세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

Summary

이 프로토콜은 셀 내의 세포 전체 구획 별 레독스 상태의 평가를 설명합니다. 레독스에 민감한 형광 프로브는 그대로 있는 세포에서 편리한 비율 측정 분석을 허용합니다.

Abstract

세포 내 산화/감소 균형을 측정하면 유기체의 생리학적 및/또는 병리학적 레독 상태에 대한 개요를 제공합니다. 티올은 감소된 디티올 과 산화 된 이황화물 비율을 통해 세포의 레독스 상태를 조명하는 데 특히 중요합니다. 엔지니어링 된 시스테인 함유 형광 단백질은 레독스에 민감한 바이오 센서의 새로운 시대를 열어주습니다. 그 중 하나인 레독스에 민감한 녹색 형광 단백질(roGFP)은 아데노바이러스 트랜스듀싱을 통해 세포에 쉽게 도입될 수 있어 세포 과정을 방해하지 않고 세포구획의 레독스 상태를 평가할 수 있습니다. 감소된 시스테인과 roGFP의 산화 된 낭포진은 각각 488 nm와 405 nm에서 흥분 최대가 있으며 525 nm에서 방출됩니다. 이러한 감소 및 산화 형태의 비율을 평가하면 셀 내의 레독스 균형을 편리하게 계산할 수 있습니다. 이 방법 문서에서는, 불멸의 인간 삼중 음성 유방암 세포 (MDA-MB-231)는 살아있는 세포 내의 레독스 상태를 평가하기 위하여 이용되었다. 프로토콜 단계는 세포성 roGFP를 발현하기 위하여 아데노바이러스를 가진 MDA-MB-231 세포주 변환, H₂O_2를가진 처리 및 유동 세포질 및 형광 현미경 검사법을 가진 시스테인 및 cystine 비율의 평가를 포함합니다.

Introduction

산화 스트레스는 1985년 헬무트 시에 의해 "이전의 항산화제 균형에 대한^교란"1로정의되었으며, 유기체 의 질병, 영양 및 노화 별 레독 스 상태를 얻기 위한 과다한 연구가 수행되었다^1,,2,,3. 그 이후로 산화 스트레스에 대한 이해가 더 넓어지고 있습니다. 질병 및/또는 노화에 대한 항산화제를 사용하는 가설을 테스트하는 것은 산화 스트레스가 해를 끼칠 뿐만 아니라 세포에 다른 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 과학자들은 자유 래디칼이 신호 변환^2에중요한 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 모든 연구는 거대 분자의 감소 산화 (redox) 비율의 변화를 결정하는 중요성을 강화합니다. 효소 활성, 항산화제 및/또는 산화물 및 산화 제품은 다양한 방법으로 평가될 수 있습니다. 이들 중, 티올 산화를 결정하는 방법은 틀림없이 세포에 있는 산화방지제와 청록산제 사이 균형에 보고하기 때문에, 유기체^4. 구체적으로, 글루타티온(GSH)/글루타티온 디설파이드(GSSG) 및/또는 시스테인(CyS)/시스테인(CySS)의 비율은 유기체^2의레독스 상태를 모니터링하기 위한 바이오마커로 사용된다.

프로옥시드와 항산화제 사이의 균형을 말하는 데 사용되는 방법은 주로 세포 내의 감소/산화 단백질 또는 작은 분자 의 수준에 의존합니다. 서양 얼룩 및 질량 분광법은 감소/산화 된 거대 분자 (단백질, 지질 등)의 비율을 광범위하게 평가하는 데 사용되며 GSH / GSSG 비율은 분광성^5로평가 될 수 있습니다. 이러한 방법의 일반적인 특징은 세포 리시스 및/또는 조직 균질화에 의한 시스템의 물리적 인 섭류입니다. 이 분석은 또한 다른 셀룰러 구획의 산화 상태를 측정할 필요가 있을 때 도전이 됩니다. 이러한 모든 혼란은 분석 환경에서 아티팩트를 유발합니다.

레독스에 민감한 형광 단백질은 세포 내 의 교란을 일으키지 않고 레독스 균형을 평가하기 위한 유리한 시대를 열었다^6. 그(것)들은 셀룰러 세포 기관 사이 상호 토크를 조사하기 위하여 구획 특정 활동 (예를 들면, 미토콘드리아및 cytosol의 redox 상태를 말하는)의 정량화를 허용하는 다른 세포내 구획을 표적으로 할 수 있습니다. 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 및 HyPeR 단백질은 마이어와 동료^6에의해 검토됩니다. 이러한 단백질 중, 레독스 에 민감한 GFP (roGFP)는 CyS (예: 488 nm/ em. 525 nm) 및 CySS (예. 405 nm / 525 nm) 잔류물의 다른 형광 판독으로 인해 독특하며, 이는 다른 홍옥에 민감한 단백질과는 달리 비율 메트릭 분석을^{7,허용합니다.} 비율 측정 출력은 표현 수준, 검출 민감도 및 광표백⁸사이의 차이에 균형을 맞추기 때문에 유용합니다. 세포의 세포 형 구획 (사이토솔, 미토콘드리아, 핵) 또는 상이한 유기체 (박테리아 및 포유류 세포)는 roGFP^7,,9,,10을수정하여 표적으로 할 수 있다.

