이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.
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이 논문에서
요약
초록
화상 진찰 베타 세포는 아일렛 이식을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 베타 세포 생물학의 기록을 위한 다른 화상 진찰 플랫폼이 개발되고 생체 내에서이용되고 있더라도, 단하나 세포 분해능 및 연속적인 세로 기록을 허용하는 측면에서 제한됩니다. 각막의 투명성 때문에 마우스내 눈의 전방 챔버(ACE)는 인간 및 마우스 췌장 세포 생물학을 연구하기에 적합합니다. 다음은 이 접근법이 개별 인간 적인 아슬렛 이식의 접목 및 개조의 연속적인 세로 기록을 수행하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 설명입니다. 인간 적인 아슬렛 이식편은 NOD를 사용하여 ACE에 삽입됩니다. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스를 받는 사람으로. 이것은 기증자 세포 대 수령인의 확장및 접목의 캡슐화 및 혈관화를 승진시키는 수신자 세포의 기여의 조사를 허용합니다. 또한, 배분부 또는 분할된 혈관분기 및 아슬레 캡슐 형성 수용자 세포의 이미지 분석 및 정량화를 위한 단계별 접근법이 설명된다.
서론
당뇨병 mellitus는 종종 인슐린 저항을 동반췌형 연하 베타 세포의 손실 또는 기능 장애에서 불충분 한 인슐린 생산의 결과로 혈당의 높은 수준을 특징으로 하는 대사 질환의 그룹을 설명합니다. 타입-1 (T1D) 및 타입-2 당뇨병 (T2D)는 베타 세포의 진보적인 기능 장애가 질병 발달을 일으키는 원인이 되는 복잡한 질병입니다. T1D는 베타 세포에 대한 자가 면역 공격에 의해 침전되고, T2D는 신진 대사 요인에 의해 구동되는 것으로 간주되는 반면, 저급 전신 염증1의증가 증거이기는하지만. 기증자 인간 섬, 특히 T1D 환자에게 이식은 생리적 혈당 조절을 제공할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 그러나, 조직 기증자와 가난한 축 소 이식의 부족은 주류 치료 옵션이 될 수있는 islet 이식을 방지하고있다. 저산소, 염증성, 면역원성 숙주 환경2,,3으로인해 즉각적인 이식 후 기간(24-48h)에서 기능성 축약 이식의 상당 부분이 손실된다. 섬 생존의 개선을 위한 개입 방법의 효율성을 평가하기 위해, 이러한 이식의 지속적인 모니터링이 필요하다.
이식 후 이식된 인간 췌장암의 운명을 이미지화하고 추....
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프로토콜
스웨덴 룬드의 지역 윤리위원회는 인간과 관련된 연구의 윤리적 검토에 관한 법에 따라 연구를 승인했습니다. 동물 실험은 스웨덴동물 실험윤리에 따라 엄격하게 수행되었으며 말뫼와 룬드의 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 6~8주된 면역결핍 NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/ - (NOD. 로사 토마토. Rag2Rag2-/-받는 마우스는 인간섬(10)의이식을 위한 수령인으로 사용되었다.
1. 이식을 위한 아일렛 준비
- CMRL 1066의 문화 인간 섬은 10m HEPES로 보충, 2 mM L-글루타민, 50 μg/mL 젠타마이신, 0.25 μg/mL 균류존, 20 μg/mL 시프록스플로X락사신, 10mMM 니코티나미드(NIC), 10% 열활성 인간 혈청(NIC), 그리고 10% 열활성화 인간 혈청은 5%의 CO2 및 후압공기로12°
참고 : 섬은 외신 조직이 없어야하며 문화에서 서로를 만지지 않아야합니다. 엑소크리엔 조직은 반투명으로 나타납니다.
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결과
표지되지 않은 인간 섬은 8주된 여성 NOD의 ACE로 이식되었다. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/ -(NOD. 로사토마토. Rag2-/−)받는 쥐. 인간 조직 거부를 방지하기 위해 면역형 Rag2 녹아웃 마우스를 수령인으로 선택하였다. 이러한 형질전환 마우스에서, 모든 세포와 조직은 수령인과 기증자 조직의 명확한 식별을 허용하는 막 표적 토마토 형광 단백질 (mT)을 표현했습니다. 고해상도 2-광자 현미경 검사법에 의한 islet 이식체의 반복된 화상 진찰은 이식 과정 및 그들의 동적 이동 패턴에 관련시킨 mT+ 수신자 세포를 확인할 수 있었습니다.
일반적으로, 인간 섬의 이식 설정은 수신자 마우스의ACE(도 1a)의 아세트(도 1a)는섬 모양 및.......
