방법 논문

Aspergillus oryzae의 보조영양성 돌연변이를 사용하여 이종 단백질의 생산을 평가하기 위한 직접 액체 배양 스크리닝

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⸱

DOI:

10.3791/61219

⸱

2020년 5월 12일

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

이 논문에서

요약

이종 단백질의 분비 생산 평가에 사용될 때 사상균인 Aspergillus oryzae의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 원형질체 형질전환에 필요한 시간을 크게 단축하는 직접 액체 배양(DLC) 스크리닝 방법이 개발되었습니다. 이 방법은 평가 프로토콜의 처리량을 크게 증가시킵니다.

초록

사상균인 Aspergillus oryzae는 단백질의 대규모 생산을 포함한 산업 응용 분야에서 가장 널리 사용되는 숙주 중 하나입니다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 원형질전환 방법은 일반적으로 A. oryzae에 이종 유전자를 도입하는 데 사용됩니다. 종래의 방법은 일반적으로 유리한 형질전환체의 스크리닝을 위해 3주가 소요됩니다. 여기에서는 새로운 기술인 DLC(Direct Liquid Culture) 스크리닝 방법을 도입하여 스크리닝 시간을 200mL 플라스크 형식의 경우 6일, 24웰 마이크로플레이트 형식의 경우 10일로 단축합니다. DLC 스크리닝 방법은 두 개의 별도 단계가 필요한 기존 스크리닝 방법과 달리 단일 단계에서 양성 형질전환체의 획득 및 이종 단백질의 분비 생산의 평가를 보장합니다. A. oryzae의 PEG 매개 원형질전환 프로토콜은 신선한 포자 현탁액 준비, 배양 전, 원형질체 준비, DNA 도입 및 DLC 스크리닝의 5단계로 구성됩니다. DLC 스크리닝에서 성공적인 결과를 얻으려면 삼투압이 최적화된 영양이 풍부한 배지를 사용하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 단백질의 산업 생산에서 선택되는 숙주로 A. oryzae의 사용을 더욱 대중화해야 합니다.

서론

아스페르길루스 오리제(Aspergillus oryzae)는 일본 식품 산업에서 1,000년 이상 사용되어 온 중요한 미생물로, 사케(막걸리), 쇼유(간장), 된장(된장)과 같은 발효 식품의 생산에 사용되어 왔습니다1,2. 단백질분해효소(protease)와 아밀라아제(amylase)와 같은 단백질을 다량 분비할 수 있는 능력이 있다3. A. oryzae에 대한 게놈 염기서열 정보도 이용 가능4. 또한,이 곰팡이에 대해 강력하고 실질적으로 유용한 유전 공학 기술이 확립되었습니다 5,6,7,8,9,10. 유리한 형질전환체는 이종성 단백질의 분비 생산을 위한 숙주로 사용되어 왔다 11,12,13,14.

전기천공법(Electroporation), 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질전환(Agrobacterium-mediated transformation) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 프로토플라스트 형질전환(protoplast)은 이종성 유전자를 A. oryzae 15,16,17에 도입하는 데 사용되는 기술입니다. PEG 매개 원형질전환 방법은 1979년 Neurospora, crassa에 대해 처음 보고된 이래 널리 사용되어 왔다18. 이 방법에서는 프로토플라스트를 준비하고 PEG 및 세포에 도입될 이종 유전자와 혼합합니다. 원형질체의 벽은 효소에 의해 손상되어 세포를 물리적 스트레스와 삼투압 변화에 취약하게 만듭니다19,20. 이종 단백질의 분비 생산에 사용되는 종래의 스크리닝 방법은 3단계를 포함한다: (연질 한천 플레이트상에서) 양성 형질전환체의 획득, (한천 플레이트상에서) 참 및 거짓 형질전환체의 선택, 및 이종 단백질의 분비 생산의 평가(액체 배양에서); 이러한 각 단계는 7일이 걸립니다(그림 1). 따라서, 종래의 방법은 일반적으로 약 3주가 소요된다.

형질전환된 A. oryzae 세포를 스크리닝하는 데 필요한 시간은 생명공학 연구에 일반적으로 사용되는 다른 미생물에 필요한 시간보다 훨씬 길기 때문에 프로세스가 더 번거롭습니다. 예를 들어, 대장균 을 숙주로 사용하는 경우, DNA가 도입된 후 그 효과가 확인되기까지 약 2일이 소요됩니다 21.

