시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

요약

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

초록

마우스 배아 줄기 세포 (mESC)의 신경 분화는 신경 발생에 관련 되 고 잠재적으로 재생 의학에 도움이 되는 주요 메커니즘을 해명 하기 위한 잠재적인 도구. 여기서 는 편생스크리닝 전략을사용하여 체외에서 mESC로부터 뉴런 분화를 위한 효율적이고 저렴한 비용 방법을 확립했습니다. 여기에 정의된 조건하에서, 2일 배아 체형성 + 6일 망막산 유도 프로토콜은 잘 쌓인 및 중성염과 같은 A2lox 및 129개의 유도체의 형성에 의해 볼 수 있듯이 mESC에서 신경 전구체 세포(NPC)로 빠르고 효율적인 분화를 허용합니다. 배아 체의 건강한 상태와 레티노산(RA)이 적용되는 시점뿐만 아니라 RA 농도는 이 과정에서 매우 중요합니다. NPC에서 뉴런으로 의 후속 분화에서, N2B27 중간 II (신경 물질 매체에 의해 보충) 더 나은 장기 유지 보수 및 신경 세포의 성숙을 지원할 수 있습니다. 제시된 방법은 매우 효율적이고, 비용이 낮으며, 작동이 용이하며, 신경생물학 및 발달 생물학 연구를 위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.

서론

배아 줄기 세포 (ESC)는 다능하며 신경 전구체 세포 (NPC)로 분화하고 특정 조건^1하에서뉴런으로 분화 할 수 있습니다. ESC 기반 신경 발생은 신경 발생을 모방하는 최고의 플랫폼을 제공하므로 발달 생물학 연구를위한 유용한 도구로 봉사하고 잠재적으로 재생 의학^2,3에도움이됩니다. 지난 수십 년 동안, 형질전환법(4)과 같은 배아 신경발생을 유도하기 위한 많은 전략이 보고되었으며, 소분자^5를이용하여, 3D 매트릭스 마이크로환경^6,공동배양기술^7을이용하여 보고되었다. 그러나 이러한 프로토콜의 대부분은 조건이 제한적이거나 작동하기 어렵기 때문에 대부분의 실험실에서 의사용에 적합하지 않습니다.

mESC로부터 효율적인 신경 분화를 달성하기 위한 조작이 용이하고 저렴한 방법을 찾기 위해, 여기에 조합 선별 전략이 사용되었습니다. 도 1에설명된 바와 같이, 배아 신경 발생의 전체 과정은 2단계로 나뉘었다. 1단계는 MESC에서 NPC로의 분화 과정을 말하며, 위상 II는 NPC에서 뉴런으로의 후속 분화와 관련이 있습니다. 간편한 작동, 저렴한 비용, 용이한 재료 및 높은 분화 효율의 원리에 기초하여, 단계 I의 7개의 프로토콜과 단계 II의 3개의 프로토콜은 전통적인 부착단 단층 배양 시스템 또는 배아 체형성 시스템^8,9에기초하여 선택되었다. 두 단계에서 프로토콜의 분화 효율은 세포 형태 관찰 및 면역 형광 분석을 사용하여 평가되었다. 각 단계에서 가장 효율적인 프로토콜을 결합하여 mESC에서 신경 분화를 위한 최적화된 방법을 수립했습니다.

