음향 분리기사용 CHO 수확세포 배양액의 1차 해명

분비 치료 단백질을 포함하는 바이오 제조 공정에서 중요한 단계는 수확 된 세포 배양액 (HCCF)에서 바이오 매스를 제거하는 것입니다. 전통적으로, 바이오 제조업체는 단일 클론 항체^1의생산에 있는 그들의 1 차적인 해명 방법으로 심층 여과 다음 원심 여과를 채택했습니다. 그러나, 원심 분리는 세포에 높은 전단 응력으로 이끌어 낼 수 있습니다, HCCF에 있는 증가한 세포 파편의 결과로. 이것은 잠재적으로 여과 도중 필터 파울로 이끌어 내고 그 후에 다운스트림 크로마토그래피효율^1,2,3을감소시킬 수 있는 추가 오염물질 후 여과귀 귀착될 수 있습니다. 또한 특정 공정에 대한 원심분리기의 사용자 지정비용이 많이 들 수 있으며 확장성을 제한하는 요인이 될 수 있는 클린-인-플레이스 시스템과 살균 시스템에 추가 연결이 필요할 수 있습니다. 깊이 필터를 사용하면 원심 분리의 한계를 보완하고 일회용 기술^4를활용할 수 있습니다. 그러나 깊이 필터는 주로 높은 세포 배양 밀도^5를견딜 수 없기 때문에 이차 설명으로 사용됩니다. 대안적으로, 접선 유량 여과(TFF) 세포 보존 장치는 전단 응을 완화하기 위해 사용되었지만 막 편광 및 가난한 수확 수율^6과같은 어려움을 겪을 수 있다. 원심 분리 및 깊이 여과 또는 TFF의 사용으로 인해 발생하는 위의 문제는 HCCF의 1 차 설명 프로세스를 개선할 수있는 기회를 만듭니다.

음향 분리는 고품질 단백질 제품^7,8을사용하여 세포 배양으로부터 분비된 단백질을 수확하는 데 활용할 수 있는 기술로 도입되었다. 음향 분리는 중단된 유체와 상호 작용하는 다차원 서파의 전파 및 반사를 통해 달성되고^{입자를 유지한 입자 9,10.} 이 입자는 유체 드래그, 중력 및 음향 방사선의 세 가지 힘을 경험합니다. 각 힘이 동등하게 서로 반대하여 평형에 도달하면 입자가 일시 중단되어 초음파^서파(10)내에 갇혀 있습니다. 세포 배양 현탁액에서, 세포는 서 있는 파의 이 압력 노드 평면 내에서 유지되고, 노드는 세포가 합쳐짐에 따라 증가하고, 결국 이러한 세포 노드 클러스터는 중력력^9에서떨어진다. 이러한 퇴적된 세포는 매체에서 제거되어 명확히 된 매체를 펌핑하여 추가 다운스트림 처리를 위해 펌핑할 수 있습니다. 분리 방법으로 초음파의 활용은 지질 입자와^{적혈구(11)의} 분리에서 포유류 관류 세포 배양에 이르는 생물학적 응용 분야로 변환하기^{시작했다.} 원심분리, 깊이 여과 또는 TFF를 피함으로써 비용, 인건비 및 세포 스트레스를 줄이는 상대적인 기능을 갖춘 바이오 제조업체는 음향 분리를 사용하는 잠재적 인 응용 프로그램을 모색하고 있습니다.

이 연구는 CHO 세포 배양을 명확히 하기 위한 벤치탑 음향 파 분리기(AWS)를 운영하기 위한 일반적인 프로토콜을 제공하고, 대표 데이터를 제공하며, 효과적인 세포 설명 및 제품 회수를 달성하는 방법을 보여줍니다.

1. AWS 준비

참고: 이 프로토콜은 하나의 축전 챔버를 사용하여 개발되었습니다. 그러나 벤치 스케일 AWS에는 필요한 경우 4개의 식도 챔버를 연속으로 작동할 수 있는 5개의 탁도 프로브가 있습니다.

