방법 논문

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

DOI:

10.3791/61166

⸱

2020년 5월 19일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

초록

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중추신경계(CNS)는 뇌와 척수로 구성되어 있으며 말초와 중추신경계 사이의 장벽 역할을 하는 막층인 수막으로 둘러싸여 있습니다. CNS는 면역학적으로 특화된 부위이며, 정상 상태 조건에서 면역 특권은 CNS 실질에서 가장 분명합니다. 대조적으로, 수막에는 선천성 및 적응 면역 세포를 포함한 다양한 상주 세포가 있습니다. CNS 손상, 자가면역, 감염 또는 신경변성에 의해 유발되는 염증 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 들어가 수막 내에 거주할 수 있습니다. 이 세포는 CNS 질병 발병 기간 동안 유익한 작용과 해로운 작용을 모두 수행하는 것으로 생각됩니다. 이러한 지식에도 불구하고, 수막은 종종 CNS 구획을 분석할 때 간과되는데, 이는 종래의 CNS 조직 추출 방법이 수막층을 생략하기 때문이다. 이 프로토콜은 단일 세포 기술, 면역조직화학 및 현장 혼성화 방법을 통한 다운스트림 분석에 적합한 쥐 CNS 조직(즉, 뇌, 척수 및 수막)의 신속한 분리를 위한 두 가지 고유한 방법을 제시합니다. 설명된 방법은 항상성 조건 및 질병 발병 기전 동안 CNS 구획을 차지하는 세포의 표현형, 기능 및 국소화를 평가하는 데 이상적인 CNS 조직의 포괄적인 분석을 제공합니다.

서론

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중추신경계(CNS)는 면역학적으로 특화된 부위입니다. 중추신경계 실질은 뇌척수액 공간, 수막 및 혈관계를 제외하고, 고전적으로 면역-특권 부위 1,2,3,4,5로 간주되며, 항상성 상태 동안 면역 세포가 상대적으로 없다 2,6,7. 대조적으로, 경막층, 거미층, 피아층으로 구성된 수막은 중추신경계 구획의 중요한 구성 요소로, 질병 발병기전동안 항상성 면역 감시 및 염증 과정에 적극적으로 참여합니다 3,6,7,8. 정상 상태 조건에서 수막은 선천성 림프 세포(ILC), 대식세포, 수지상 세포(DC), 비만 세포, T 세포 및 그보다 덜하지만 B 세포를 포함한 수많은 면역 감시 세포를 지원합니다 9,10,11.

수막은 고도로 혈관화된 구조이며 CNS와 그 주변 사이에 림프 연결을 제공하는 림프관을 포함합니다 8,12,13,14. CNS 손상, 감염, 자가면역 또는 신경변성에 의해 유발된 염증성 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 침투하여 수막 내의 면역 환경을 변경합니다. 세포 침윤 후, 수막은 말초 유래 면역 세포에 대한 기능적 틈새를 나타낼 수 있으며, 면역 세포 응집, 국소 면역 세포 활성화 및 CNS 구획에서의 장기 생존을 촉진할 수 있습니다. 두드러진 수막 염증은 다발성 경화증 (MS) 15,16,17,18,19, 뇌졸중 20,21, 무균 손상 22,23 (즉, 척수 손상 및 외상성 뇌 손상), 편두통 24 및 미생물 감염 25,26,27,28,29. 따라서, 수막 구획에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 특성화는 정상 상태 및 질병 발병 기전 동안 이러한 세포의 역할을 이해하는 데 필수적입니다.

두개골과 척추체에서 뇌, 척수 및 수막을 추출하는 것은 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 현재 세 개의 수막층이 모두 손상되지 않은 상태에서 뇌를 빠르게 추출할 수 있는 기술은 없습니다. 추궁 절제술은 우수한 척수 조직 형태를 산출하고 수막층을 보존하지만 시간이 많이 걸리고 복잡합니다30,31. 반대로, 두개골에서 뇌를 제거하고 척수를 수압 압출하는 것과 같은 보다 전통적인 추출 방법은 CNS 조직의 빠른 추출을 용이하게 하지만 이러한 기술로 거미주막과 경막 수막이 모두 손실됩니다(30,31). 뇌 및 척수 조직의 기존 분리 동안 경막 및 지주막 층의 누락은 CNS 구획 내의 세포에 대한 불완전한 분석을 초래합니다. 따라서 수막이 손상되지 않은 CNS 조직의 빠른 추출에 초점을 맞춘 새로운 기술의 식별은 CNS 구획의 최적 분석에 매우 중요합니다.