프로토콜

1. 마우스 배아 줄기 세포 배양

1. 0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 접시 또는 접시를 준비하십시오.
   1. 멸균 된 0.1 % 젤라틴 (물에서 0.1 % w / v)의 2 mL을 60mm 세포 배양 접시에 추가하십시오. 셀 배양 접시의 코팅도 보장하기 위해 부드럽게 흔들어.
   2. 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에 접시를 넣고 1시간 동안 코팅할 수 있습니다.
   3. 세포를 파종하기 전에 0.1% 젤라틴 용액을 제거합니다.
      참고: 젤라틴을 제거한 후에는 코팅된 접시를 말리거나 씻을 필요가 없습니다.
2. 마우스 배아 줄기 세포 (A2lox 및 129) 배양
   1. 인큐베이트 mESC(A2lox 및 129) 세포에서 0.1% 젤라틴 코팅 60 mm 세포 배양 식 에서 mESC 성장 배지에서 37°C에서 각각 5%_CO2 인큐베이터에. mESC 성장 매체는 85% 노크 아웃 DMEM/F12, 15% 녹아웃 세럼 교체(KSR), 0.1mM β-메르카토에탄올(2ME), 2mM 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산 (NEAA), 1 % 페니실린 / 연쇄 상피신 (P / S), 1000 U / mL 백혈병 억제 인자 (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 억제제) 및 0.33 nM PD032590 (MEK 억제제).
      주의: β-메르카토에탄올은 인화성이며 흡입 독성이 있습니다. 화재 원인에서 멀리 하고 사용 시 흡입을 피하기 위해 마스크를 착용하십시오.
   2. A2lox와 129의 더 나은 성장을 위해 매일 mESC 성장 매체를 변경합니다.
   3. 세포가 80%에 도달하면 배지를 제거하고 접시에 0.1% 트립신1mL을 추가합니다. 모든 셀에 트립신의 커버를 보장하기 위해 부드럽게 30 s에 대한 바위.
   4. 약 1 분 동안 세포를 두고 트립신이활성화한 다음 1 mL 파이펫을 사용하여 트립신을 제거하십시오.
   5. 접시에 mESC 성장 배지 2mL을 추가하고, 파이펫을 여러 번 위아래로 사용하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다.
   6. 혈종계를 사용하여 현탁액내 의 세포 밀도를 가능한 한 정확하게 계산합니다.
   7. 세포를 7그룹으로 나누고 표 1에표시된 다른 프로토콜을 사용하여 분화를 유도한다.