1. 탁도 케이블을 F, 1, 2, 3, 4(예: 도 2a의 도 1c 및 포트 1의 탁도 프로브 1) 및 챔버 전원 BNC 케이블을 1, 2, 3, 4(그림2b)로표시된 AWS 시스템의 뒷면에 연결합니다.
   참고: 챔버 전원 BNC케이블(도 3c)의다른 쪽 끝을 아쿠스토포레틱 챔버(도3d)의뒷면에 챔버가 유체로 채워질 때 2.6단계까지 연결하지 마십시오. 챔버 전원이 챔버에 유체없이 켜져 있으면 챔버의 압압 트랜스듀서가 손상되고 더 이상 작동하지 않습니다.
2. 탁도 프로브를 탁도 미터 및 온도계 하우징에 삽입하고 나사를 조입니다(도1c 및 도 3).
3. 피드 튜빙을 피드 펌프(도 1b ~1c)를통해 사료탁도 포트(도4a)의입력에 연결합니다.
4. 사료 탁도포트(도 4b)의출력에서 y-튜브를 축전챔버(도 4c)의입구 포트에 연결한다.
5. 단계1 펌프를 통해 수선체(도4d)의폐포트에서 1단계 튜브를 세포 수거용기(도1d~1f)에연결한다.
6. 유상증실(도4e)의침투포트로부터 튜브를 프로브1 탁도 포트(도4f)의입력에 연결한다.
7. 프로브1 탁도포트(도 4g)에서상품 수집 용기(도1c ~ 1g)에수확 튜브를 연결합니다.

2. HCCF로 시스템을 프라임

참고: 본 프로토콜은 화학적으로 정의된 배지(액티초 P+6m L-글루타민)를 사용하여 개발되었으며, 모델 IgG1 단클론 항체 VRC01^13을 생산하고 다른 세포주 및 제품에 맞게 조정해야 할 수도 있다. 이 프로토콜에 사용된 HCCF는 흔들리는 플라스크 또는 생물 반응기 공정에서 CHO-K1 배양의 7-8 일 말에 얻어졌다.

1. AWS의 뒷면과 전면에 있는 전원 스위치를 켜서 AWS를 켭니다.
2. 컴퓨터를 켜고 관련 소프트웨어의 책상 아이콘을 두 번 클릭합니다(재료 표참조). "판독"패널에서"시작 테스트"버튼을 눌러 데이터 기록을 시작합니다(그림5). 데이터 기록이 시작되면 수집된 모든 데이터가 테스트가 중지될 때까지 내보낼 수 있는 스프레드시트에 기록됩니다.
3. 이송 튜브 끝을 교반되는 HCCF 용기에 연결합니다.
4. "피드펌프 이미지"내의"컨트롤"화면의 펌프 속도를 입력하여 피드 펌프를 시작하고 키보드에서"Enter"를 누릅니다. "펌프방향 화살표 아이콘"(시계 방향 또는 시계 반대 방향)가 용기에서 혈관에서 수선 챔버로 HCCF를 펌핑하기 위해 피드 펌프 이미지의 오른쪽에 있는 회색 상자에 올바르게 선택되었는지 확인합니다. "시작"펌프(그림 6a)에피드 펌프 이미지 아래 회색 상자 내에서"켜기"라는단어 옆에있는"삼각형 아이콘"을클릭합니다.
   참고: 최대 펌프 속도는 10 L/h(167mL/min)이지만, 명목 유량인 60mL/min은 분리를 시작하기 전에 챔버를 과충할 위험이 없이 빠르게 튜브및 챔버를 채우기 위해 이 단계에 사용하는 것이 좋습니다.
5. 수선식 챔버를 채우는 동안"백분율 감소패널"(도5c)을관찰하여 공급 탁도 측정을 모니터링합니다. HCCF가 HCCF 용기에서 충분히 혼합되는 경우 챔버의 적재 중에 탁도 값은 일관되게 유지됩니다.
6. 액체가 유상증식 챔버 뒤쪽의 압착기 위에 있으면 피드 펌프 이미지 아래의 회색 상자 내에서"끄기"를눌러 펌프를 중지합니다. BNC 전원케이블(도 3c)을축전 챔버(도3d)에 연결합니다.
   참고: 각 축축수 챔버의 홀드업 부피는 약 190mL입니다.