이 원고는 생쥐에서 뇌, 척수 및 수막을 신속하게 추출하는 두 가지 방법을 제시하여 CNS 실질 및 수막에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 다운스트림 분석을 용이하게 합니다. 이러한 최적화된 프로토콜은 1) 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 현탁액 분리 및 2) 조직학적 처리를 위한 조직 준비에 중점을 둡니다. 뇌, 척수 조직, 경막 및 지주막 수막(32)으로부터 단세포 현탁액을 얻는 것은 실질 및 수막 구획 둘 다에 상주하는 세포의 동시 분석을 가능하게 한다. 단일 세포 현탁액은 시험관 내 자극 33, 효소 결합 면역스팟(ELISpot)28,34,35, 유세포 분석(36,33) 및 단일 세포 37 또는 벌크 전사체학을 수행하기 위한 세포 배양 분석을 포함한 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있습니다. 또한, 두개골 또는 척추가 각각 손상되지 않은 전체 뇌 및 척수의 석회질 제거를 위해 최적화된 프로토콜은 주변 뼈의 부드러운 석회화를 허용하여 수막을 온전하게 유지하고 조직 형태를 보존합니다. 이 방법을 사용하면 실질 및 수막 공간 모두에서 면역조직화학(IHC) 또는 제자리 혼성화(ISH) 기술을 사용하여 단백질 또는 RNA를 선택적으로 식별할 수 있습니다. CNS 내에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 표현형, 활성화 상태 및 국소화의 특성화는 CNS 구획의 개별 세포 유형이 항상성 및 질병 발병기전에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 필수적인 정보를 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

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모든 동물 작업은 다트머스에 있는 Geisel School of Medicine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인한 프로토콜을 사용합니다.