2. MESC에서 NPC로의 차별화 (1단계)

1. 0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 플레이트 또는 커버립을 준비합니다.
   1. 사용하기 전에 1.1 단계에서와 같이 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트 또는 커버립을 준비하십시오.
2. 프로토콜 1을 사용하여 단계 I 분화(표 1)
   1. 약 2 x 10⁴ mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL에 씨를 뿌리고 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에서 잘 합니다. 현미경의 밑에 세포 조밀도를 확인하십시오.
   2. 부착을 허용하기 위해 6h에 대해 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양한다.
   3. 부착 후 인큐베이터에서 세포를 꺼내 PBS 2 mL로 두 번 씻어 내십시오.
   4. 기초 분화 배지I(표 1)의2mL을 각 웰에 넣고 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
   5. 8 일 동안 분화를 위해 세포를 둡니다. 2일마다 기저 분분 매체 I를 교체하십시오.
3. 프로토콜 2를 사용하여 단계 I 분화(표 1)
   1. 1.5 x 10⁶ mESC를 기초 분화 배지 10mL에 첨가하여 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 배아 체형성을 허용합니다.
   2. 2 일 후, 15 mL 원심 분리 튜브로 세포 응고를 전송하고 중력에 의해 정착할 수 있습니다.
   3. 상체를 제거하고 신선한 기초 분화 배지 10mL를 추가하여 배아 체를 재보습합니다. 새로운 미각 세균 성 접시에 그들을 심고 또 다른 2 일 동안 차별화를 허용.
   4. 현미경(도 2A)하에서배아체의 형성을 확인한다.
   5. 단계 2.3.2-2.3.3에 설명된 바와 같이 배아 체를 수집한다. 약 50개의 배아체를 기초 분화 배지의 2mL로 약 50개의 배아체를 잘 하여 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 시드한다.
   6. 1mM 올트랜스 RA 스톡(DMSO)을 준비하고 서브 패키징 후 -80°C 냉동고에 빛으로부터 멀리 보관하십시오.
      참고: RA는 불안정하며 RA 재고를 준비하는 동안 빛을 멀리하고 공기 접촉을 줄이는 데 주의를 기울여야 합니다.
   7. RA 유도의 경우, RA 스톡 2μL을 각 웰에 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다.
   8. 플레이트를 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에 넣고 또 다른 4일 동안 분화한다.
   9. 2일마다 기초 분화 매체 I(1 μM RA)의 전체 2mL를 변경합니다.
4. 프로토콜 3을 사용하여 단계 I 분화(표 1)
   1. 식물 1.5 x 10⁶ mESC는 10mL의 기초 분화 배지에서 미적 세균 성 접시에 들어가면 5 % CO₂ 인큐베이터에서 37 °C에서 배아 체 형성을 위해 2 일 동안 둡니다.
   2. 현미경(도 2B)하에서배아체의 형성을 확인한다.
   3. 세포 응집체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 중력에 의해 정착하게 합니다.
   4. 상체를 조심스럽게 제거하고 신선한 기초 분화 매체 10 mL을 추가하여 다시 일시 중단합니다.
   5. 약 50개의 배아체를 기초 분화 배지 의 2mL로 약 50개의 배아체를 잘 하여 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 시드한다.
   6. RA 유도의 경우, RA 스톡 2μL을 각 웰에 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다.
   7. 플레이트를 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에 넣고 6일 동안 분화한다. 전체 기저 분분 매체 I(1 μM RA)를 2일마다 변경합니다.
5. 프로토콜 4를 사용하여 단계 I 분화(표 1)
   1. 약 2 x 10⁴ mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.
   2. 부착 후 PBS 2mL로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 2mL의 기초 분화 배지 I를 추가하고 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 4일 동안 분화를 허용한다.
   3. RA 유도의 경우, 각 우물(작동 농도는 1 μM)에 2 μL의 모든 트랜스 RA 스톡을 추가하여 또 다른 4일 동안 분화를 유도합니다.
   4. 전체 공정에서 2일마다 전체 매체를 교체하십시오.
6. 프로토콜 5를 사용하여 단계 I 분화(표 1)
   1. 약 2 x 10⁴ mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.
   2. PBS의 2mL로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 2mL의 기초 분화 배지 I를 추가하고 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 2일 동안 분화를 허용한다.
   3. 후속 RA 유도의 경우, 각 우물에 2 μL의 RA 스톡을 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에 배치하여 또 다른 6일 동안 분화를 유도한다.
   4. 전체 공정에서 2일마다 전체 매체를 교체하십시오.
7. 프로토콜 6을 사용하여 단계 I 분화(표 1)
   1. 식물 1.5 x 10⁶ mESC는 배아 체 형성을 허용하기 위해 N2B27 중간 II(표 1)의10 mL에서 미적 세균 성 접시에 들어간다.
   2. ^2일째에, 2.3.2-2.3.3 단계에 설명된 바와 같이 세포 응집체를 수집하고 신선한 N2B27 배지 II의 10mL를 사용하여 배아 체를 재연한다.
   3. 새로운 미동세균 접시에 이식하고 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에서 2일 동안 분화를 허용한다. 현미경의 밑에 태아 바디의 대형을 확인하십시오.
   4. ^{4일째되는} 날, 배아시체를 수집합니다. N2B27 배지 II의 2mL를 가진 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 잘 당 약 50개의 배아 체를 시드한다.
   5. 모든 트랜스 RA 스톡 2 μL을 각 우물에 넣고 또 다른 4일 동안 분화를 유도합니다. 전체 배지(N2B27 배지 II를 1μM RA로)를 2일마다 교체합니다.
8. 프로토콜 7을 사용하여 단계 I 분화(표 1)
   1. 약 2 x 10⁴ mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.
   2. PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 이어서, N2B27 배지 II의 2mL를 각 웰에 추가하고 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 8일 동안 분화를 허용한다.
   3. 2일마다 전체 N2B27 중간 II를 변경합니다.

3. 세포 형태 관찰

1. 반전 된 상 대비 빛 현미경에서 매일 위에서 언급 한 7 그룹의 분화 상태를 확인합니다.
2. 무작위로 최소 12개의 필드를 선택하고 사진을 찍어 D8에서 각 그룹의 형태학적 변화를 기록합니다.

