현장 별 DNA 분열을 위한 병렬 높은 처리량 단 분자 운동 분석

요약

단일 분자 수준에서 DNA의 부위 별 분열을 측정하는 매우 병렬적인 방법이 기재된다. 이 프로토콜은 제한 엔도니올리스 NdeI를 사용하는 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 사이트별 DNA 분열의 결과를 초래하는 모든 과정을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다.

초록

사이트별 DNA 분열(SSDC)은 많은 세포 과정의 핵심 단계이며 유전자 편집에 매우 중요합니다. 이 작품은 많은 단일 DNA 분자에서 SSDC를 동시에 측정할 수 있는 운동 분석을 설명합니다. 비드 테더드 기판 DNA는 각각 표적 서열의 단일 복사본을 포함하는 미세 유체 흐름 채널에서 제조된다. 외부 자석은 파라자성 구슬에 약한 힘을 적용합니다. 최대 1,000개의 개별 DN의 무결성은 넓은 분야의 낮은 배율 목표를 사용하여 암필드 이미징 에서 마이크로비드를 시각화하여 모니터링할 수 있습니다. 제한 엔도니엔탈리스의 주입, NdeI, 분열 반응을 시작합니다. 비디오 현미경 검사는 관련 비드가 목표의 초점 평면에서 위아래로 이동하는 프레임을 관찰하여 각 DNA 분열의 정확한 순간을 기록하는 데 사용됩니다. 프레임별 비드 카운팅은 반응을 정량화하고 지수핏으로 반응 속도를 결정합니다. 이 방법을 사용하면 단일 실험에서 단일 분자 SSDC 반응에 대한 정량적 및 통계적으로 유의한 데이터를 수집할 수 있습니다.

서론

사이트별 DNA 분열(SSDC)은 많은 게놈 트랜잭션의 핵심 단계이다. 예를 들어, 세균 제한 수정(RM)¹ 및 CRISPR² 시스템은 특정 서열에서 외국 DNA를 인식하고 c떠나서 파지 및 플라스미드에 의한 공격으로부터 세포를 보호합니다. II형 RM에서, 제한 엔도니션리스(REs)는 단백질-핵산 상호작용^3을통해 짧은 4-8염기쌍(bp) 서열을 인식한다. Cas9과 같은 CRISPR 관련 엔도누리스는 crRNA가 엔도니클리스^4에바인딩된 대상 사이트의 혼성화를 통해 사이트에 바인딩됩니다. 사이트별 이중 좌초 휴식(DSBs)의 생성은 또한 많은 DNA 재조합 이벤트^5의첫 번째 단계이다. 예를 들어, V(D)J 재조합에 의해 생성된 항원 결합 영역의 다양성은 특정 표적 부위^6의인식 및 분열을 필요로 한다. 일부 트랜스포슨은 7뿐만^아니라특정 DNA 서열을 표적으로 하는 것으로 알려져 있다. 당연히 Cas9와 같은 이러한 공정에 관여하는 많은 사이트 별 뉴클레아제는 유전자 편집 기술의 핵심 구성 요소입니....

프로토콜

1. 유동 셀 만들기

1. 커버립 세척
   1. 커버를 염색 항아리에 넣고 에탄올 (EtOH)으로 초음파 처리한 다음 1 M KOH (각 30 분)로 초음파 처리합니다. EtOH에서 KOH 강수량을 피하기 위해 세척 사이에 ddH₂O로 철저히 헹구십시오.
   2. EtOH와 KOH 세척 단계는 총 4개의 세척(EtOH 2개, KOH 2개)에 대해 1x로 반복합니다. 염색 항아리에 ddH₂O에 청소 커버립을 저장합니다.
2. 깨끗한 면도기를 사용하여 로딩 및 출구 튜브 (8cm 길이)를 자르고 깨끗한 유리 슬라이드의 구멍에 삽입하십시오. 입구에 PE-20을 사용하고 PE-60을 콘센트에 사용하십시오. 에폭시 5 분 튜브를 확보하고 여분의 튜브를 잘라.
   참고: 유리 슬라이드는 2'' x 3'' x 1mm를 측정합니다. 구멍은 15mm 간격으로 쌍으로 드릴링됩니다. 각 쌍은 단일 채널의 양쪽 끝을 형성합니다. 더 작은 ID를 가진 튜브는 인렛에 사용되며, 이는 업스트림 데드 볼륨을 감소시키고 따라서 필요한 혼합시간(그림 1)을감소시킨다.
3. 줄을 서서 유리 슬라이드의 구멍 위로 잘라 채널 패턴이있는 미리 절단 양면 테이프를....