위에서 언급한 바와 같이 A. oryzae 의 사용과 관련된 제한을 피하기 위해, 본 명세서에서는 이종 단백질의 분비 생산 평가를 위한 보다 빠르고 간단한 스크리닝을 가능하게 하는 새로운 직접 액체 배양(DLC) 스크리닝 방법을 도입했습니다(그림 1). DLC 방법에서는 우리딘 보조영양 돌연변이체와 영양이 풍부한 액체 배지가 사용됩니다. 이 방법을 사용하면 200mL 플라스크 형식으로 프로토플라스트에 DNA를 도입한 후 6일 이내에 또는 24웰 마이크로플레이트 형식으로 10일 이내에 스크리닝 단계를 완료할 수 있습니다. 또한, 이 방법에서는 시간이 많이 걸리고 힘든 한천 플레이트 매체를 준비할 필요가 없습니다. 특히 종래의 방법이 2개의 상이한 배지를 필요로 한다는 사실을 고려하면, 새롭게 기술된 방법을 사용함에 있어 큰 이점이 있다: 신중한 취급 및 온도 조절을 필요로 하는 양성 형질전환체의 획득을 위한 연질 한천 플레이트, 및 진정한 형질전환체의 선택을 위한 고체 한천 플레이트.

figure-introduction-1
그림 1: 사상균 Aspergillus oryzae의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 원형질체 형질전환의 개략도.
(상단 패널) 종래의 스크리닝 방법. (하단 패널) 직접 액체 배양(DLC) 스크리닝 방법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

1. 신선한 포자 현탁액의 준비

  1. Czapek-Dox(CD) 배지가 포함된 배양 플레이트의 중앙에 20μL의 스톡 포자 현탁액(1 x 10,7 포자/mL)에 20mM 우리딘을 접종합니다(121°C에서 20분 동안 오토클레이브, 표 1).
  2. 포자 형성을 촉진하기 위해 30 °C에서 7 일 동안 배양하십시오.
  3. 포자가 들어 있는 배양판에 0.01% Tween 20 용액 1.5mL(121°C에서 20분 동안 오토클레이브)를 추가하고 세포 스프레더로 긁어내어 포자를 현탁시킵니다.
  4. 피펫을 사용하여 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 포자 현탁액을 수집합니다.
  5. 현탁액은 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
    알림: 2주 이내에 다음 절차에 따라 포자 현탁액을 사용하십시오. 장기 보관을 위한 스톡을 만들려면 포자 현탁액에 글리세롤을 최종 농도 15%까지 추가하고 -80°C에서 보관하십시오.

2. 전문화

  1. 500mL 삼각 플라스크에 100mL의 폴리펩톤-덱스트린(PD) 배지(표 2)를 추가하고 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
  2. 매체의 온도가 저하된 것을 확인한 후, 공극 크기가 0.22μm인 필터를 통과시켜 멸균된 우리딘 용액을 최종 농도 20mM까지 첨가합니다.
  3. 1.4단계에서 준비한 포자 현탁액 200μL(1 x 107 spores/mL)를 첨가하고 30°C에서 120rpm으로 36시간 동안 진탕하면서 배양합니다.

3. 원형질체의 준비

  1. 2.3단계에서 준비한 진균 바이오매스를 공극 크기가 30μm인 유리 필터에서 수확합니다(121°C에서 20분 동안 오토클레이브).
  2. 유리 필터에 증류수(DW) 100mL(121°C에서 20분 동안 고압 멸균)를 붓고 주걱(121°C에서 20분 동안 고압 멸균)으로 여러 번 저어줍니다.
  3. DW로 세척한 후 유리 필터에 염화나트륨(NaCl) 완충액 100mL(121°C에서 20분 동안 오토클레이브, 표 3)를 붓고 주걱으로 여러 번 저어줍니다.
  4. 주걱을 사용하여 약 1-2mL(습식 부피)의 세포를 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다(121°C에서 20분 동안 오토클레이브).
  5. 50mL 원뿔형 튜브에 15mL의 효소 용액(0.22μm 공극 크기의 필터를 통과하여 멸균, 표 4)을 첨가한 후 총 부피가 30mL가 될 때까지 NaCl 완충액을 첨가합니다.
  6. 뚜껑을 닫고 파라핀 필름으로 밀봉합니다. 30 ° C에서 60 rpm으로 2 시간 동안 흔들면서 배양하십시오.
  7. 생성된 용액을 50mL 원뿔형 튜브에 부착된 70μm 세포 스트레이너를 통해 흐르게 하여 미반응 균사체를 제거합니다.
  8. 50mL 원뿔형 튜브에서 2,150 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
  9. 펠릿이 빠지는 것을 방지하기 위해 상등액을 부드럽게 버립니다. 1mL의 얼음처럼 차가운 멸균 용액 B(121°C에서 20분 동안 고압멸균, 표 5)를 추가하고 피펫팅으로 침전된 원형질체를 부드럽게 현탁시킵니다.
  10. 부유 원형질체를 멸균 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  11. 2,220 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 용액 B 1mL를 넣고 피펫팅으로 펠릿을 부드럽게 매달아 놓습니다.
  12. 3.9단계를 반복합니다.
  13. 혈구계를 사용하여 현미경으로 원형질체의 수를 측정합니다.
  14. 용액 B에 프로토플라스트 현탁액(1−3 x 107 프로토플라스트/mL)을 준비하고 사용할 때까지 얼음에 보관합니다.
    참고: 다음 절차에서 protoplast 현탁액을 즉시 사용하십시오.