1. 석회질 제거를 위한 뇌 및 척수 샘플 처리

  1. 뇌 및 척수 샘플 분리
    1. CO2 흡입을 통해 마우스를 안락사시킵니다. CO2 유량이 분당 케이지 부피의 10%–30%를 대체하는지 확인하십시오.
    2. 집게를 사용하여 검상돌기를 들어 올리고 흉곽 바로 아래 복벽을 가위로 옆으로 자르고 밑에 있는 혈관이나 기관이 절단되지 않도록 위로 당깁니다. 다이어프램을 측면으로 자릅니다.
    3. 쇄골까지 폐와 평행한 측면 가장자리를 따라 흉곽을 자릅니다. 집게를 사용하여 흉골을 들어 올리고 지혈제로 흉골을 고정하십시오. 지혈제를 머리 위에 올려 흉곽을 들어 올리고 심장을 노출시킵니다.
    4. 집게를 사용하여 심장의 정점 근처를 잡고 심장의 우심방을 절개하여 출구를 제공합니다. 10mL 주사기가 부착된 25G 바늘을 삽입하여 10mL의 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 좌심실에 천천히 투여하여 마우스를 심근으로 관류합니다.
      참고: 간에서 혈액이 제거될 때까지 4-5분에 걸쳐 관류가 이루어져야 합니다. 총 10mL의 1x PBS는 일반적으로 관류에 충분하지만 필요한 경우 더 많이 사용할 수 있습니다. 깨끗한 간은 일반적으로 적절한 관류를 나타냅니다.
    5. 날카로운 가위를 사용하여 목을 베어 머리를 제거하십시오 (그림 1, 1). 피부에 정중선을 절개하고(그림 1; 2) 피부를 눈 위로 뒤집어 두개골을 제거합니다.
    6. 두개골에서 하악을 분리하기 위해 비강 뼈를 자릅니다 (그림 1, 3). 하악골, 혀, 눈을 제거합니다. 두개골의 측면을 따라 절단하여 외이를 따라 조직을 분리합니다(그림 1; 4). 두개골을 덮고 있는 과도한 피부, 근육 및 조직을 모두 제거하기 위해 다듬습니다.
    7. 날카로운 가위로 척추와 평행하게 절단하여 흉곽을 척추에서 분리합니다(그림 1, 5 및 6). 척추를 분리하기 위해 요추 아래쪽 부위를 작게 절개합니다(그림 1, 7). 척추를 따라 남아 있는 근육을 다듬고 제거하여 척추를 노출시킵니다(그림 1; 8).
      알림: 고정성 파라포름알데히드(PFA) 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 석회질 제거 완충액의 적절한 침투를 얻으려면 척추와 두개골에서 과도한 조직을 제거하는 것이 필요합니다.
  2. 사후 고정, 석회화 제거 및 냉동 보존
    1. 겸자를 사용하여 두개골 또는 척추가 손상되지 않은 뇌를 15mL의 4% PFA가 들어 있는 4mL의 원추형 튜브에 넣습니다. 적절한 고정을 위해 튜브를 최소 48시간 동안 4°C에 두십시오.
      알림: 조직의 과도한 고정을 방지하려면 고정 시간이 72시간을 초과하지 마십시오. 석회질 제거 전에 뼈 표본에 대한 고정 시간이 연장됩니다. 적절한 고정은 석회질 제거의 영향으로부터 조직을 보호하고 더 나은 조직 형태를 보장합니다.
