장합니다.
  2. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 9% 클로로포름 혼합물(클로로포름 0.1mL 및 할로카본 오일 1.0mL)을 혼합하여 마취제를 준비합니다. 분리를 방지하려면 각각의 새 슬라이드를 준비하기 전에 튜브를 뒤집어 잘 혼합하십시오.
  3. 유리 슬라이드 준비: 양면 테이프(~15mm 너비) 4줄을 자릅니다. 유리 슬라이드에 두 조각을 정렬하고 스트립 사이에 ~5mm의 공간을 남겨둡니다. 처음 두 조각 위에 나머지 두 조각을 겹쳐 테이프 두께를 두 배로 늘립니다(그림 1C).
  4. 테이프 조각 사이의 5mm 공간에 있는 유리 슬라이드에 클로로포름/오일 혼합물을 한 방울(~100μL)씩 떨어뜨립니다(그림 1C).

3. 이미징을 위한 유충 샘플 준비

  1. 용기(예: 6웰 플레이트)에 PBS 1개를 채웁니다.
  2. 집게 또는 유사한 도구를 사용하여 파리 바이알에서 3번째 instar 유충을 수집합니다. 유충의 기어 다니는 행동과 9-12 개의 눈에 띄는 톱니 모양의 입 고리의 존재로 적절한 단계에서 유충을 식별합니다. 유충의 병기를 정하는 데 도움이 되도록 실체현미경을 사용합니다(그림 1D).
  3. PBS에 유충을 넣고 부드럽게 움직여 음식물이나 기타 찌꺼기를 씻어냅니다. 섬세한 조직에서 유충을 부드럽게 말리십시오.
  4. 유충을 섹션 2의 슬라이드에 있는 클로로포름/오일 방울에 넣어 유충을 마취합니다(그림 1C).
    참고: 유충의 등쪽/복부 방향은 표본의 방향에 관계없이 현미경 스테이지를 적절한 초점면으로 설정하여 반투명 큐티클을 통해 감각 뉴런과 운동 뉴런을 모두 감지할 수 있기 때문에 중요하지 않습니다.
  5. 그 위에 #1.5 커버슬립을 놓습니다. 부드러운 압력을 가하여 커버슬립을 테이프에 부착하여 유충을 손상시키지 않고 고정시킵니다(그림 1C).
  6. 챔버를 바셀린이나 매니큐어로 밀봉하십시오.

4. 살아있는 샘플의 타임 랩스 컨포칼 이미징

  1. 컨포칼 현미경과 오일 이멀젼이 있는 60x 대물 렌즈를 준비합니다. s를 놓습니다ample를 s에tage(그림 1A, B).
  2. 획득 소프트웨어를 사용하여 실험을 구성합니다.
    참고: 이 연구를 위해 각 이미징 시리즈는 z-stack이 아닌 단일 초점면에서 획득되었습니다.
    1. 타임랩스 지속 시간을 2초 간격으로 30초로 설정하여 총 16프레임이 됩니다.
    2. 레이저 노출과 강도를 설정하여 채도와 광표백을 피하면서 충분한 신호를 확보하십시오.
    3. EB1-GFP 이미징을 위해 488nm 레이저는 100ms의 노출 시간과 30%의 강도로 설정되었습니다. 이러한 값은 이 프로토콜의 용도에 따라 달라질 수 있으며 경험적으로 수정해야 합니다.
  3. 현미경의 접안렌즈를 사용하여 광시야-녹색 조명에서 유충을 찾습니다. 스테이지를 천천히 조정하여 수상돌기 또는 NMJ를 찾으십시오. 유충을 필요 이상으로 조명(광시야 또는 공초점)에 노출시키지 마십시오.
    1. 수상돌기는 두껍고 긴 축삭돌기 다발과 쉽게 구별할 수 있는 얇고 밝은 녹색 신경망으로 나타납니다(그림 1E).
    2. NMJ는 신경삭에서 갈라지는 두껍고 긴 축삭 다발의 끝에서 직경 약 5μm의 밝은 녹색 개별 부통 그룹으로 나타납니다(그림 1F).
  4. 라이브 카메라 피드를 사용하여 488nm 조명을 사용하여 관심 영역에 빠르게 초점을 맞출 수 있습니다. 광독성을 피하기 위해 적절한 초점이 발견되면 즉시 조명을 중지하십시오.
  5. 이미지 획득을 시작합니다. EB1 혜성은 밝고 운동성이 있는 반점으로 인식될 수 있습니다.
  6. 형광 라이브 이미징57에 대한 추가 세부 정보 및 지침은 이전에 발표된 프로토콜을 참조하십시오.

