방법 논문

마우스에서 흡개 성 림프혈관을 봉합하여 림프 흐름 차단

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DOI:

10.3791/61178

⸱

2020년 5월 14일

 ,  , 
1Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin Medical University, 2Inflammation Research Network, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

이 논문에서

요약

흡혈류 혈관의 외과 봉합에 의한 림프 흐름을 차단하는 프로토콜이 제시된다.

초록

림프관은 항원, 사이토카인 및 세포를 림프절(LN)을 배출하도록 이송하여 조직 유체 균형을 유지하고 면역 보호를 최적화하는 데 중요합니다. 림프류의 작동을 연구할 때 림프 흐름의 중단은 중요한 방법입니다. 뮤린 풋패드에서 포플라이트 림프절(pLN)까지의 퍼포성 림프관은 pLN으로 림프 배수를 위한 유일한 경로로 잘 정의됩니다. 이러한 흡혈류 혈관을 봉합하면 pLN으로의 림프 흐름을 선택적으로 방지할 수 있습니다. 이 방법은 배수 pLN, 흡신성 림프관뿐만 아니라 주변의 다른 림프관에서 림프 내피 세포에 최소한의 손상과 림프 흐름의 간섭을 허용합니다. 이 방법은 림프가 LN에서 높은 내피 정맥 (HEV) 및 chemokine 발현에 미치는 영향과 기능성 림프혈관이 없는 경우 LN을 둘러싼 지방 조직을 통해 림프가 어떻게 흐르는지 연구하는 데 사용되었습니다. 림프 기능의 중요성에 대한 인식이 증가함에 따라이 방법은 LN 미세 환경 및 면역 반응을 조절하는 림프관의 기능을 더욱 해명하기 위한 광범위한 응용 프로그램을 갖게 될 것입니다.

서론

림프계의 공간 조직은 세포외 유체를 효율적으로 제거하고 항원 제시 세포(AC)를 배수 LN으로 수송하는 구조적 및 기능적 지원을 제공한다. 초기 림프혈관(림프모세혈관이라고도 함)은 주변 세포외 공간에서 유체, 세포 및 기타 물질의 효과적인 수집을 용이하게 하는 불연속 세포 간 접합으로 인해 매우 투과성이 있다1. 초기 림프관은 세포간 접합, 연속 지하 막 및 림프 근육 커버리지가 있는 림프혈관을 수집하는 것으로 병합됩니다. 림프혈관을 채취하면 수거된 림프를 배수 LN으로 운반하고 결국 림프를 순환2,3로되돌려야 합니다. 림프를 배수 LN으로 추진하는 림프류를 수집하는 것은 포근림프용기4,5,6,7이다. 흡수성 림프관의 방해는 림프흐름의 기능을 연구할 때 유용한 기술인 LN으로 림프흐름을 차단할 수 있다.

이전 연구는 림프 흐름항원 및 APC를 수송에 중요 한 역할을 하는 것으로 나타났습니다., LN 항상성을 유지 뿐만 아니라. 조직 유래 APC, 전형적으로 활성화된 수지상 세포(DC)가 T세포(8)를활성화하기 위해 포구성 림프혈관을 통해 LN으로 이동하는 것으로 잘 이해된다. 미생물이나 수용성 항원과 같은 자유형 항원들이 LN 거주자 APC를 활성화하기 위해 LN으로 림프로 수동적으로 흐르고 있다는 생각은 지난 10년동안 9,10,11,12에서수용을 얻고 있다. 림프로 여행하는 자유 형태 항원은 감염 후 몇 분 정도 걸리며, LN 거주자 세포 활성화는 자극 후 20 분 이내에 발생할 수 있습니다. 이는 배수 LN9에들어가는 데 8시간 이상이 걸리는 마이그레이션 DC의 활성화보다 훨씬 빠릅니다. 림프는 면역 보호를 시작하기 위해 항원을 운반하는 것 외에도 세포카인과 DC를 LN으로 운반하여 미세 환경을 유지하고 면역 세포항상성(13,14)을지원합니다. 이전에는 포근성 림프혈관을 봉합하여 림프흐름을 차단함으로써 LN15,16, 17에동종성 T 세포 및 B 세포 호밍을 지원하는 데 필요한 HEV 표현형을 유지하는 데 림프가 필요하다는 것을입증했다. CCL21은 LN8,18에서DC 및 T 셀 포지셔닝을 지시하는 중요한 케모키네이다. 차단 림프 흐름은 LN에서 CCL21 발현을 방해하고 잠재적으로 LN19에서DC 및 T 셀 위치 및/또는 상호 작용을 방해한다. 따라서, 림프 흐름을 차단하는 것은 LN에서 면역 반응을 조절하는 LN 미세 환경을 방해함으로써 배수 LN에 항원/DC 접근을 직간접적으로 물들수 있다. 림프 흐름의 기능을 더 잘 조사하기 위해, 발패드에서 pLN까지 흡혈류 혈관을 봉합하여 마우스의 림프 흐름을 차단하는 실험프로토콜(도 1)이제시된다. 이 방법은 건강하고 병들게 하는 조건에서 림프 기능에 대한 향후 연구를위한 중요한 기술이 될 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 작업은 기관 및 정부 윤리 및 동물 처리 위원회의 승인을 받아야 합니다.  이것은 비 생존 수술입니다.