    2. 집게로 4% PFA에서 조직을 제거하고 1x PBS 10mL가 든 일회용 14mL 튜브에 5분 동안 조직을 넣어 뇌 또는 척수를 헹굽니다. 뇌 또는 척수를 10% EDTA 10mL(pH = 7.2–7.4)가 포함된 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
      알림: 10mL의 EDTA가 있는 더 큰 튜브를 사용하면 EDTA가 조직과 더 큰 접촉 면적을 확보하고 석회질 제거 과정을 가속화할 수 있습니다.
    3. 뼈가 부드럽고 유연한지 매일 확인하십시오 : 집게로 EDTA 용액에서 조직을 제거하고 페트리 접시에 놓고 25G 바늘로 뼈의 부드러움을 부드럽게 테스트하십시오. 바늘이 뼈를 쉽게 관통하면 석회질 제거 과정이 완료됩니다.
    4. EDTA 용액에서 조직을 제거하고 뇌 또는 척수를 1x PBS 10mL가 들어 있는 14mL 일회용 튜브로 옮기고 10분 동안 세척합니다. 세탁을 반복하십시오.
      알림: 석회질 제거는 일반적으로 2-3일이 걸립니다. 뼈가 아직 적절하게 석회질되지 않은 경우 2-3일마다 용액을 교체해야 합니다. 그러나 뼈가 석회질된 후 EDTA에서 장기간 배양하면 조직 형태가 손상될 수 있습니다.
    5. 1x PBS에 자당을 첨가하여 10%, 20% 및 30% 자당 용액을 준비합니다. 예를 들어, 10 % 자당의 경우, 10g의 자당을 첨가하고 멸균 된 1x PBS를 사용하여 부피를 100mL로 가져옵니다. 용액을 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
      알림: 자당 용액은 미생물이 성장하기 쉬우므로 samples는 이러한 용액에 장기간 보관해서는 안 됩니다.
    6. 1x PBS로부터 조직을 제거하고, 이를 10% 수크로오스 용액 10 mL에 넣고, 4°C에서 보관한다. 조직을 24시간 동안 또는 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 그대로 두십시오.
    7. 이 과정을 반복하여 조직을 먼저 20% 자당 용액으로 옮기고 마지막으로 30% 자당 용액으로 옮깁니다. 조직이 30% 자당(최소 24시간)에 가라앉도록 하고 조직 포매를 진행합니다.
  3. 조직 포매 및 동결
    1. 집게를 사용하여 30% 자당에서 조직을 제거하고 페트리 접시에 놓고 접시를 기울여 조직에 있는 과도한 자당 용액을 제거합니다. 메스를 사용하여 조직을 원하는 부분으로 자릅니다.
    2. 극저온 몰드의 바닥에 최적 절단 온도 (OCT) 화합물의 얇은 층을 만들고 조직 조각을 금형에 넣습니다. OCT 화합물로 조직을 완전히 덮어 기포가 없는지 확인합니다.
    3. 블록이 불투명해질 때까지 액체 질소(38 ) 위로 마우스를 가져가거나 블록을 100% 이소프로판올/드라이아이스 슬러리(39 )에 설정하여 블록을 급속 동결시킨다. 극저온 몰드를 알루미늄 호일로 감싸고 장기 보관을 위해 블록을 -80 °C에서 보관합니다. 절단하기 전에 블록을 -20°C로 이동합니다.
      참고: 석회질 제거된 뇌에 대해 조직학 프로토콜을 절개하고 수행할 때 절편을 대략적으로 다루면 두개골과 수막층이 손실될 수 있으므로 주의해야 합니다.

