이 프로토콜은 셀 내의 세포 전체 구획 별 레독스 상태의 평가를 설명합니다. 레독스에 민감한 형광 프로브는 그대로 있는 세포에서 편리한 비율 측정 분석을 허용합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
세포 내 산화/감소 균형을 측정하면 유기체의 생리학적 및/또는 병리학적 레독 상태에 대한 개요를 제공합니다. 티올은 감소된 디티올 과 산화 된 이황화물 비율을 통해 세포의 레독스 상태를 조명하는 데 특히 중요합니다. 엔지니어링 된 시스테인 함유 형광 단백질은 레독스에 민감한 바이오 센서의 새로운 시대를 열어주습니다. 그 중 하나인 레독스에 민감한 녹색 형광 단백질(roGFP)은 아데노바이러스 트랜스듀싱을 통해 세포에 쉽게 도입될 수 있어 세포 과정을 방해하지 않고 세포구획의 레독스 상태를 평가할 수 있습니다. 감소된 시스테인과 roGFP의 산화 된 낭포진은 각각 488 nm와 405 nm에서 흥분 최대가 있으며 525 nm에서 방출됩니다. 이러한 감소 및 산화 형태의 비율을 평가하면 셀 내의 레독스 균형을 편리하게 계산할 수 있습니다. 이 방법 문서에서는, 불멸의 인간 삼중 음성 유방암 세포 (MDA-MB-231)는 살아있는 세포 내의 레독스 상태를 평가하기 위하여 이용되었다. 프로토콜 단계는 세포성 roGFP를 발현하기 위하여 아데노바이러스를 가진 MDA-MB-231 세포주 변환, H2O2를가진 처리 및 유동 세포질 및 형광 현미경 검사법을 가진 시스테인 및 cystine 비율의 평가를 포함합니다.
서론
산화 스트레스는 1985년 헬무트 시에 의해 "이전의 항산화제 균형에 대한교란"1로정의되었으며, 유기체 의 질병, 영양 및 노화 별 레독 스 상태를 얻기 위한 과다한 연구가 수행되었다1,,2,,3. 그 이후로 산화 스트레스에 대한 이해가 더 넓어지고 있습니다. 질병 및/또는 노화에 대한 항산화제를 사용하는 가설을 테스트하는 것은 산화 스트레스가 해를 끼칠 뿐만 아니라 세포에 다른 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 과학자들은 자유 래디칼이 신호 변환2에중요한 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 모든 연구는 거대 분자의 감소 산화 (redox) 비율의 변화를 결정하는 중요성을 강화합니다. 효소 활성, 항산화제 및/또는 산화물 및 산화 제품은 다양한 방법으로 평가될 수 있습니다. 이들 중, 티올 산화를 결정하는 방법은 틀림없이 세포에 있는 산화방지제와 청록산제 사이 균형에 보고하기 때문에, 유기체4. 구체적으로, 글루타티온(GSH)/글루타티온 디설파이드(GSSG) 및/또는 시스테인(CyS)/....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고: 이 프로토콜은 70%-80% 컨실릭 MDA-MB-231 셀에 최적화되었습니다. 다른 세포주를 위해, 세포의 수 및 감염의 복합성 (MOI)는 재최적화되어야 합니다.
1. 세포 준비 (1 일)
- MDA-MB-231 세포주를 75cm2 플라스크로 유지하여 10mL의 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)를 37°C에서 37°C로 보충하여 5%CO2 가습대기 대기시.
참고: DMEM은 10% FBS, 37°C, 및 5%CO2 가습대기로 전체 프로토콜 전반에 걸쳐 모든 부착 및 치료 인큐베이션에 사용됩니다. - 실험을 위해 MDA-MB-231 세포를 준비한다.
- 플라스크 내에서 배지를 흡인시키고, 2분 동안 0.25%의 트립신-EDTA 용액의 2mL로 세포를 분리하고, 6mL의 완전한 매체(10%의 FBS를 가진 DMEM)로 트립신 활성을 비활성화한다. 원심 분리는 5 분 동안 150 x g에서 세포를 흡인하고 완전한 배지의 5 mL에서 세포를 일시 중단합니다.
- 동일한 볼륨 셀 서스펜션과 0.4% 트라이팬 블루를 혼합합니다. 이 혼합물의 10 μL을 가지고 자동화 된 세포 카운터로 세포를 계산합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
CyS/CySS의 레독스 상태는 변환된 roGFP로 쉽게 분석됩니다. 형광 프로브는 감소된 형태와 산화 형태 사이의 비율을 정량화한다(각성 파장 488nm 및 405 nm, 각각). 형광 데이터는 유동 세포측정및 현미경 검사법 모두에 의해 얻어질 수 있다.