1. 재료 의 준비

  1. 멸균수 30mL와 100% 에탄올 70mL를 혼합하여 70% 에탄올100mL를 준비한다. 자동 클라브 수술 전에 모든 수술 도구를 유지하고 살균을 유지하기 위해 수술 전과 수술 중에 70 % 에탄올에 도구를 유지합니다.
  2. 사출 장치를 준비합니다.
    1. 폴리에틸렌 튜브의 ~30cm 를 잘라 (직경 0.28 mm). 30 G x 1/2 바늘(바늘 A)의 끝을 폴리에틸렌 튜브의 한쪽 끝에 연결합니다. 다른 30 G x 1/2 바늘(바늘 B)을 조심스럽게 빼내고 깨진 면을 폴리에틸렌 튜빙의 다른 쪽 끝에 연결합니다.
    2. 바늘 A를 1 mL 결핵 주사기에 부착합니다.
      참고:이 폴리에틸렌 튜브의 경우 튜브내의 1.6cm의 유체는 1 μL20에해당합니다.
  3. 식염수 (세균성 0.9 % [w /v] 염화 나트륨)에서 10:1 케타민 / 자일라진 혼합물 (10 mg / mL 케타민 및 1 mg / mL 자일라진)을 준비하십시오. 사용하기 전에 솔루션을 신선하게 준비하십시오.

2. 수술을 위한 동물의 준비

참고: 6-10주 된 생쥐를 사용하십시오. 암컷마우스와 수컷 마우스를 모두 사용할 수 있다. 이 연구에서는 6-10주 된 C57BL/6 암컷 마우스가 사용되었습니다. 이 방법은 마우스의 그밖 긴장에 적응될 수 있습니다.

  1. 케타민/자일라진 혼합물의 250 μL을 관전적으로 주입하여 마우스를 마취한다. 마우스가 완전히 잠들어 때까지 기다립니다. 마우스가 발가락 핀치에 반응하지 않도록 전체 마취를 감지하십시오.
  2. 머리 깎기와 다리 주위에 모피를 면도.
  3. 레그 주위에 디필 크림을 바르고 5분 정도 기다립니다. 촉촉한 티슈를 사용하여 잔류 모피와 탈모 크림을 닦고 멸균물로 다리를 청소하십시오. 수술 부위를 살균하기 위해 다리 주위에 70 % 에탄올을 스프레이하십시오. 에탄올은 절개 부위로 제한됩니다.

3. 흡신 림프관의 외과 봉합

참고: 오른쪽 다리가 봉합되고 왼쪽 다리가 가짜 컨트롤로 사용됩니다. 림프 봉합사 프로토콜 (단계 3.1-3.8)은 20-30 분 걸립니다.