2. 유세포 염색을 위한 수막 및 CNS 조직의 제조

  1. 두개골 캡과 뇌 추출
    1. 날카로운 가위를 사용하여 목을 베어 머리를 제거하십시오 (그림 2A, 1). 가위를 사용하여 피부에 정중선을 절개하고(그림 2A; 2) 피부를 눈 위로 뒤집어 두개골을 제거합니다.
    2. 가위를 구멍 마그나 안에 놓고 피질을 따라 후각 구근을 향해 측면으로 두개골을 절단하기 시작하여 절개 부위를 외이도와 하악 위에 유지합니다(그림 2A, 3). 뇌에서 두개골 캡을 제거하기 위해 후각 구근에서 만나는 절단과 함께 반대쪽에서도 동일한 절단을 수행합니다(그림 2A; 3).
    3. 집게를 사용하여 두개골 캡을 벗기고 25mM HEPES가 보충된 5mL의 차가운 RPMI 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 두개골 캡을 넣습니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
    4. 구부러진 집게를 사용하여 집게를 뇌 기저부 아래에 놓고 들어 올려 두개골 캡에서 뇌를 제거합니다. 25mM HEPES가 보충된 5mL의 저온 RPMI가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 뇌를 넣습니다. 처리 될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
  2. 척추 및 척수 조직을 추출하는 단계
    1. 집게와 날카로운 가위를 사용하여 척추와 평행하게 절단하여 흉곽을 척추에서 분리합니다(그림 2A, 4 및 5). 척추를 분리하기 위해 요추 아래쪽 부위를 작게 절개합니다(그림 2A, 6). 척추를 따라 남아 있는 근육을 다듬고 제거하여 척추를 노출시킵니다(그림 2A, 7).
    2. 척추 안에 매우 미세한 수술용 가위를 놓고 기둥의 측면 가장자리를 따라 자릅니다(그림 2C). 반대쪽 측면 가장자리를 완전히 잘라 척추를 앞쪽과 뒤쪽으로 나눕니다.
      알림: 척수는 척추에 부착된 상태로 유지됩니다.
    3. 집게를 사용하여 척추에서 척수를 천천히 조심스럽게 떼어내고 25mM HEPES가 포함된 5mL의 차가운 RPMI가 들어 있는 15mL 원추형 튜브에 조직을 넣습니다. 척추의 앞쪽 및 뒤쪽 부분을 25mM HEPES가 있는 5mL의 차가운 RPMI가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  3. 수막을 제거하여 단세포 현탁액 준비
    1. 집게를 사용하여 RPMI 미디어에서 두개골 캡을 제거합니다. 날카로운 집게(#7 집게; 재료 표), 두개골 캡의 바깥쪽 가장자리(그림 2B)를 점포하고 두개골 캡 가장자리에서 수막을 떼어내고 긁어 경막 및 거미 수막을 제거합니다. 수막을 페트리 접시에 놓습니다.
      알림: 뇌와 척수에서 수막을 제거하려면 연습이 필요합니다. 사용자가 수막을 추출하는 데 어려움을 겪는 경우 해부 현미경을 사용하여 제거를 돕습니다.
    2. 튜브에서 척추를 제거하십시오. 날카로운 집게를 사용하여 척추 가장자리 주위를 점핑하여 수막을 풀고 구부러진 집게를 사용하여 척추 가장자리에서 수막을 벗겨냅니다. 수막을 페트리 접시에 놓습니다.
    3. 나일론 메쉬 스트레이너를 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 수막을 여과기로 옮기고 25mM HEPES가 보충된 RPMI 3mL를 추가합니다. 5mL 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 조직과 배지를 분쇄합니다.
    4. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 눈에 보이는 모든 조직이 스트레이너를 통과할 때까지 추가로 2-3mL의 RPMI/HEPES 배지로 스트레이너를 세척합니다.
      참고: 유세포 분석을 위한 적절한 세포 수를 얻으려면 여러 동물의 수막을 함께 풀링해야 할 수 있습니다. 이 실험(그림 3 및 그림 4)에서는 4-5마리의 마우스의 뇌와 척수 수막을 함께 풀링했습니다. 샘플이 풀링되면 조직의 과열을 방지하기 위해 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 조직을 분쇄하기 위해 추가 매체가 필요합니다.
    5. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포와 배지를 새로운 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 50mL 원뿔형 튜브를 5mL의 배지로 세척하여 남아 있는 세포를 수집합니다. 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다.
    6. 진공이 있는 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 피하기 위해 조심스럽게 상청액을 흡인하고 적절한 부피와 완충액에 세포를 재현탁합니다.
    7. 단일 세포 현탁액을 계산하려면 트리판 블루 배제 염료(1:10 희석) 및 RPMI를 사용하여 소량의 세포(즉, 5–10μL)를 희석합니다. 희석액 10μL를 혈구계에 추가합니다.