3. AWS 운영

1. 식수절 챔버가 채워지고 BNC 전원 케이블이 구균식 챔버의 뒷면에 연결되면 피드 펌프의 속도를 원하는 작동속도(도6a 및 표 1)로변경합니다. 지정된 프로세스에 이상적인 작동 파라미터를 식별하기 위해 여러 피드 펌프 속도를 테스트해야 합니다.
2. 파워 모듈의 막대를 10W(도6d)로슬라이딩하고 스테이지 1 박스(그림6c)의오른쪽에 있는"켜기"아이콘을 눌러 스테이지1 압조 파워를 켭니다. 제조업체에서 제안한 대로 CHO 셀에 권장되는 전원 설정인 10W를 사용하십시오. 이렇게 하면 작동을 위해 2MHz의 고정 주파수가 생성됩니다. 몇 초 후, 세포는 수선화 챔버(도 7a)에서파도 노드에서 눈에 띄게 덩어리가 시작됩니다.
3. 세포가 축축챔버(도7b)의바닥에 정착하기 시작하면, 세포 밀도 및 공급 펌프 속도에 따라 적절한 속도로 stage1 펌프를시작합니다(도 6b). 제조업체의 최적화 및 정상 상태 작동 스프레드시트에 기초하여, stage1 펌프 속도는 다음 방정식을 사용하여 포장된 셀 질량 및 공급 유량에 따라 계산될 수 있습니다.
   
   1. 포장 된 셀 질량을 계산하려면 빈 15 mL 튜브 (또는 원심 분리와 호환되는 다른 튜브)로 스케일을 타십시오. 튜브를 피드 재료로 채우고 튜브의 총 중량을 피드로 기록합니다. 3,700 x g에서10 분 동안 튜브원심분리하십시오. 상체를 별도의 용기에 넣습니다. 세포 펠릿으로 튜브의 무게를 측정합니다. 사료 재료의 포장 된 세포 질량 비율 = (탈캔화 튜브 무게 / 채워진 튜브 무게) x 100 %.
4. 혼수상 챔버로부터의 오버플로가 탁도 프로브1(도8)에진입함에 따라 스테이지1 탁도의 탁도 프로파일을 모니터링한다.
5. 세포 분리가 계속됨에 따라 세포 제거 효율이 증가합니다.
6. 또한, 세포 분리가 계속됨에 따라 사료와 스테이지1 간의 온도 차이를 모니터링한다(도9). 높은 세포 밀도 공급이 사용될 때 온도가 상승할 수 있지만 일반적으로 공급 유량을 변경하여 감소될 수 있다.
   참고: 여러 개의 혼수식 챔버를 사용하는 경우, 탁도 프로브를 통해 이전 식수전성 챔버에서 튜브를 현재 의 혼수식 챔버의 입력에 순차적으로 연결할 수 있습니다. 또한, 단계 펌프를 통해 수선식 챔버의 바닥에서 부터 세포 수집 용기에 스테이지 튜브를 연결할 수 있다. 필요한 경우 최적의 세포 제거 효율을 위해 총 4개의 식수성 챔버를 연이어 연결할 수 있습니다.

4. AWS 종료

1. 런이 끝나면 피드 펌프 아래의 회색 상자 내에서 끄기와 stage1 펌프 이미지를 각각 눌러 펌프를 중지하여 펌프를 중지합니다.
2. 스테이지 1 박스의 오른쪽에 전원을 끄고 BNC 전원 케이블을 분리하여 챔버에 전원을 끕니다.
3. 깊이 여과 및 크로마토그래피 방법과 같은 추가 설명 및 정화 절차를 위해 수집 된 제품 수확 재료를 가져 가라. 셀 수확 재료를 폐기하십시오.
4. 폐튜브를 빈 용기에 넣고, 관도를 분리하고 포트에 침투하고 펌프 헤드에서 폐튜브를 방출하여 유수방의 나머지 유체를 배출합니다.
5. 튜브를 다시 연결하고, 폐튜브를 펌프 헤드에 다시 넣고, 60mL/min의 급식 펌프 속도와 60mL/분의 스테이지1 펌프 속도를 사용하여 사료 튜브 의 끝에서 DI 물을 통해 흐르고 있습니다. 15-20분 동안 계속하십시오. 흐름을 폐기합니다.
6. 15-20 분 동안 피드 펌프를 사용하여 튜브 및 챔버를 통해 70 % 이소 프로필 알코올 (IPA)을 펌프합니다. 흐름을 폐기합니다.
7. 15-20 분 동안 피드 펌프를 사용하여 튜브와 챔버를 지우기 위해 DI 물로 세척 절차를 반복하십시오. 흐름을 폐기합니다.
8. 탁도 프로브와 구균 챔버에서 튜브를 분해하고 70 %의 IPA로 영역을 청소하십시오.
9. 탁도 프로브를 분해하고 70%의 IPA로 탁도 프로브 내부를 청소합니다. 모든 부품을 건조하게 한 다음 다음 사용을 위해 다시 조립하십시오.
   참고: 식증 챔버는 일회용으로 제조되지만 이 프로토콜에 설명된 대로 올바르게 처리및 세척하면 재사용할 수 있습니다.