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토론
수급자와 기증자 조직의 개입을 관찰하여 인간 췌장 세포 이식 과정을 연구하는 방법이 제시된다. 면역 결핍 마우스 눈의 전방 챔버에 인간 섬을 이식 하는 최소한의 침습 수술 후, 마우스 는 수술 후 분 이내에 신속 하 게 복구. 절차는 한쪽 눈에 수행됩니다. 일반적으로, 5-7 일 이후 이식 후 각막은 충분히 인트인트 이미징을 수행 하기 위해 치유.
이 프로토콜에서는 인간 적인 아슬렛 이식의 품질이 중요합니다. 인간 적인 아슬렛 품질 및 따라서 이식 결과 기증자의 나이에 따라 다를 수 있습니다., BMI, 그리고 격리 과정, 도착 전후 에 있는 islet 문화의 시간 뿐만 아니라. 임상 이식 및 연구 목적으로 승인된 장기 기증자 췌장에서 처리된 인간 섬은 기증자의 동의하에 사용되었습니다. 그(것)들은 다른 곳에 기술된 췌장 소화 및 islet 정제의 과정 후에 얻어졌다12. 고립 된 뮤린 섬과 유사하게, 이들 섬은 허혈, 기계적 스트레스,.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 스웨덴 연구 위원회, 전략적 연구 지역 외디아브, Dnr 2009-1039, 전략 연구 Dnr IRC15-0067, 룬드의 왕립 물리 학회, 당뇨병퓌르분데트 및 바르니프뢰르분데트에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 무감각 기계(예: 마취 장치 U-400 | Agnthos | 8323001 | 수술 및 이미징 유도 챔버 중 이소플루란 마취에 사용됨 |
| 1.4 L | Agntho | 8329002 | 튜브를 통해 U-400 |
| 가스 라우팅 스위치 | Agnthos | 8433005 | 튜브를 통해 U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | 인간 섬 이식편에서 혈관을 이미지화하는 데 사용되는 주입용 이미징 에이전트 |
| 흡인기 튜브 어셈블리 | Sigma | A5177-5EA | 는 수동 섬 채취를 위해 당겨진 모세관 피펫과 연결 |
| 부프레노르핀(Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | 유체, 통증 완화용 |
| 모세관 피펫 | VWR | 321242C | 흡인기 튜브 어셈블리 |
| Dextran-Texas Red (TR), 주입용 70kDa | Invitrogen | D1830 | 이미징 에이전트 |
| 눈 캐뉼라, 무딘 끝, 25G | BVI Visitec/BD | BD585107 | Tapered Hydrode linetor [Blumenthal]로 맞춤 제작, 치수: 0.5 x 22mm(25G x 7/8in)(45?), 팁이 30G( 0.3mm) |
| 아이 젤 | Novartis | Viscotears, Carbomer 2 mg / g | |
| Hamilton 주사기 0.5 ml, 모델 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | 섬 주입 용 플런저 타입 가스 밀폐 주사기 |
| < 강력>헤드 홀더 < / 강력 > | |||
| 헤드 홀딩 어댑터 | Narishige | SG-4N-S | 금속판에 조립 |
| - 방독면 | Narishige | GM-4-S-UST-2 | |
| 솔리드 유니버설 조인트 | Narishige | UST-2 | 금속판에 조립 |
| -헤드 홀더 조립 | |||
| -Dumont #5, UST-2 | Agnthos | 0207-5TI-PS 또는 0208-5-PS | 맞춤형) |
| 가열 패드, | 입체식 플랫폼에 테이프로 붙인 | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN 인간 섬용 Biomedicals | 세포 배양 배지 | |
| -HEPES | GIBCO BRL-L | ||
| -글루타민 | GIBCO | ||
| GIBCO BRL-Fungizone | |||
| GIBCO BRL | |||
| -Ciproxfloxacin | 바이엘 헬스케어 AG- | ||
| 니코틴아미드 | 시그마 | ||
| 이미지 분석 소프트웨어 | Bitplane | Imaris 9 | |
| 이미지 인수 소프트웨어 | Zeiss | ZEN 2010 | |
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| /50 (GFP) | |||
| /75 (tomato) | Chroma | ||
| -메인 빔 스플리터 T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | 이색성 거울은 690nm 이상을 투과하고 440-650nm 크기를 반사합니다. 25.5 x 36 x 1mm |
| 폴리에틸렌 튜브(0.38mm ID, 1.09mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | Hamilton 주사기 및 눈 캐뉼라 |
| 실체 현미경 | Nikon | 모델 SMZ645, 섬 따기 | |
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| -DS-Fi1 컬러 디지털 카메라(5MP) | Nikon | ||
| 주사기 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | 부프레노르핀 주입용, 27G 바늘 |
| 수술 테이프 | 3M |
참고문헌
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014,....
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