roGFP 의 소법은 특히 실시간 시각화 실험을 위해 형광 이미징 기술을 사용하여 수행됩니다. roGFP의 흐름 세포 측정 분석은 미리 정해진 시간 점을 가진 실험에도 가능합니다. 현재 문서는 형광 현미경 검사법과 유동 세포측정법의 사용이 모두 설명되어 아데노바이러스 형질 전염을 통해 roGFP (cytosol 표적)를 과발현하는 포유류 세포에서 백강체 상태의 비율 메트릭 평가를 수행합니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜은 70%-80% 컨실릭 MDA-MB-231 셀에 최적화되었습니다. 다른 세포주를 위해, 세포의 수 및 감염의 복합성 (MOI)는 재최적화되어야 합니다.

1. 세포 준비 (1 일)

1. MDA-MB-231 세포주를 75cm² 플라스크로 유지하여 10mL의 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)를 37°C에서 37°C로 보충하여 5%_CO2 가습대기 대기시.
   참고: DMEM은 10% FBS, 37°C, 및 5%_CO2 가습대기로 전체 프로토콜 전반에 걸쳐 모든 부착 및 치료 인큐베이션에 사용됩니다.
2. 실험을 위해 MDA-MB-231 세포를 준비한다.
   1. 플라스크 내에서 배지를 흡인시키고, 2분 동안 0.25%의 트립신-EDTA 용액의 2mL로 세포를 분리하고, 6mL의 완전한 매체(10%의 FBS를 가진 DMEM)로 트립신 활성을 비활성화한다. 원심 분리는 5 분 동안 150 x g에서 세포를 흡인하고 완전한 배지의 5 mL에서 세포를 일시 중단합니다.
   2. 동일한 볼륨 셀 서스펜션과 0.4% 트라이팬 블루를 혼합합니다. 이 혼합물의 10 μL을 가지고 자동화 된 세포 카운터로 세포를 계산합니다.
      참고: 쿨터 카운터 또는 혈전계도 세포 계수에 사용할 수 있습니다.
   3. 혈류 세포 분석 및 1mL의 중간 1mL에서 150,000개의 세포를 잘 파종하기 위해 세포를 6웰 플레이트로 시드한다. 셀 부착을 위해 16h를 기다립니다.
   4. 세포를 형광 이미징을 위한 4웰 챔버 슬라이드로 시드하고 우물당 0.5mL의 배지25,000세포를 시드한다. 셀 부착을 위해 16h를 기다립니다.
      참고 : 치료 우물 뿐만 아니라 종자 제어 우물. 대조군 우물 중 하나를 사용하여 세포 수를 결정합니다(선택 사항: 세포에 대한 부착 기간이 두 배시간보다 짧은 경우, 세포 수는 파종 밀도와 동일하다고 가정할 수 있고, 다른 하나는 비감염 대조군(0 MOI)을 위해 한다.

2. 아데노바이러스 로GFP 전관 (2일차, 3일)

주의: 아데노바이러스는 질병을 일으킬 수 있습니다. 세포를 변환하는 동안 여과 된 팁을 사용하고 팁, 파스퇴르 파이펫 및 10 % 표백제로 미세 원심 분리 튜브를 제거하십시오.

참고: 이 프로토콜은 사이토솔 특이적 roGFP로 입증되었지만 다른 셀룰러 구획(예: 미토콘드리아 또는 미토콘드리아 막 간 공간)은 이 동일한 프로토콜을 대상으로 할 수 있습니다.

1. MDA-MB-231 세포주(표 1)에 대해 각 MOI 값에 필요한 아데노바이러스(mL)의 부피를 계산하여 가장 높은 트랜스듀션 효율을 얻기 위해 MOI에 대한 용량 반응 곡선을 생성한다(표 1):
   
   참고: mL당 플라크 성형 장치(PFU)로 표현되는 아데노바이러스 주식의 각 배치의 기능적 티터가 당사에서 제공한다. 트랜스포션을 위한 최적의 MOI는 세포 유형마다 다릅니다. 대부분의 포유류 세포의 경우 최적의 MOI 범위는 10에서 300 사이입니다. 세포 반응에 따르면, MOI 값을 다시 계산해야 한다(예를 들어, 세포가 세포 독성 반응을 갖는 경우 MOI 범위를 줄여야 하며, 세포가 트랜스포션 효율이 낮으면 범위가 증가해야 한다).
2. 신뢰할 수 있는 파이펫팅을 위해 세포 배양 배지(10% FBS를 가진 DMEM)를 갖춘 6 x^{10 10} PFU/mL 아데노바이러스 로GFP 용액의 1:100 희석을 확인하십시오.
3. 파이펫 및 0.0125 mL(12.5 μL), 0.025 mL(25 μL), 아데노바이러스 로GFP 희석의 0.05 mL(50 μL)를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가하여 각각 50, 100, 200 및 20사이클로Table 1구성된 150,000개의 세포를 변환합니다.
4. 파이펫및 4챔버 슬라이드 웰에 아데노바이러스 로GFP 희석의 0.0042mL(4.2 μL)를 추가하여 형광 이미징을 위한 100MOI를 가진 25,000개의 세포를 트랜스듀합니다(표1).
   참고: 아데노바이러스 로GFP 구조와 셀 간의 가장 높은 상호 작용을 보장하기 위해 우물에서 최소한의 배지를 사용해야 합니다. 혈청의 높은 수준이 일부 세포 유형의 트랜스포션 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 배양 배지의 혈청 함량은 상이한 세포주에 대해 감소될 필요가 있다.
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Results