    8. 앞에서 설명한 대로 셀 수를 세고40,41, 정확도를 위해 최소 2개의 16 정사각형 그리드를 평균화합니다.
      참고: 그림 3에서, 예를 들어, 수막에서 풀링된 펠렛화된 세포를 다운스트림 표면 염색을 위해 250μL의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액(1% FBS가 포함된 1x PBS)에 재현탁했습니다. 계수를 위해 세포를 1:10으로 희석하였다(5 μL 세포, 5 μL 트립판 블루, 40 μL RPMI). 이 희석은 16개의 정사각형 그리드당 50-100개의 세포를 산출하여 세포가 너무 조밀하거나 겹치거나 너무 희박하지 않기 때문에 보다 정확한 세포 계수를 보장합니다. 마우스당 풀링된 뇌 및 척수 수막의 핵 세포 수는 다음과 같았다: 가짜 치료 마우스의 수막 = 100,000-150,000 세포 및 Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스 유발 탈수초성 질환(TMEV-IDD) 마우스의 수막 = 300,000-350,000 세포. 세포 수는 수집, 처리의 정밀도 및 수막 염증이 있는지 여부에 따라 달라집니다.
    9. FACS 표면(그림 3)14,36,42,43,44, 세포내 염색 프로토콜 33,45, 시험관 내 자극, 세포 배양 분석 33,46,47, ELISPOT 분석 28,34,35 및 벌크 또는 단일 세포와 같은 원하는 단일 세포 기술로 진행합니다 전사체학 37,48.
      알림: 처리 단계 사이에 모든 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  4. 뇌 및 척수 조직의 단세포 현탁액 준비
    1. 튜브에서 조직과 배지를 부어 미디어가 있는 뇌 또는 척수 조직을 100mm 페트리 접시 상단으로 옮깁니다. 집게를 사용하여 티슈를 페트리 접시의 바닥으로 옮깁니다. 멸균 면도날로 뇌 또는 척수를 잘게 다듬습니다. 면도날을 이용하여 다진 티슈를 긁어 접시 바닥으로 옮겨 티슈를 모은다.
      참고: 아래 효소 소화 프로토콜의 경우 처리를 위해 최대 2개의 척수를 함께 모을 수 있습니다. 두뇌는 개별적으로 처리되어야 합니다.
    2. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 RPMI 3mL를 페트리 접시에 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 피펫을 사용하여 조직을 배지에 재현탁하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
      참고: 다운스트림 응용 프로그램이 단일 세포 또는 벌크 RNA 시퀀싱 분석 또는 세포 배양인 경우 분석 전에 세포가 활성화되지 않도록 FCS 로트를 테스트해야 합니다. 대안적으로, 세포는 10% FCS를 갖는 RPMI 대신에 0.04% BSA를 갖는 1x PBS를 사용하여 처리될 수 있다.
    3. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 페트리 접시를 추가 2mL의 배지로 세척하여 잔류 조직을 수집하고 총 부피 5mL의 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 처리 단계 사이에 튜브를 얼음 위에 두십시오.
    4. 피펫을 사용하여 콜라게나제 I 분말을 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 배지에 재현탁하여 원하는 농도(즉, 100mg/mL)를 얻습니다. 다진 조직 샘플이 들어 있는 원뿔형 튜브에 콜라게나제 유형 I을 추가하여 원하는 최종 농도(즉, 1mg/mL의 경우 50μL)를 얻습니다.
      참고: 콜라게나제의 농도가 높을수록 세포 수율이 증가하지만 세포 표면 마커가 절단될 수 있습니다. 따라서 콜라게나제 I 로트를 적정하여 필요한 모든 세포 표면 마커가 손상되지 않은 상태에서 가장 많은 수의 생존 세포를 얻는 데 필요한 최적 농도를 결정해야 합니다. 예를 들어, 콜라게나제 I은 단일 뇌 또는 척수 샘플에서 0.5mg/mL, 1mg/mL 및 2mg/mL의 최종 농도로 테스트되었습니다. 세포 생존율은 트립판 블루 배제 방법을 사용하여 결정되었고, 세포 표면 마커 CD45, CD19 및 CD4는 유세포 분석에 의해 평가되었다. 1mg/mL 농도의 콜라게나제 I은 관심 있는 모든 세포 표면 마커를 유지하면서 가장 높은 생세포 수를 산출했습니다. 따라서, 이 농도는 이들 세포 유형을 조사하는 추가 실험에 사용되었다.
    5. 0.15M 염화나트륨을 사용하여 DNase I 분말을 원하는 스톡 농도로 부드럽게 재현탁합니다. 다진 조직 샘플이 들어 있는 원뿔형 튜브에 재현탁된 DNase I을 추가하여 20U/mL의 최종 농도를 얻습니다.
      참고: DNase I 로트는 mL당 활성 단위에 따라 다릅니다. 조직 샘플에 첨가되는 농도는 밀리리터당 스톡 바이알의 활성 단위에 따라 변경됩니다. 샘플당 최종 원하는 농도는 20U/mL입니다.
    6. 튜브를 37°C 수조의 튜브 랙에 넣고 40분 동안 배양합니다. 15분마다 튜브를 뒤집어 조직과 효소를 완전히 혼합합니다. 인큐베이션 후, 0.01 M EDTA의 최종 농도를 위해 0.1 M EDTA (pH = 7.2)의 500 μL를 각 튜브에 첨가하고 콜라게나제를 비활성화하기 위해 추가로 5 분 동안 인큐베이션한다.