많은 수의 세포가 유동 세포측정을 사용하여 일관되고 편리하게 습득할 수 있습니다. 분석은 3개의 주요 단계로 이루어져 있습니다: 1) FSC 영역 필터를 가진 관심있는 세포 집단을선택(도 1A); 2) 전 488/em과 함께 roGFP 표현 세포를 게이트. 선택적 밴드패스필터(도 1B)가있는 525nm; 및 3) 전 405 nm/em을 가진 roGFP 발현 세포로부터 산화된 roGFP 함유 세포를 게이트. 525 nm 밴드 패스 필터(그림 1C).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
유기체의 티올/이황화물 균형은 세포의 레독스 상태를 반영한다. 살아있는 유기체는 글루타티온, 시스테인, 단백질 티올 및 저분자-중량 티올을 가지고 있으며, 모두 산화 수준에 의해 영향을 받고 세포4의레독스 상태를 에코한다. 엔지니어링 된 roGFP는 CyS 잔류물7을통해 티올 / 이황화물 균형의 파괴적 정량화를 허용합니다. roGFP의 비율 메트릭 특성은 포유류 세포에 대한 신뢰할 수 있는 레독스 측정을 제공합니다. roGFP는 형질 전환 방법 및/또는 트랜스듀션 벡터를 통해 세포에 쉽게 도입될 수 있지만, 아데노바이러스 형질은 더 높은 효율을 갖는다.
세포의 레독스 상태는 세포 환경(예를 들어, 세포의 병합 및 매체의 부피)에 의해 쉽게 영향을 받습니다. 이 프로토콜의 경우, 최적화된 세포 종자 결합은 cm2당15,000개의 세포와 함께 60%-70%로 결정되었다. 분석 당.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
세포에서 사이토솔 특이적 roGFP를 표현하기 위한 구성 및 재조합 아데노바이러스는 각각 폴 T. 슈매커, 박사, 프레이버그 의과 대학, 노스웨스턴 대학 및 ViraQuest Inc.의 실험실에서 생성되었다. 이 연구는 NIH 국립 생물 의학 연구 우수성 센터 (COBRE NIGMS), 국립 일반 의료 시스템 약리학 및 독성학 교육 프로그램 보조금 T32 GM106999를 통해, 암 치료 보조금 P20GM109005에 호스트 반응의 연구 센터에 의해 지원되었다, UAMS 재단/의료 연구 인다우먼트 어워드 AWD00053956, UAMS 연말 총리 상 AWD00053484. 유동 세포측정 핵심 시설은 COBRE NIGMS를 통해 P20GM103625를 부여하는 미생물 병리학 및 호스트 염증 반응 센터에 의해 부분적으로 지원되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. ATA는 터키 과학 기술 연구 위원회 (TUBITAK) 2214-A 장학금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | 세포 배양 |
| 4웰 챔버 슬라이드 | Thermo Scientific | 154526 | 형광 이미징을 위한 세포 시딩 재료 |
| 세포 여과기 캡이 있는 5ml 튜브 | Falcon | 352235 | 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁 튜브 |
| 6웰 플레이트 | Corning | 353046 | 유세포 분석을 위한 세포 파스딩 재료 |
| 15ml 원뿔형 튜브 | MidSci | C15B | 세포 배양 |
| 75cm2 환기 캡 조직 배양 플라스크 | Corning | 4306414 | 세포 배양 |
| 아데노바이러스 세포질 특이적 roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP 구성 Schumaker 박사가 친절하게 제공한 |
| II, 유형 A2 안전 후드 캐비닛 | Thermo Scientific | 1300 시리즈 A2 | 세포 배양 |
| 백작 자동 세포 계수 | Invitrogen | C10227 | 세포 계수 |
| 백작 세포 계수기 챔버 슬라이드 | Invitrogen | C10283 | 세포 계수 |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | 세포 배양 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 세포 배양 |
| 여과된 피펫 팁, 멸균, 20 µ l | Fisherbrand | 02-717-161 | 세포 배양 |
| 여과 피펫 팁, 멸균, 1000 µ l | Fisherbrand | 02-717-166 | 세포 배양 |
| 유세포 분석기 | BD Biosciences | LSRFortessa | 기기 유세포 분석을 위한 FITC 및 BV510 대역통과 필터가 장착된 |
| 광 현미경 | 고급 현미경 그룹(AMG) | Evos FL | 형광 이미징 |
| 과산화수소 30% | Fisher Scientific | H325-100 | 양성 대조군 |
| Light Cube, 맞춤형 | 생명 과학 | CUB0037 | roGFP 발현 세포의 형광 이미징(예: 405nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | roGFP 발현 세포의 형광 이미징(예: 488nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | 인간 상피 유방암 세포주 |
| 마이크로 원심분리기 튜브, 2ml | Grenier Bio-One | 623201 | 세포 배양 |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | 세포 배양 |
| 피펫 컨트롤러 | Drummond | Hood Mate 모델 360 | 세포 배양 |
| 혈청학 피펫, 1ml | Fisherbrand | 13-678-11B | 세포 배양 |
| 혈청학 피펫, 5ml | Fisherbrand | 13-678-11D | 세포 배양 |
| 혈청학 피펫, 10ml | Fisherbrand | 13-678-11E | 세포 배양 |
| 조직 배양 인큐베이터 | Thermo Scientific | HERACell 150i | 세포 배양용 CO2 인큐베이터 |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | 세포 계수 |
참고문헌
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).
- Pizzino, G., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