4. 면역 형광 염색

1. 샘플 준비: 종자 mESC0.1% 젤라틴 코팅 커버립에 2단계에서 언급된 프로토콜을 사용하여 8일 동안 분화를 허용한다.
2. 린세:^8일째에 인큐베이터에서 샘플을 꺼내 포부로 분화 매체를 제거합니다. 부드럽게 5 분 동안 PBS의 1 mL로 한 번 세포를 헹구십시오.
3. 고정: 각 샘플에 4% 파라포름알데히드 1mL을 추가하고 실온(RT)에서 20분 동안 셀을 수정합니다.
4. 헹구기: 고정 후, PBS 의 1 mL로 세포를 3번 부드럽게 헹구고, 각각 5분 동안 헹구십시오.
5. 침투성: PBS에 0.2% TritonX-100의 1mL을 각 샘플에 추가하고 RT에서 8분 동안 둡니다.
6. 헹구기: 투과화 후, PBS 3회 1mL로 세포를 부드럽게 헹구고 각각 5분간 헹구십시오.
7. 차단: PBS에 1mL의 염소 세럼을 각 샘플에 추가하고 RT에서 1h에 인큐베이션하여 비특이적 상호 작용을 차단합니다.
8. 1차 항체를 가진 배양
   1. PBS에서 5% 염소 세럼을 사용하여 1:100의 비율로 항 네스티닌 항체를 희석시.
   2. 희석 된 항체의 500 μL을 다른 샘플에 적용하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
9. 헹구기: 항체를 제거하고 각각 8분 동안 PBS 3회 1mL로 시료를 부드럽게 헹구십시오.
10. 이차 항체를 가진 배양
    1. PBS에서 5% 염소 세럼을 사용하여 알렉사 플루어 488 라벨 염소 안티 마우스 IgG의 비율로 희석 1:500.
    2. 희석 된 항체의 500 μL을 다른 샘플에 적용하고 RT에서 2 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
       참고: 형광 이차 항체를 적용한 후, 형광 담금질을 방지하기 위해 어둠 속에서 모든 후속 단계를 수행합니다.
11. 헹구기: 이차 항체를 제거하고 각각 8분 동안 PBS 3회 1mL로 시료를 부드럽게 헹구십시오.
12. 핵 염색 및 장착
    1. DAPI 마운팅 배지 1방울을 깨끗한 마이크로슬라이드에 놓습니다.
    2. 조심스럽게 플레이트에서 샘플을 꺼내 서 아래로 셀을 가진 DAPI 장착 매체위에 샘플을 배치. RT에서 5 분 동안 어둠 속에서 둡니다.
    3. 흡수성 용지로 과도한 DAPI 마운팅 매체를 제거합니다.
13. 형광 현미경 검사기 관찰
    1. 형광 현미경 검사의 밑에 표본을 놓고 적당한 필터를 사용하여 DAPI와 알렉사 플루올48에 대한 신호를 검출합니다.
    2. 각 샘플에 대해 10-15개의 서로 다른 시각적 필드를 고르고 무작위로 선택하고 CCD 카메라로 이미지를 기록합니다.

5. NPC에서 뉴런으로의 차별화 (단계 II)

1. 가장 높은 차별화 효율을 가지는 단계 2.4에 상세한 프로토콜 3(8일, 표 1)을사용하여 단계 I 분화 하에서 mESC 유도체를 준비합니다(그림 3참조).
   참고: 1상 제분화 후, 건강하고 고수율의 NPC를 보장하기 위해 위에서 언급한 세포 형태 관찰 및 면역형광 분석방법을 사용하여 품질 관리를 수행해야 합니다.
2. 약 5 x 10⁵ mESC 유도체를 기초 분화 배지 의 2mL 내에서 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 잘 뿌려. mESC 유도체를 단계 II 프로토콜 1, 프로토콜 2 및 프로토콜 3로 개별적으로 3그룹으로 임의로 분할합니다.
3. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다. PBS 2mL로 두 번 씻으시면 됩니다.
4. 기저 분화 매체 I, N2B27 배지 I 및 N2B27 배지II(표 2)의2mL을 각각 위의 그룹의 각 웰에 추가합니다.
5. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 10일 동안 차별화할 수 있습니다. 해당 매체를 2일마다 변경합니다.
6. 분화 상태를 확인하고 3단계에서 언급한 대로 형태학적 변화를 기록합니다.
7. 18일째에, 뉴런의 생성을 평가하고(β-Tubulin III 양성)을 평가하고 4단계에서 사용하는 3개의 프로토콜의 분화 효율을 결정한다.