프로토콜에 설명된 바와 같이, AWS는 그림 1에도시된 바와 같이 12.4 x 106 셀/mL의 밀도로 HCCF를 명확히 하는 데 사용되었습니다. 상기 사료 펌프는 3.5mL/min(5L/day)으로 설정되어, 10-20 L 배양에 적합한 범위 내에서 세포 출혈 속도를 나타내었다. HCCF가 AWS 챔버에 진입함에 따라 피드 탁도 프로브의 탁도 측정은 일관된 상태로 유지되었으며, 약 1,000-1,100 NTU, 프로브1 탁도 프로브의 측정은 NTU 40-50 NTU(그림8)에남아 있었습니다. 두 가지 측정을 사용하여 세포 제거 효율

계산및 평균 95%. 40-50 NTU의 탁도 측정은 달성 가능한 최소 탁도 수준이었기 때문에 시리즈의 추가 AWS 챔버에서 더 이상 분리할 수 없는 것으로 나타났습니다.

AWS는 낮은 유량으로 고효율로 분리할 수 있지만, HCCF를 챔버 내에서 더 오랜 시간 동안 유지하면 온도가 상승하여 낮은 유량을 선택할 때 고려해야 합니다. 도 9는 3.5mL/분의 공급 유속에서 수습 챔버및 음향 분리 후 HCCF의 온도 차이의 예이며, 이는 음향 챔버 내에서 장기간에 의한 온도의 >6°C 증가를 나타냈다.

높은 세포 밀도 수확 (즉, >20 x 106 세포/mL)을 실행할 때 또 다른 중요한 고려 사항은 탁도 프로브의 포화입니다. 사료 탁도 프로브에 대한 탁도 측정은 4,400NTU(도10)를통해 포화되어 세포 제거 효율 계산에서 과소 평가될 수 있다.

세포 설명에 대한 상이한 사료 속도의 효과를 테스트하기 위해 세포 제거 효율은 상이한 이송 속도로 측정되었습니다. 도 11에도시된 바와 같이, 사료 펌프 속도가 증가함에 따라 세포 제거 효율이 ~100%에서 57%로 크게 감소하였다. 일반적으로, 공급 펌프 속도가 느려질수록 세포 설명이 더 좋습니다. 그러나 각 응용 프로그램에 대해 피드 속도를 최적화하는 것이 좋습니다.