  1. 마우스를 경향이 있는 위치에 두고 수술 용 테이프로 고정하여 오른쪽 다리의 수술 영역을 노출시십시오.
  2. 1%의 에반스 블루 염료 또는 풋패드에 튜브를 넣는 주입 장치의 유체의 9cm의 5 μL을 부동킵니다. 에반스 블루림프용기에 들어갈 수 있도록 풋패드를 부드럽게 마사지합니다.
    참고: 인슐린 주사기는 소량 주사를 제어하기 쉽지 않습니다. 부피는 사출 장치를 사용하여 보다 정확하게 제어할 수 있다. 림프관은 피부 아래의 푸른 염료로 시각화됩니다. 광범위한 훈련을 통해 두 분포성 림프관은 사페누동맥과 평행한 지방 조직의 투명한 혈관으로 육안으로 볼 수 있습니다. 광범위한 훈련을 통해 염료로 인한 잠재적 장애에 대한 우려가 있는 경우 에반스 블루 염료를 주입하지 않고 선박을 봉합할 수 있습니다.
  3. 해부 현미경에서, 포라이트 포사의 하단 가장자리에서 5mm 절개 부위를 선택합니다. 가위로 피부에 작은 절개(~5mm)를 만듭니다. 미세 조작 포셉을 사용하여 절개를 스트레칭하고 수집 림프용기(도1A)를노출한다.
    참고: 필요한 경우 작은 피부 조각을 제거하여 림프혈관을 노출시킬 수 있습니다.
  4. 해부현미경(도 1B)하에서pLN으로 이어지는 두 분포성 림프혈관을 식별한다.
    참고 : pLN에 풋 패드에서 두 개의 포이포성 림프용기가 있습니다. 둘 다 림프 흐름을 완전히 차단하기 위해 봉합되어야합니다.
  5. 바늘 홀더를 사용하여, 조심스럽게 봉합체 바늘 (0.7 미터 또는 작은) 흡개 림프 용기와 사페누스 동맥 사이에 삽입하고 포근 림프 용기 주위에 부드럽게 바늘을 당겨. 봉합사 끈을 부드럽게 당기고 봉합사 끈의 약 2cm를 남겨 둡니다. 바늘 홀더를 사용하여 외과 의사의 매듭(그림 1C)으로한 림프 용기에 단단히 끈을 묶습니다.
    참고: 절개 아래 의 조직은 공기에 장기간 노출되어 건조할 수 있습니다. 절개를 가능한 한 작게 만들고 봉합사를 신속하게 수행 (즉, 5 분 이내에) 조직이 건조에서 방지 할 수 있습니다. 소량의 식염수를 면봉으로 적용하여 조직 수분을 유지합니다.
  6. 발패드를 부드럽게 마사지하여 에반스 블루 염료가 봉합사 부위를 통과하지 못하도록 한 다음 가위로 여분의 끈을 자릅니다.
  7. 다른 흡혈구용기(그림 1D)에서동일한 봉합단계(즉, 3.5 및 3.6단계)를 수행한다. 3.5 단계(도 1E)에서혈관을 봉합하는 데 사용 된 동일한 봉합사로 피부 절개를 닫습니다.
  8. 가짜 컨트롤의 경우, 왼쪽 풋패드에 에반스 블루 염료 1%의 5μL을 주입하고 풋패드를 마사지하여 림프혈관을 시각화합니다. 절제로 피부를 열고 혈관을 봉합하지 않고 상처를 닫습니다(도 1F).
  9. 선택적으로, 2-4 h에 대한 작동 마우스를 모니터링합니다. 다리의 봉합사 측은 에반스 블루가 허벅지로 퍼지는 부종을 보여주어야 하며, 컨트롤 레그는 풋패드에 제한된 에반스 블루 염료를 표시합니다. 쥐가 깨어나면, 안락사 때까지 마취를 유지하기 위해 추가 케타민 /자일라진 믹스를 주입합니다.

4. 림프 흐름 추적

  1. 수술 직후, 대조군과 림프봉 다리의 발판에 2%의 형광이소이소야네이트(FITC)의 10μL을 주입한다.
  2. 케타민/자일라진 혼합물의 400μL로 마우스를 안락사시키고 마우스가 완전히 마취될 때 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
  3. 포클레타 포사로부터 pLN을 수집하고 FITC 주입 후 2, 6, 12h에서 해부 현미경하에서 pLNs 주위의 천자 다지방 조직을 조심스럽게 제거한다.
  4. 최적의 절삭 온도(10월)화합물(도 1G, H)에서극저온의 측면을 향한 수질 부비동 부위를 포함시켰습니다.
  5. 저온을 사용하여 20 μm 냉동 섹션을 준비합니다.
  6. FITC 분포를 결정하기 위해 공초점 현미경의 밑에 극저온부분을 이미지합니다.

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결과

림프혈관 봉합사는15,16,17,19에서사용되어 림프관의 분자 생물학이 더 잘 이해되기 전에 림프류의 기능을 연구하는 중요한 도구로 사용되었다. 차단 림프 흐름은 LN 항상성을 방해하며,이는 LN15,16,17에최적의 림프구 호밍에 필요한 중요한 유전자 발현을 잃고 있는 HEV로 이어집니다. 그 이후로 림프를 주행하는 DC가 HN13에대한 HEV 유전자 발현 프로파일 및 림프구를 유지하는 데 중요하다는 것을 입증하는 데 2 년이 더 걸렸습니다. 림프 흐름에 의해 제공되는 전단 응력은 LN에서 케...