    7. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 10% FCS가 보충된 RPMI 9mL를 각 튜브에 추가하여 각 튜브의 부피를 ~14.5mL로 만듭니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 로 원심분리합니다. 진공 상태에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 펠릿에 닿지 않도록 주의하면서 상층액을 흡인합니다.
    8. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 3mL의 100% 스톡 등장 밀도 구배 용액을 세포 펠릿이 들어 있는 튜브에 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 RPMI 10% FCS 배지를 추가하여 최종 부피를 10mL로 만들고 세포 펠릿을 재현탁하여 30% 스톡 등장 밀도 구배 용액 층을 만듭니다.
      참고: 100% 스톡 등장성 밀도 구배 배지를 미리 준비하고 분취한 다음 최대 4개월 동안 3°C에서 보관합니다. 100% 스톡 등장성 밀도 구배 용액을 제조하기 위해, 밀도 구배 매질(Table of Materials)을 밀도 구배 매질 희석 완충액으로 희석한다. 밀도 구배 배지 희석 완충액(80.0g/L NaCl, 3.0g/L KCl, 0.73g/L Na2HP0 4, 0.20g/L KH2HP04, 20.0g/L 포도당)을 준비하고 진공 필터 시스템을 사용하여 필터 멸균합니다. 밀도 구배 희석 완충액의 1부와 밀도 구배 배지의 100부를 혼합하여 9% 스톡 등장성 밀도 구배 용액을 만듭니다. 잘 섞다.
    9. 70% 스톡 등장 밀도 구배 용액 언더레이를 추가하기 전에 각 튜브를 잘 뒤집고 혼합합니다. 70% 스톡 등장 밀도 구배 용액 1mL가 들어 있는 혈청학적 피펫 1mL를 튜브 바닥에 삽입합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하면서 용액 1mL를 천천히 밑에 깔아줍니다. 튜브에서 혈청 피펫을 천천히 제거하고 그라디언트를 방해하지 않도록주의하십시오.
      참고: 70% 언더레이의 경우 RPMI 배지를 사용하여 100% 스톡 등장 밀도 구배 용액을 70%로 희석해야 합니다(즉, 100% 스톡 등장 밀도 구배 용액 7mL와 RPMI 배지 3mL가 잘 혼합됨). 또한 깨끗하고 방해받지 않는 70% 언더레이를 생성하는 것은 미엘린 잔해물을 제거하고 원심분리 후 그래디언트 계면에서 순수한 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필수적입니다.
    10. 브레이크 없이 4°C에서 30분 동안 800 x g 의 원심분리기. 세포층을 방해하지 않도록 주의하면서 2-3mL가 튜브에 남을 때까지 미엘린 파편 층을 포함한 상층액을 흡인합니다. 1mL 피펫을 사용하여 30/70% 밀도 구배 사이의 세포층을 수확하고 새로운 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
    11. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 RPMI 10% FCS 배지를 추가하여 최종 부피를 15mL로 만듭니다. 4 °C에서 5분 동안 450 x g 의 원심분리기.
      알림: 이 단계에서 필요한 경우 두 튜브의 셀 레이어를 풀링할 수 있습니다. 두 개 이상의 튜브를 풀링하지 마십시오 또는 고밀도 구배 배지 농도로 인해 세포가 펠릿화되지 않습니다.
    12. 세포 펠릿을 방해하지 않도록 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산하기 위해 적절한 부피/완충액에 세포를 재현탁합니다(예: 다운스트림 표면 염색을 위해 250μL의 FACS 완충액에 단일 척수를 재현탁)(그림 3).
    13. 1mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 필터 탑 튜브(재료 표)의 상단으로 옮기고 세포가 튜브의 하단으로 여과되도록 하여 남아 있는 미엘린 파편을 제거합니다.
    14. 트리판 블루 배제 염료를 사용하여 정확도40,41을 위해 최소 2개의 16 정사각형 그리드를 평균화하여 혈구계에서 세포를 희석하고 계수합니다.
    15. 원하는 단일 세포 분석 기법을 진행합니다.
      참고: 다양한 형태의 콜라게나제(즉, D형, I형, II형, IV형)를 사용하여 면역 세포, 미세아교세포(그림 3), 성상교세포, 혈관주위세포, 내피 세포(49) 및 뉴런(50 )을 모두 효율적으로 분리할 수 있습니다. 결과에 대해 얻은 핵 세포 수는 적정 된 콜라게나제 I 효소를 사용하여 다음과 같았다 : 전체 가짜 처리 된 뇌 = 500,000-600,000 세포; 전체 TMEV-IDD 뇌 = 800,000-1,000,000 세포; 전체 가짜 치료 척수 = 150,000-200,000 세포; 전체 TMEV-IDD 척수 = 300,000–400,000. 세포 수는 수집, 처리의 정밀도 및 CNS 염증이 존재하는지 여부에 따라 달라집니다.