그림 1: AWS 설정. 펌프가소프트웨어(a)로켜지면 HCCF는 피드 튜탁프로브(c)를통해 피드펌프(b)를통해 서투하여 AWS챔버(d)로채널화하였다. 챔버 내부, 음향 힘은 파도의 노드의 흐름에서 세포를 갇혀 응집발생. 부력 감소로 세포는 중력을 통해 떨어지게 하고, 세포는 1단계펌프(e)를통해 세포 수확병(f)을 통해 아쿠스토포레틱 챔버의 폐포트에서 제거되었고, 명확한 물질은 챔버의 침투포트를 통해 프로브1 탁도 프로브(c)로 빠져나와 제품 수확병(g)으로 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: AWS 시스템 뒤로. 탁도 프로브와 챔버는 탁도 프로브이더넷(a)및 챔버 전원 BNC(b) 케이블을 통해AWS 시스템 뒷면의 각 포트에 연결됩니다. 또한 컴퓨터는 PC 이더넷케이블(c)을통해 연결됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 탁도 프로브 및 하우징. 각 탁도프로브(a)는각각의 탁도 계수 및 온도계 하우징(b)에 적절히 삽입되고 나사로 조여져야 한다. 챔버 전원 BNC 케이블(c)은챔버내의 압제 트랜스듀서가 유체로 채워진 후에만 수선식 챔버(d)의뒷면에 연결되어야합니다. 프로브는 다음과 같이 표시됩니다 : F = 피드 탁도, 1 = 프로브1 탁도, 2, 3 및 4는 사용되지 않는 프로브 (또는 절차를 직렬화하는 데 사용할 수 있음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 탁도 하우징과 축전 챔버 사이의 연결. 피드 튜브는 피드 펌프를 통해 사료 탁도포트(a)의입력에 연결됩니다. 사료 탁도포트(b)의출력은 y-튜브를 통해 유상증실(c)의입구 포트에 연결된다. stage1 튜브는 단계1 펌프를 통해 수거 용기에 대한 수중식챔버(d)의폐기물 포트에서 연결된다. 축축챔버(e)의 침투포트는 프로브1 탁도 포트(f)의 입력에 연결된다. 수확 튜브는 프로브1 탁도 포트(g)에서 제품 수집 용기로 연결됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 음향 분리기 소프트웨어의 판독 패널입니다. 이 프로그램에는"판독"및"컨트롤"이라는두 개의 패널이 있습니다. "판독"패널 내에서, 탁도(a),온도(b),및 백분율감소(c)가모니터링된다. 데이터 녹화를 시작하려면"시작 테스트"버튼(d)을클릭해야 하며 버튼의 색상을 녹색으로 변경합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 프로그램의 패널을 제어합니다. "컨트롤"패널 내에서 펌프를 켜거나 끌 수 있으며, 펌핑 속도를사료(a)및 기타단계(b)에대해 변경할 수 있다. 또한, 압전 트랜스듀서의 챔버 전원을 켜거나 끌 수있으며(c)슬라이드바(d)로변경할 수 있다. 이 실험은 제조업체에서 권장하는 CHO 셀에 권장되는 전원 설정이기 때문에 10W를 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: AWS 챔버. 세포가 챔버 내부에 들어가면 음향 력은 파도 노드에 세포를 갇혀 세포가 클러스터 (a)를 발생시켰습니다. 이 세포 클러스터는 부력을 잃고 결국 중력에 의해 정착 될 때까지 크기가 증가 (b). 다음으로, 정착된 세포는 1단계 펌프를 통해 수선식 챔버의 폐포트에서 세포 수확병(c)으로 제거되었다. 제품은 침투 포트 (d)를 통해 챔버를 빠져 나간 반면 HCCF는 입구 포트 (e)를 통해 챔버를 지속적으로 채웠다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 공급 펌프 비율이 3.5mL/min인 12 x 106 셀/mL CHO 세포 배양에 대한 탁도 측정. 사료 탁도(파란색)는 약 1,000NTU였고 스테이지 1 탁도미터(주황색)를 빠져나가는 침투는 40-60 NTU였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: 3.5mL/분의 이송 펌프 비율을 가진 12 x 106 셀/mL CHO 세포 배양에 대한 온도 측정. 사료 온도(blue)는 약 21°C였으며 스테이지 1 탁도미터(orange)를 빠져나가는 침투는 약 27°C였다.

도 10: 높은 세포 밀도 샘플에 대한 탁도 측정 예. 세포 밀도가 >20 x 106 셀/mL일 때, 사료 탁도 측정은 4,400 NTU의 최대 값으로 포화되어 세포 제거 효율을 과소평가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11: 세포 제거 효율 비교. 사료 속도가 증가함에 따라 세포 분리가 감소했습니다. 따라서 사료 속도가 증가함에 따라 세포 설명 효율이 감소했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 작동 조건. 유량, 압력 범위, 공급 유체 및 작동 온도를 위한 AWS 제조업체의 권장 작동 조건입니다.

저자는이 원고에 설명 된 제품에 재정적 인 이익이 없으며 공개 할 다른 것은 없습니다.