4. 단백질의 분비 생산을 위한 DNA의 도입

  1. 단백질의 분비 생산을 위한 DNA cassette를 포함하는 plasmid를 template으로 사용하여 PCR에 의해 분비 생산에 필요한 DNA 단편을 증폭합니다.
  2. PCR purification kit를 이용하여 PCR 산물을 처리하여 형질전환에 사용할 DNA 검체를 준비합니다.
  3. 1mL의 프로톱플라스트 용액, 200μL의 용액 C(121°C에서 20분 동안 고압멸균, 표 6) 및 DNA 샘플(0.5-1μg/μL) 50μL를 멸균된 예냉각된 15mL 원뿔형 튜브에 넣고 피펫팅으로 용액을 부드럽게 혼합합니다.
    참고: 용액 C는 점성이 높으며 다루기 어려울 수 있습니다. 피펫팅으로 철저한 혼합을 보장합니다.
  4. 얼음 위에서 튜브를 30분 동안 배양합니다.
  5. 용액 C 1.5mL를 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 다음 용액을 실온에서 20-30분 동안 그대로 둡니다.

5. 직접 액체 배양 스크리닝

참고: 삼각 플라스크(섹션 5.1) 또는 마이크로플레이트(섹션 5.2)를 사용하여 배양 시스템을 선택합니다.

  1. 200 mL 삼각 플라스크를 사용한 배양 시스템
    1. 200mL 삼각 플라스크에 0.8M 솔비톨이 함유된 PD 배지 50mL를 첨가하고 121°C에서 20분 동안 오토클레이빙으로 멸균합니다.
    2. 배지의 온도가 감소하는 것을 확인한 후, 단계 4.5에서 제조한 프로토플라스트 현탁액을 1 x 105 프로토플라스트/mL의 최종 농도에 첨가합니다.
    3. 120 rpm에서 진탕하면서 30 °C에서 6 일 동안 배양물을 배양합니다.
    4. 배지 1mL를 모아 4°C에서 1.5mL 튜브에 보관합니다. 즉시 분석하지 않는 경우 배양 샘플을 -20 ° C에서 보관하십시오.
    5. 1.5mL 튜브에 배양 시료 20μL와 도데실황산나트륨(SDS) 시료 완충액 20μL(표 7)를 혼합하고 95°C에서 5분 동안 끓입니다.
    6. 얼음에서 냉각한 후 끓인 샘플 20μL와 미리 염색된 단백질 표준물질 5μL를 프리캐스트 겔에 로드하고 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)10에 의한 표적 이종 단백질의 분비 생성을 분석합니다.
  2. 24웰 마이크로플레이트를 이용한 배양 시스템
    1. 4.5단계에서 제조한 프로토플라스트 현탁액을 멸균된 0.8M 솔비톨 함유 PD 배지에 1 x 105 protoplasts/mL의 최종 농도로 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
    2. 5.2.1단계에서 준비한 용액 1mL를 24웰 마이크로플레이트의 웰 3개에 추가합니다.
    3. 뚜껑을 닫고 30°C에서 10일 동안 175rpm으로 흔들면서 배양합니다.
    4. 배지 1 mL를 수집하고 4 ° C의 1.5 mL 튜브에 보관하십시오. 즉시 분석하지 않는 경우 배양 샘플을 -20 ° C에 보관하십시오.
    5. 1.5 mL 튜브에 배양 시료 20 μL와 SDS 시료 완충액 20 μL를 혼합하고 95 °C에서 5 분 동안 끓입니다.
    6. 얼음에 냉각 후, 비등한 샘플 20 μL와 프리캐스트 겔에 prestained 단백질 표준 5 μL를 로드하고 SDS-PAGE10에 의해 타겟 이종 단백질의 분비 생산을 분석합니다.

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결과

A. oryzae 균주 HO422의 우리딘 보조영양 효소에 Talaromyces cellulolyticus cellobiohydrolase(CBH: GenBank 등록 번호 E39854)에 대한 DNA 발현 카세트 코딩을 도입하고 이종 단백질의 분비 생산을 스크리닝한 결과를 다음과 같습니다.