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결과

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이 대표적인 실험은 B 및 T 세포를 정량화하고 항상성 상태뿐만 아니라 쥐 진행성 MS 모델(즉, TMEV-IDD)에서 수막 및 실질 CNS 구획에서 B 및 T 세포 국소화를 설명하는 것을 목표로 했습니다. TMEV-IDD는 앞서 기술된 바와 같이 TMEV BeAn의 5 x 106 플라크 형성 단위 (PFU)에 의한 두개내 감염에 의해 5주령 암컷 SJL 마우스에서 유도되었다(29).

본 연구는 감염 후 120일째에 만성 TMEV-IDD 동안 수막, 뇌 및 척수의 B 및 T 세포를 평가했습니다. 연령 일치 가짜 처리 마우스를 대조군으로 사용했습니다. 이 연구는 두 가지 실험으로 구성되었습니다. 첫 번째는 세포 표면 및/또는 세포내 항원(n = 4 가짜 처리, n = 5 TMEV-IDD)을 평가하여 세포 구성을 분석하고 정량화하는 잘 확립된 기술인 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 얻는 데 중점을 두었습니다. 두 ...

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토론

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항상성 및 질환 동안 CNS 구획 내의 세포 조성을 평가하기 위한 방법은 CNS의 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는데 필수적이다. 그러나 CNS에서 중요한 장벽 역할을 하고 다양한 면역 세포를 수용함에도 불구하고 뇌와 척수에 대한 기존의 많은 조직 추출 방법이 이러한 막의 수집을 허용하지 않기 때문에 수막은 종종 분석에서 생략됩니다. 이러한 누락은 수막의 세포 구성과 기능, 정상 상태 및 염증 상태에서의 역할에 대한 이해를 높이는 데 중요한 한계입니다. 최근 연구에 따르면 수막 구획에 상주하는 상주 및 말초 유래 면역 세포는 모두 CNS의 항상성을 유지하고 CNS 질병 발병을 유도하는 데 필수적인 역할을 합니다. 이 연구는 실질 구획뿐만 아니라 주변 수막층을 분석 할 필요성을 강조합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 수막을 보존하면서 뇌와 척수를 신속하게 분리할 수 있도록 하여 궁극적으로 조직학적 연구와 단일 세포 연구를 모두 활용하여 CNS 구획의 포괄적인 다운스트림 분석을 가능하게 합니다. 대표적인 결과는 CNS 구획의 면역...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자들은 다트머스 (Dartmouth)의 비교 의학 및 연구 센터 (CCMR) 직원들에게이 연구에 사용 된 마우스에 대한 전문적인 관리에 감사드립니다. Bornstein Research Fund가이 연구에 자금을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알루미늄 호일N/A
소 혈청 알부민ThermoFisher Scientific37002D
원심분리기Beckman CoulterAllegra X-12R 원심분리기
콜라겐분해효소 IWorthingtonLS004196
원뿔형 튜브, 15mLVWR525-1069
원뿔형 튜브, 50mLVWR89039-658
커버 유리Hauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
곡선 집게Fine Science Tools11003-14
일회용 폴리스티렌 튜브, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
일회용 메스Fisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
드라이 아이스에어 가스N / A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA 디 소듐 염 이수화물 Amresco0105-500g
에탄올, 100 %없음 / A
태아 소 혈청 (FBS)HycloneSH30910.03
필터 상단 튜브, 5 mLVWR352235
정착 가능한 생존력 염색 780Becton Dickinson565388
유세포 분석기Beckman CoulterGallios
GlucoseFisher ChemicalD16-500
염소 항-마우스 IgG (488 접합체)Jackson immunoresearch115-546-146
염소 항-마우스 IgG (594 conjugate)Jackson immunoresearch115-586-146
Goat anti-rabbit 488Jackson immunoresearch111-545-144
Goat anti-rat 594Jackson immunoresearch112-585-167
Goat anti-rat 650Jackson immunoresearch112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HemacometerAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemicalBP366-500
KH2PO4 (무수)Sigma AldrichP5655-100G
액체 질소에어 가스N/A
마우스 FC 블록 (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (무수)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Needle, 25 게이지Becton Dickinson305122
Normal mouse serumThermoFisher Scientific31881
나일론 메쉬 스트레이너VWR352350
OCTSakura4583
파라포름알데히드, 20%Electron Microscopy Sciences15713-S사용하여 4%로 희석
, 9인치, 언플러그Fisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE 쥐 안티 마우스 CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 쥐 안티 마우스 CD19Becton Dickinson562329
Percoll 밀도 구배 매체GE 헬스케어17-0891-01
PerCP-Cy5.5 쥐 안티 마우스 CD45Becton Dickinson550994
페트리 접시, 100mmVWR353003
pH 측정기Fisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 µ lGilsonFA10005M
피펫 팁, 1 mLUSA Scientific1111-2831
피펫 팁, 200 &마이크로; lUSA Scientific1111-1816
피펫, 1mLGilsonFA10006M
DAPIThermoFisher ScientificP36962
정제 쥐 안티 마우스 CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit 안티 마우스 CD3 (SP7 클론)Abcamab16669
토끼 안티 마우스 라미닌Abcamab11575
쥐 안티 마우스 ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
혈청학 피펫, 1mLVWR357521
혈청학 피펫, 10mLVWR357551
혈청학 피펫, 5mLVWR357543
수산화나트륨Fisher ScientificS318-100
설탕Fisher 화학S5-500
수술용 가위Fine Science Tools14001-16
수술용 가위, 극세RobozRS-5882
주사기, 10mLBecton Dickinson302995
주사기, 5mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
진공 필터 시스템Millipore20207749
진공 플라스크Thomas Scientific5340-2L
진공 인라인 필터Pall Corporation4402
진공 라인Cole PalmerEW-06414-20
수조ThermoFisher ScientificVersa 목욕
1 x PBS 파스퇴르 피펫을 드

참고문헌

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