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토론

림프 흐름을 차단하는 것은 건강하고 병들게 하는 조건에서 LN에 항원 전달을 조작하는 광범위한 응용 을 가질 것이다. 이 방법을 사용하여 항원 전달의 타이밍을 조절하여 지속적인 림프 흐름이 LN 을 배수하는 데 면역 반응을 어떻게 조절하는지 연구할 수 있다. 림프 흐름 중단의 이 방법은 또한 림프가 세포 구획화, 세포 활성화, 세포 이동 및 LN에서 세포 세포 상호 작용에 미치는 영향을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

마우스는 특히 림프내피세포(Flt4-cre-dtr)에서인간 디프테리아 독소 수용체(DTR)를 발현하는 것으로 개발되었다. 이들은 림프 기능을 연구하기 위하여 림프관(22)를구체적으로 고갈시키기 위하여 이용될 수 있다. DT의 투여는 림프혈관과 LN에서 림프내피세포를 죽인다. 림프내막 세포의 고갈은 림프 기능을 연구하기 위해 지역적으로 또는 체계적으로 림프 흐름을 완전히 해브계 할 수 있습니다. 이 방법...

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공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자들은 원고를 교정해 준 아바 자르디네하드에게 감사를 표한다. 이 작품은 캐나다 보건 연구소 (CIHR, PJT-156035)와 캐나다 SL 혁신 재단 (32930)과 Yujia Lin (81901576)에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
< 강>0.9 % 염화나트륨 식염수< / 강>BaxterJB1323
< 강> 100 % 에탄올 < / 강>Greenfield 글로벌캘거리 대학 유통 서비스 UN1170.
탈모 크림NairNair 민감한 포뮬라 헤어 제거 크림 & egrave; 미 위드 스위트 아몬드 오일 & 베이비 오일, 200ml. 또는 유사한 제품.
Evans Blue 염료Sigma Life ScienceE2129-10GEvans blue 염료 1ml의 경우 10ml PBS에 0.1g Evans blue를 첨가합니다. Evens Blue 용액은 0.22mm 필터를 통해 여과되고 1ml 분취액에서 멸균 상태로 유지됩니다.
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)Sigma Life ScienceF7250-1G
Forceps Dumont #3WPI500337
Forceps Dumont #5WPI500233
Injection apparatus폴리에틸렌 튜브의 한쪽 끝을 30G ×에 연결하십시오. ½ 바늘. 1ml TB 주사기를 바늘에 부착합니다. 다른 30G ×에서 바늘 샤프트를 제거하십시오. ½ 바늘. 30G ×의 뭉툭한 끝을 삽입하십시오. ½ 바늘 샤프트를 튜브의 다른 쪽 끝으로 밀어 넣습니다. 이 튜브의 내경은 0.28mm입니다. 따라서 튜브에 있는 1.6cm의 유체는 1 μl입니다.
인슐린 주사기Becton Dickinson and Company (BD)329461
IRIS Forcep straightWPI15914
IRIS 가위WPI14218-G
KetamineNarketanDIN 02374994케타민과 자일라진의 공급업체는 일반적으로 기관 및 정부 규제를 받습니다.
Needles (26Gx3/8)Becton Dickinson and Company (BD)305110
Needles (30Gx1/2)Becton Dickinson and Company (BD)305106
Paton Needle HolderROBOZRS6403스트레이트, 잠금 없음; 톱니 모양
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Sigma Life ScienceP4417-100TAB
Polyethylene tubingBecton Dickinson and Company (BD)427401
Surgical tape (1.25cmx9.1m)Transpore1527-0
Surgical tape (2.5cmx9.1m)Transpore1527-1
SutureDavis and Geck CYANAMID Canada11/040.7 미터법 모노필라멘트 폴리프로필렌
주사기(1ml)Becton Dickinson and Company (BD)309659
VANNAS 가위World Precision Instruments (WPI)14122-G
XylazineRompunDIN02169606케타민과 자일라진의 공급업체는 일반적으로 기관 및 정부 규제를 받습니다.
Equipment
Dissecting microscopeOlympusOlympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100
confocal microscopeLeicaSP8

참고문헌

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