신선한 포자 현탁액의 준비

하나의 한천 플레이트에서 포자 현탁액의 최종 수율은 1mL(1 x 107 포자/mL)였습니다.

전문화

36시간 동안 배양한 후, 3.1단계에서 수확할 때 1개의 플라스크에서 ~5mL(습식 부피)의 진균 바이오매스를 얻었습니다. 수율은 3.2단계의 최소 2번의 시도에...

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토론

당사는 원형질체의 액체 배양을 수행함으로써 기존 방법보다 더 빠르게 A. oryzae 형질전환체를 스크리닝할 수 있는 시스템을 개발했습니다. 이 방법의 가장 중요한 측면은 액체 매체의 삼투압입니다. 액체 배양에 적합한 삼투압은 소르비톨을 사용하여 최적화되었습니다. A. oryzae 균주 HO4의 성장은 0.8M 소르비톨이 있을 때 가장 활발했습니다(그림 3A). 연질 한천 배지를 사용하는 종래의 방법에서, 0.5-1.2 M의 삼투압이 N. crassa, Aspergillus sp. 및 Trichoderma sp.21에 적합한 것으로 보고되었다. 삼투압 압력 조절기에는 소르비톨, NaCl, 염화칼륨(KCl) 및 황산마그네슘(MgSO4)이 포함됩니...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

저자는 실험에 도움을 준 오카노 린케이(Rinkei Okano)에게 감사를 표합니다. 저자는 귀중한 토론을 해준 도호쿠 대학의 Katsuya Gomi 교수와 Kanazawa Institute of Technology의 Masayuki Machida 교수에게 감사를 표합니다. 이 연구는 Honda Research Institute Japan Co., Ltd.의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 M NaOHNACALAI 테스크, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7.5)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6.8)FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation 2106-100
1.5-mL 마이크로 원심분리기 튜브AS ONE Corporation1-1600-03
15-mL 원추형 원심분리기 튜브Becton, Dickinson and Company352196
2- 메르캅토에탄올Bio-Rad Laboratories, Inc.
24웰 마이크로플레이트AGC TECHNO GLASS CO., LTD.3820-024
50-mL 원추형 원심분리기 튜브Becton, Dickinson and Company352070
70-µ m 세포 여과기Becton, Dickinson and Company352350
한천후지 필름 Wako Pure Chemical Corporation010-15815
오토클레이브TOMY SEIKO CO., LTD.LSX-700
브로모페놀 블루후지필름 와코퓨어화학주식회사021-02911
CaCl2FUJIFILM 와코퓨어화학주식회사038-24985
카사미노산후지필름 와코퓨어화학주식회사393-02145
셀룰라아제 R-10코스모바이오16419
덱스트린 수화물FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation044-00585
D-소르비톨FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020LSDS-PAGE
전기영동 장치ATTO CORPORATIONWSE-1150SDS-PAGE
에 사용FeSO4· 7H2O후지필름 와코퓨어케미컬098-01085
유리 필터 17G3도쿄 가라스 키카이 주식회사
글리세롤후지 필름 와코 퓨어 케미컬 주식회사070-04941
혈구계후나코시 주식회사521-10
고속 냉장 원심 분리기KUBOTA CORPORATION778050-mL 원추형 원심 분리기
튜브 인큐베이터.지&미드닷; BR-200플라스크 액체 배양 및 원형체
인큐베이터TAITEC CORPORATIONBR-43FL마이크로플레이트 액상 배양 및 플레이트 배양에 사용
KCl후지필름 Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
용해 효소Sigma-AldrichL1412-10G
MgSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation131-00405
마이크로 냉장 원심분리기KUBOTA CORPORATION37401.5mL 마이크로 원심분리기 튜브의 시료 원심분리에 사용
현미경Leica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation190-13921
NaH2PO4· 2H2O나칼라이 테스크, INC.31718-15
NaNO3FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation195-02545
Parafilm MBemis Company, IncPM-996
PCR 정제 키트QIAGEN K.K28104
페트리 접시Sumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-11900배양 플레이트로 사용
폴리에틸렌 글리콜Sigma-AldrichP3640-500G
폴리펩톤 펩톤Becton, Dickinson and Company211910
단백질 사다리Bio-Rad Laboratories, Inc.161-0377SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfateBio-Rad Laboratories, Inc.
멸균 필터Merck KGaASLGP033RB
SucroseNACALAI TESQUE, INC.30404-45
트윈 20도쿄 화학 공업 주식회사T0543
우리딘시그마-알드리치U3750-25G
야탈라제Takara Bio Inc.T017
1610710 주식회사0000094147의 시료 원심 분리에 사용됩니다의 준비에 사용됩니다.에서 분자량 마커로 사용1610301

참고문헌

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