결과

이 기술을 이용하여, NdeI의 SSDC 비율은 마그네슘(2mM 및 4mMMM)의 2개의 상이한 농도에서 단백질 농도(0.25-4.00 U/mL)의 범위에 대해 측정되었다. 이러한 각 조건은 실험당 수백에서 1,000개의 Tetheed DNA와 함께 적어도 두 번 복제되었습니다. 그림 2는 실험 설계를 설명합니다. 그림 3에서는 데이터 수집 및 분석 세부 정보의 예제를 보여 주습니다. 도 4는 이 비율이 마그네슘의 두 농도에서 단백질 농도에 어떻게 의존하는지 보여줍니다. 단백질 농도가 충분히 낮을 때, 비율은 단백질에 비례하고 마그네슘과 무관하다는 것을 관찰할 수 있다. 충분히 높은 단백질 농도의 경우, 속도는 마그네슘에 의존하지만 단백질 농도와 는 무관합니다.

토론

프로토콜은 실험 중에 가닥 분리가 관찰되는 경우 모든 SSDC 시스템의 역학을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 분열의 검출은 테더드 비드의 분리를 관찰하여 영향을 받아 가닥 분리의 순간을 표시한다. 모든 앞단계는 골짜기를 감지하기 전에 발생합니다. 따라서 총 전송 시간만 기록됩니다.

유동 세포 커버슬립은 항체 단백질을 깨끗한 유리에 비특이적으로 흡착하여 기능화된다. 불충분하게 세척된 유리는 항체의 결합에 영향을 미칠 수 있습니다. 테더링에서 비드 밀도는 충분히 낮아서 구슬이 상호 작용하지 않도록해야 합니다. 부착점의 표면 밀도는 기능화 중에 항체의 농도에 의해 조절될 수 있다. 구슬의 총 수는 시야의 크기에 따라 다릅니다. 이 경우, 수백에서 1,000개의 묶인 구슬은 좋은 통계를 위해 충분했으며 비드 비드 상호 작용을 피했습니다. 비드 주입 하는 동안, 표면 테더링은 라이브 비디오를 통해 모니터링 되었다. 비드 주사는 예상 된 비드 수가 사이 있을 때 중지 되었다 500 그리.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5분 에폭시	Devcon	14250
안티 디곡시제닌 FAB 단편	Roche Diagnostics	11214667001
카메라 및 소프트웨어	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
데이터 분석 소프트웨어	Vernier Inc.
양면 테이프	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
에탄올 95%	VWR	89370-082
포워드 프라이머: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
이미지 분석 소프트웨어	National Institutes of Health	ImageJ
도립 현미경	Nikon	TE2000
나이프 프린터	실루엣
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne streptavidin beads	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI 효소	New England Biolabs	R0111S
PCR cleanup kit	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
폴리에틸렌 튜빙 PE-20	BD Intramedic	427406
폴리에틸렌 튜빙 PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
희토류 자석 0.5 "OD 0.25"ID	국내 수입	NSN0814
희토류 자석 0.75" OD 0.5" ID	국내 수입품	NSN0615
리버스 프라이머: 비오틴-TGACCATTAGATACATTTCGC	통합 DNA 기술	n/a
주사기 펌프	Kent Scientific	Genie Plus
β-소 우유	Sigma-Aldrich	C6905

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