5. 소프트웨어 기반 이미지 처리 및 분석

  1. 각 비디오 파일을 개별적으로 분석합니다. 소프트웨어(그림 2에 표시된 사용자 인터페이스) 내에서 File(파일) | 가져오기 | 이미지 시퀀스 를 선택하고 나타나는 상자에서 TIF 파일을 드래그합니다. 비디오를 미리 봅니다.
  2. Detection Parameters 메뉴에서 소프트웨어 매개변수를 조정하여 명확하게 보이는 반점만 감지하고 가짜 물체는 감지하지 않도록 합니다. 예를 들어, 입자 강도를 줄이면 punctae에 대한 소프트웨어의 감도가 높아지지만 잠재적인 거짓 긍정이 증가합니다. 매개변수의 정확한 값은 경험적으로 달라집니다. Detection and Tracking Parameters에 대한 설명은 요청 시 작성자가 제공합니다.
  3. Neuron Particle Tracking 레시피를 적용하여 From beginning 버튼(파란색 화살표, 그림 2B)을 사용하여 이미지를 분석합니다. 소프트웨어는 표 1에 나열된 추적 매개변수에 대한 결과를 결과 스프레드시트(녹색 상자, 그림 2B)에 출력합니다. 나중에 쉽게 분석하고 해석할 수 있도록 Results Spreadsheet 섹션에 있는 Export 기능을 사용하여 결과를 스프레드시트 소프트웨어에 저장할 수 있습니다.
  4. 커서를 이전 단계에서 감지된 반점으로 이동하고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 선택하거나 선택 취소합니다. Ctrl + 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 여러 개의 푼크를 동시에 선택할 수 있습니다.
    참고: 프로젝트 목적과 응용 프로그램에 따라 추가 휴리스틱을 사용하여 펑크를 필터링할 수 있습니다. 예를 들어, 수명이 8-10초(4-5프레임) 미만인 반점은 전체 성장 이벤트에 대한 충분한 정보를 제공하지 않기 때문에 생략될 수 있습니다. 이러한 휴리스틱의 필요성은 경험적으로 다양합니다. 소프트웨어 기능에 대한 자세한 내용은 요청 시 작성자에게 제공됩니다.

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결과

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파리는 UAS-EB1-GFP 전이유전자를 범신경세포(elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP)58,59 또는 감각 뉴런(221-Gal4; UAS-EB1-GFP)60,61. EB1은 성장 말단에 특이적으로 국한되어 일시 중지 및 수축 즉시 해리되기 때문에14,15 초파리 22,23,24,25,26,27,35를 포함한 여러 연구를 통해 입증되었기 때문에 이 연구를 위해 선택되었습니다

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토론

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이 논문은 개발 중 수상돌기와 NMJ에서 MT 역학의 비침습적 생체 내 이미징을 수행하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이미지화할 동물을 선택하는 것과 같은 실험 단계에서는 사람의 개입이 필요하며, 데이터 수집 과정에서 합리적으로 제거할 수 없는 편향이 발생할 수 있습니다. 따라서 프로토콜의 주요 목표는 생체 내 데이터에 내재된 낮은 신호 대 잡음비를 처리하도록 최적화된 새로운 소프트웨어(섹션 5)로 자동 분석을 수행하여 가능한 한 바이어스를 최소화하는 것입니다. 중요한 것은 이 연구에 사용된 알고리즘을 통해 기계 기반 입자 감지, 카이모그래프 생성 및 추적 분석이 가능하여 기존 방법에 비해 사람의 개입 필요성이 줄어든다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 소프트웨어 사용자는 결과를 평가하고 추적 및 감지 매개변수를 설정하여 거짓 긍정(예: 응집체 또는 노이즈)을 필터링해야 합니다. 이러한 수정은 각 사용자의 고유한 데이터 및 사용에 따라 경험적으로 조정되어야 합니다. 여기에...