CyS/CySS의 레독스 상태는 변환된 roGFP로 쉽게 분석됩니다. 형광 프로브는 감소된 형태와 산화 형태 사이의 비율을 정량화한다(각성 파장 488nm 및 405 nm, 각각). 형광 데이터는 유동 세포측정및 현미경 검사법 모두에 의해 얻어질 수 있다.

많은 수의 세포가 유동 세포측정을 사용하여 일관되고 편리하게 습득할 수 있습니다. 분석은 3개의 주요 단계로 이루어져 있습니다: 1) FSC 영역 필터를 가진 관심있는 세포 집단을선택(도 1A); 2) 전 488/em과 함께 roGFP 표현 세포를 게이트. 선택적 밴드패스필터(도 1B)가있는 525nm; 및 3) 전 405 nm/em을 가진 roGFP 발현 세포로부터 산화된 roGFP 함유 세포를 게이트. 525 nm 밴드 패스 필터(그림 1C).

Discussion

유기체의 티올/이황화물 균형은 세포의 레독스 상태를 반영한다. 살아있는 유기체는 글루타티온, 시스테인, 단백질 티올 및 저분자-중량 티올을 가지고 있으며, 모두 산화 수준에 의해 영향을 받고 세포^4의레독스 상태를 에코한다. 엔지니어링 된 roGFP는 CyS 잔류물^7을통해 티올 / 이황화물 균형의 파괴적 정량화를 허용합니다. roGFP의 비율 메트릭 특성은 포유류 세포에 대한 신뢰할 수 있는 레독스 측정을 제공합니다. roGFP는 형질 전환 방법 및/또는 트랜스듀션 벡터를 통해 세포에 쉽게 도입될 수 있지만, 아데노바이러스 형질은 더 높은 효율을 갖는다.

세포의 레독스 상태는 세포 환경(예를 들어, 세포의 병합 및 매체의 부피)에 의해 쉽게 영향을 받습니다. 이 프로토콜의 경우, 최적화된 세포 종자 결합은 cm^2당15,000개의 세포와 함께 60%-70%로 결정되었다. 분석 당...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	세포 배양
4웰 챔버 슬라이드	Thermo Scientific	154526	형광 이미징을 위한 세포 시딩 재료
세포 여과기 캡이 있는 5ml 튜브	Falcon	352235	유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁 튜브
6웰 플레이트	Corning	353046	유세포 분석을 위한 세포 파스딩 재료
15ml 원뿔형 튜브	MidSci	C15B	세포 배양
75cm2 환기 캡 조직 배양 플라스크	Corning	4306414	세포 배양
아데노바이러스 세포질 특이적 roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP 구성 Schumaker 박사가 친절하게 제공한
II, 유형 A2 안전 후드 캐비닛	Thermo Scientific	1300 시리즈 A2	세포 배양
백작 자동 세포 계수	Invitrogen	C10227	세포 계수
백작 세포 계수기 챔버 슬라이드	Invitrogen	C10283	세포 계수
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	세포 배양
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	세포 배양
여과된 피펫 팁, 멸균, 20 µ l	Fisherbrand	02-717-161	세포 배양
여과 피펫 팁, 멸균, 1000 µ l	Fisherbrand	02-717-166	세포 배양
유세포 분석기	BD Biosciences	LSRFortessa	기기 유세포 분석을 위한 FITC 및 BV510 대역통과 필터가 장착된
광 현미경	고급 현미경 그룹(AMG)	Evos FL	형광 이미징
과산화수소 30%	Fisher Scientific	H325-100	양성 대조군
Light Cube, 맞춤형	생명 과학	CUB0037	roGFP 발현 세포의 형광 이미징(예: 405nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	roGFP 발현 세포의 형광 이미징(예: 488nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	인간 상피 유방암 세포주
마이크로 원심분리기 튜브, 2ml	Grenier Bio-One	623201	세포 배양
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	세포 배양
피펫 컨트롤러	Drummond	Hood Mate 모델 360	세포 배양
혈청학 피펫, 1ml	Fisherbrand	13-678-11B	세포 배양
혈청학 피펫, 5ml	Fisherbrand	13-678-11D	세포 배양
혈청학 피펫, 10ml	Fisherbrand	13-678-11E	세포 배양
조직 배양 인큐베이터	Thermo Scientific	HERACell 150i	세포 배양용 CO2 인큐베이터
Trypan blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	세포 계수