결과

2일 배아체 형성 + 6일 RA 유도는 MESC를 NPC로 분화시키는 데 가장 적합합니다(1상). MESC를 NPC(Phase I)로 균등화하는 최적의 프로토콜을 결정하기 위해, 7개의 프로토콜은 A2lox 및 129mESC(표1)에서모두 테스트되었으며 각 그룹의 분화 상태는 광 현미경을 사용하여 모니터링하였다. 도 3A에도시된 바와 같이, 대부분의 A2lox 및 129 유도체는 "2일 배아 체형성 + 6일 RA 유도" 치료(Phase I-프로토콜 3) NPC의 형성을 나타내는 잘 쌓인 및 중성자 같은 형태를 보였다. 그러나 , "4 일 배아 신체 형성 + 4 일 RA 유도" 치료 (단계 I-프로토콜 2)를 가진 세포는 배아 체 내의 영양소부족으로 인한 불량하고 석멸 상태를 보였다. RA 유도(Phase I-protocol 4 및 5)와 결합된 단층 배양은 mESC의 분화를 지시할 수 있으며, 중성염과 같은 세포의 비율은 단계 I 프로토콜 3에서...

토론

본 연구에서는, 우리는 mESC에서 신경 분화를 위한 간단하고 효과적인 방법을 설치했습니다, 저렴한 비용과 쉽게 얻을 수 있는 물질. 이 방법에서, RA 유도6일 뒤에 배아체 형성의 2일은 효과적으로 NPC로 mESC의 분화를 촉진할 수 있다 (단계 I-프로토콜 3). 상 II 분화의 경우, N2B27 배지 II(Phase II-프로토콜 3)는 NPC로부터 뉴런으로의 분화를 가장 효과적으로 유도한다. 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계에 더 많은 주의를 기울여야 합니다.

첫째, 배아 체의 건강한 상태는 전체 분화 과정의 열쇠입니다. 3차원 배아 체형성은 일반적으로 ESC^8의분화를 지시하는 데 사용된다. 이 연구에서는, 우리는 태아 바디의 적당한 현탁액 배양 시간을 조사했습니다. 도 2에도시된 바와 같이, 밝은 코어를 가진 둥근 배아 체는 이 조건에서 2일 동안 현탁액 배양 후에...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-Nestin 항체 [Rat-401]	Abcam	Ab11306	-80°C에 저장되었습니다. C, 동결 및 해동을 반복하지 마십시오
Anti-β -Tubulin III 항체	Sigma Aldrich	T2200	. C,
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	-20°C로 저장하여 반복적으로 얼고 녹이는 것을 피하십시오. C와 가벼운
B-27 보충제 (50X)로부터 보호, 무 세럼	Gibco	17504044	-20 °에서 보관; C, 빛으로부터 보호
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	-20 ° C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	-20 °에 저장; C 및 빛으로부터 보호
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	는 4°C에 저장됩니다. C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	-20 °에 보관; C, 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오
형광 현미경 검사	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	실온에서 보관
GlutaMAX 보충제	Gibco	35050061	4°C에서 보관합니다. C
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	4°C에 보관됨; C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	4°C에 보관됨; C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	-20 ° C,
백혈병 억제 인자 인간	시그마	L5283	.
DAPI가 있는 C 장착 매체 - 수성, Fluoroshield	Abcam	ab104139	4°C에 보관됩니다. C는 가벼운
MEM Non-essential 아미노산 용액	Gibco	11140076	4 °에 저장으로부터 보호합니다. C
N-2 보충교재 (100X)	Gibco	17502048	-20 °에 저장; C 및 빛으로부터 보호
일반 염소 세럼	잭슨	005-000-121	-20 °에 저장; C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	4 °에서 보관됩니다. C
Nonadhesive 세균성 접시	Corning	3262
인산염 완충 식염수 (1X)	HyClone	SH30256.01B	는 4°C에 보관됩니다. C
페니실린/스트렙토마이신 용액	HyClone	SV30010	4°C에 보관됩니다. C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	-20°C에 보관되었습니다. C
레티노산	시그마	R2625	-80°C에 저장되었습니다. C 및 빛으로부터 보호
균주 129 마우스 배아 줄기 세포	Cyagen	MUAES-01001	피더없는 배양 시스템에서 유지
줄기 세포 은행 (DMSO 무료)	ZENOAQ	줄기 세포 은행 DMSO 무료	-20 °에서 저장; C,
Trypsin 0.25 % (1X) 용액	HyClone	SH30042.01	4 °C에 저장하여 동결 및 해동을 반복하지 마십시오. C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	4°°C에 보관됩니다. C 및 -
4% 파라포름알데히드	Beyotime	P0098	; C
6 - 웰 플레이트	Corning	3516
60mm 세포 배양 접시	Corning	430166
15ml 원심분리기 튜브	NUNC	339650