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공개 사항

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저자 Hoyin Lai, Michael Jones, Hideki Sasaki, Luciano A.G. Lucas, Sam Alworth(전) 및 James Shih-Jong Lee는 이 프로토콜에 사용되는 소프트웨어를 생산하는 DRVision Technologies LLC의 직원입니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van Vactor 연구실과 DRVision의 동료들과 Max Heiman, Pascal Kaeser, David Pellman, Thomas Schwarz 박사에게 유익한 토론을 제공해 주신 것에 감사드립니다. elaV-Gal4를 아낌없이 제공해 주신 Melissa Rolls 박사님께 감사드립니다 . UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 및 221-Gal4; 본 연구에 사용된 UAS-EB1-GFP 주식. 광학 현미경에 대한 전문 지식을 제공해 주신 하버드 니콘 이미징 센터의 Jennifer Waters 박사와 Anna Jost 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 자금 지원을 받았습니다(F31 NS101756-03 - V.T.C., SBIR 1R43MH100780-01D - J.S.L.).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL microcentrifuge tubeEppendorf21008-959시료 전처리
1000 µ L TipOne 피펫 팁USA Scientific1111-2721시료 준비
200 &마이크로; L TipOne 피펫 팁USA Scientific1120-8710샘플 준비
221-Gal4 플라이블루밍턴 초파리 재고 센터 (US)26259초파리 유전학/십자가
60x 대물 렌즈NikonPlan Apo 60x 오일이미지 획득
6-웰 플레이트BD Falcon353224샘플 준비
AgarMoorAgar41084초파리 식품
AiviaDRVision LLC이 연구의 일환으로 최적화
됨 클로로포름(아밀렌으로 안정화)Sigma-AldrichC2432샘플 준비
CO2 블로우 건(십자가용 파리 선택용)Genesee54-104초파리 유전학/십자가
CO2 버블러(십자가용 파리 선택용)Genesee59-180초파리 유전학/십자가
냉각 CCD 카메라HamamatsuORCA-R2이미지 획득
옥수수 가루Genesee62-101초파리 식품
증류수초파리 식품
양면 테이프스카치샘플 준비
초파리 바이알Genesee32-109초파리 식품
Droso-plugs(폼 플러그 바이알의 경우)Genesee59-200초파리 식품
Dumont #5 Biologie Inox 겸자Fine Science Tools11252-20샘플 준비
elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 파리멜리사 롤스의 선물 (펜실베니아 주립 대학)N / A초파리 유전학 / 십자가
에탄올 (95 %)VWR75811-022초파리 식품
실체 현미경 용 광섬유 조명기 / 광원NikonNI-150샘플 준비
Flypad (십자가 용 파리 선택 용)Genesee59-172초파리 유전학 / 십자가
Forma Environmental Chamber/IncubatorThermoFisher3940Drosophila Genetics/crosses
Halocarbon oil 700Sigma-AldrichH8898Sample preparation
Immersion OilNikonMXA22168Image acquisition
Kimwipe Delicate WipesFisherScientific 34120Sample preparation
Laser Merge ModuleSpectral 응용 연구LMM-5이미지 획득
컨포칼루멘 코르용 광원 SOLA 54-10021이미지 획득
MetaMorph 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어분자 장치이미지 획득
마이크로 커버 안경, 사각형, No. 1 1/2 (#1.5)VWR48366-205샘플 준비
퍼펙트 포커스 시스템이 있는 전동 도립 현미경NikonTI-ND6-PFS-S이미지 획득
전동 스테이지 및 셔터이전Proscan III이미지 획득
다목적 가위스카치MMM1428샘플 준비
, 매니큐어Sally Hansen784179032016 074170382839샘플 준비
광학 필터, ChromaET480/40m, 이미지 획득
P1000, PipetmanGilsonF123602샘플 준비
P200, PipetmanGilsonF123601샘플 준비
PBS (10X) ph 7.4ThermoFisher70011044시료 준비
프로피온산FisherA258-500초파리 식품
회전 디스크 컨포칼 스캐너 장치YokagawaCSU-X1이미지 수집
실체 현미경NikonSMZ800N샘플 준비
설탕 (설탕)Genesee62-112초파리 식품
Superfrost SlideVWR48311-600샘플 준비
TegoseptGenesee20-258초파리
식품 UAS-dtacc-RNAi 파리비엔나 초파리 자원 센터 (오스트리아 비엔나)VDRC-101439초파리 유전학/십자가
바셀린 바셀린 바셀린 WBMasonDVOCB311003샘플 준비
윈저 & 뉴턴 브러쉬 리젠시 골드 520, 크기 0스테이플5012000초파리 유전학/교배
효모VWR토룰라 효모 IC90308580초파리 식품
요코가와 이색성 빔 스플리터SemrockDi01-T405/488/568/647-13x15x0.5이미지 획득
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참고문헌

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